组合型基质DHB/DHBH在MALDI质谱中对还原糖检测中的应用的制作方法

本发明涉及糖生化分析领域，具体涉及2，5-二羟基苯甲酰肼(dhbh)和2，5-二羟基苯甲酸(dhb)的组合型基质在maldi质谱中对还原糖检测中的应用。

背景技术：

糖类物质是生命体的第三类生物大分子，具有十分重要的生物学功能，主要用作能量来源，结构物质和功能性物质。糖类物质在诸多生命过程，如受精、生长、分化、发育、信号转导和免疫应答等方面起着重要的作用。糖基化修饰是最广泛、最复杂和重要的蛋白质翻译后修饰类型之一。50％以上的蛋白质会发生糖基化修饰，且越来越多的研究表明，糖基化修饰在疾病，特别是肿瘤的发生、发展和转移过程起着至关重要的作用。糖基化的异常与多种癌症发生密切相关，在以糖蛋白上糖链分子为研究对象的肿瘤标志物筛查中，建立高通量的定性定量检测方法具有重要的意义。

质谱是检测生物大分子的重要工具之一，其灵敏度高，样品用量少，可实现高通量检测。其中，maldi(matrix-assistedlaserdesorption/ionization，基质辅助激光解吸电离)质谱以其操作简单，图谱易解析，适用于复杂样品等特点被广泛用于低丰度内源性生物大分子的检测。然而，与其他生物大分子相比，糖类物质的电离化效率差，这在很大程度上限制了maldi技术对该类物质的灵敏分析。此外，在糖类物质检测时，常用的maldi基质dhb(2，5-二羟基苯甲酸)与分析物的共结晶不均匀，不利于定量分析。为提高糖类物质的电离化效率，在质谱检测前通常需对其进行衍生化处理。目前常用的衍生化方式主要包括：(1)甲基化法，该类反应针对羟基进行衍生，但衍生化试剂毒性较大，反应时间长，且难以保证羟基全部反应；(2)还原胺化；(3)成腙反应。还原胺化和成腙反应针对还原端半缩醛进行衍生，但衍生后需进行除盐和样品的纯化等步骤，过程繁琐，易造成样品的损失。可见，目前的衍生化方法仍存在不足，仍需改进。

为克服上述方法的局限性，有研究报道了还原糖的靶板衍生化策略，即样品在靶板上点样和衍生同步进行，在提高还原糖电离化效率的同时简化了操作步骤，兼容了maldi的高通量特性。已报到的还原糖靶板衍生化试剂和反应型基质主要有苯胺，3-氨基喹啉，氨基吡嗪，苯肼，2-肼基吡啶和吉拉德试剂t等。这里衍生化试剂指作为离子化标签可与还原糖进行反应，但本身作为基质的特性并不突出；而反应型基质则指既可作为离子化标签，同时具有优良的基质特性。严格意义上讲，苯胺，氨基吡嗪，苯肼，2-肼基吡啶和吉拉德试剂t都属于衍生化试剂。且吉拉德试剂t本身带有正电荷，过量的衍生化试剂必然会造成样品信号的抑制。3-氨基喹啉属于反应型基质，但其与还原糖反应相对较慢，且生成的席夫碱不稳定，限制了进一步广泛应用。

针对以上问题，设计和开发基于新型反应型基质的maldi靶板衍生化策略对实现还原糖高通量定性定量检测具有重要的价值。

技术实现要素：

本发明提供了dhbh(2，5-二羟基苯甲酰肼)作为新型反应型基质与dhb(2，5-二羟基苯甲酸)进行组合(dhb/dhbh)在还原糖检测中的应用。在maldi质谱中，基于dhb/dhbh的靶板衍生化策略可实现对还原糖高通量定性定量分析。dhbh具有酰肼基活性基团，作为反应型基质容易与还原糖半缩醛反应，可显著提高电离化效率；同时，dhbh作为基质可辅助糖类化合物的离子化，因此过量的dhbh无需分离。dhb为有机酸，可极大地催化成腙反应的进行；同时dhb作为糖类最常用的基质可促进其离子化。dhb/dhbh作为基质对酸性糖和中性糖的检测均适用。此外，有机酸(dhb)和有机碱(dhbh)组合使用可显著改善样品结晶均匀度，提高定量检测的准确性。本发明所述的dhbh结构式如式(1)所示：

所述的dhbh(2，5-二羟基苯甲酰肼)和dhb(2，5-二羟基苯甲酸)的组合型基质在maldi质谱中对还原糖检测中的应用。dhbh为反应型基质，具有酰肼基活性反应基团，可与还原糖半缩醛反应。dhb为催化剂，可显著促进dhbh与还原糖的成腙反应。dhb和dhbh均为糖类物质检测的高效基质。

所述的对还原糖检测为对还原糖进行高通量定性定量检测，所述的应用具体包括如下步骤：

1、试剂配制

配制dhb甲醇溶液，dhb为2，5-二羟基苯甲酸；以dhbh为溶质，dhbh为2，5-二羟基苯甲酰肼，dhb甲醇溶液为溶剂，配制dhb/dhbh混合基质甲醇溶液；配制待测还原糖的水溶液；

2、点样

分别取等体积的待测还原糖的水溶液和dhb/dhbh混合基质甲醇溶液，依次点在maldi抛光靶板的同一个点样孔，在maldi抛光靶板上直接进行混匀，得到点样后的靶板。

3、靶板衍生化反应

点样后的靶板在60～70℃下放置20～40min，样品点完全干燥，进行maldi质谱分析。

步骤1中，用于溶解基质的甲醇为分析纯或色谱级溶剂；

配制待测还原糖的水溶液的溶剂是超纯水或双蒸水；

所述的dhb/dhbh混合基质甲醇溶液中dhbh的浓度为0.05～0.15mol/l；

所述的dhb/dhbh混合基质甲醇溶液中dhb和dhbh的摩尔浓度比为1∶1～4∶1，进一步优选为3∶1；

步骤2中，待测还原糖的水溶液的点样体积为0.5～1.0μl；

dhb/dhbh混合基质溶液的点样体积为0.5～1.0μl；

待测还原糖的水溶液和dhb/dhbh混合基质溶液的混匀使用移液枪在maldi抛光靶板进行重复吸打10～20次；

步骤3中，点样后的靶板在65℃下放置30min，

所述的maldi质谱分析采用的检测模式为正离子模式或负离子模式；

所述的maldi质谱分析采用的检测模式为反射模式或线性模式。

本发明中所述的“maldi质谱”是指基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(maldi-tof-ms)，简称为maldi质谱。maldi的工作原理是用激光照射样品与基质形成的共结晶，基质从激光中吸收能量传递给样品分子而使其电离的过程。maldi是一种软电离技术，适用于生物大分子的测定。

本发明中所述的“反应型基质”是指作为常规基质辅助还原糖电离的同时，可与其还原端半缩醛发生快速反应，共价结合离子化标签，提高电离化效率。

本发明中所述的“靶板衍生化策略”是指在靶板上样品的点样和衍生同步进行，极大地简化了操作步骤，兼容了maldi的高通量特性。

本发明中所述的“酸性糖”是指带有羧基(-cooh)酸性取代基的还原糖，如含有唾液酸的糖分子。

本发明中所述的“中性糖”是指不含有酸性取代基的还原糖。

本发明中所述的衍生化效率＝衍生化产物峰强度/(衍生化产物峰强度+未衍生的峰强度)

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1、dhbh与dhb具有类似的骨架结构，对激光能量可进行有效吸收和传递，非常适用于作为糖类物质的基质。

2、dhb/dhbh混合基质中，dhbh为反应型基质，具有酰肼基活性反应基团，可与还原糖半缩醛反应。dhb为酸性催化剂，可显著促进dhbh与还原糖的成腙反应。dhb和dhbh均为糖类物质检测的高效基质，因此无需分离，适用于靶板衍生化对还原糖进行高通量检测。

3、由于衍生、催化和促进电离等多重效应，dhb/dhbh混合基质具有优良的基质特性，可显著提高还原糖的电离化效率和检测灵敏度，拓展还原性多糖的质量检测范围。

4、dhb和dhbh混合使用，属于有机酸和有机碱的结合，可明显改善样品结晶均匀度，提高定量检测的准确性和稳定性(rsd＜10％)。dhb/dhbh混合基质适用于酸性糖和中性糖的定性定量检测，中性糖在0.025～20pmol/μl范围具有良好的线性关系，r²＞0.995；酸性糖在0.2～20pmol/μl范围具有良好的线性关系，r²＞0.999。

附图说明

图1为dhbh的合成流程示意图；

图2为dhbh的nmr谱图及高分辨esi质谱图；图2adhbh的¹hnmr谱；图2bdhbh的¹³cnmr谱；图2cdhbh负离子模式高分辨esi质谱图；

图3为相同摩尔浓度dhb和dhbh的紫外吸收光谱图；

图4为检测麦芽六糖(g6)和麦芽糊精2000(d2000)的maldi质谱图；图4adhb作为基质检测g6的maldi质谱图；图4bdhbh作为基质检测g6的maldi质谱图；图4cdhb作为基质检测d2000的maldi质谱图；图4ddhbh作为基质检测d2000的maldi质谱图；

图5为基于dhb/dhbh的还原糖靶板衍生化原理图；

图6为有机酸基质与dhbh不同摩尔浓度比例对g6衍生化效率的影响；

图7为有机酸基质与dhbh不同摩尔浓度比例下的共结晶形态图；

图8为分别以dhb，chca/dhbh和dhb/dhbh为基质检测不同分子量还原糖的maldi质谱图；图8a检测麦芽三糖；图8b检测d2000；图8c检测d5000；图8d检测d12000；

图9为以dhb/dhbh为基质检测小分子碳水化合物的maldi质谱图；图9adhb为基质检测葡萄糖的maldi质谱图；图9b-9fdhb/dhbh为基质分别检测葡萄糖(9b)、蔗糖(9c)、蔗果三糖(9d)、蔗果四糖(9e)和蔗果五糖(9f)的maldi质谱图；

图10为分别以dhb，chca/dhbh和dhb/dhbh为基质检测g6时信号的重现性和对na2，na2f和a1检测的线性范围；图10a同一点样孔45次检测峰强度归一化图；图10b同一点样孔45次检测峰强度的rsd值；图10cdhbh为基质检测g6的maldi质谱成像图；图10d正离子模式检测na2的线性范围；图10e正离子模式检测na2f的线性范围；图10f负离子模式检测a1的线性范围；

图11为以dhb/dhbh为基质对血清蛋白还原性n-糖链进行靶板衍生化后的maldi质谱图；图11a正离子模式检测中性糖；图11b负离子模式检测酸性糖；图11c含量归一化后不同还原糖的疾病组和健康组比例分析。

具体实施方式

下面的实施例将对本发明予以进一步的说明，但本发明并不限于下述实施例。

下述实施例中所用的样品、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。下面通过具体实施例对本发明进行说明，但本发明并不局限于此。

下述实施例所用的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪的具体型号为ulraflextreme^tmmaldi-tof/tofms(brukerdaltonic，germany)，激光器采用355nm波长的nd：yag激光器。中性糖在正离子模式检测，酸性糖在负离子模式检测；分子量小于5000da的糖在反射模式检测，分子量大于5000da的糖在线性模式检测。正离子线性模式参数：加速电压，25.00kv；延迟引出电压，23.20kv；延迟引出时间，400ns；透镜电压，7.50kv；频率，2000hz。正离子反射模式参数：加速电压，25.00kv；延迟引出电压，22.30kv；延迟引出时间，130ns；反射器电压1，26.50kv；反射器电压2，13.50kv；透镜电压，7.50kv；频率，1000hz。负离子反射模式参数：加速电压，20.00kv；延迟引出电压，17.75kv；延迟引出时间，100ns；反射器电压1，21.10kv；反射器电压2，10.70kv；透镜电压，8.50kv；频率，2000hz。所用靶板为384抛光板(mtp384polishedsteel)，质谱数据分析采用brukerflexanalysis3.4软件。

下面简写词或外文术语的使用贯穿本发明：

dhbh2，5-二羟基苯甲酰肼；

dhb2，5-二羟基苯甲酸；

chcaα-氰基-4-羟基肉桂酸；

esi电喷雾质谱；

d麦芽糊精；

rsd相对标准偏差；

min分钟；

μl微升；

nmr核磁共振；

g6麦芽六糖；

meoh甲醇；

v伏特；

hz赫兹；

pa质子亲和势；

m.p.熔点；

lod检测限；

rt室温；

s/n信噪比；

normal健康组；

crc大肠癌组；

dmso二甲基亚砜；

hrms高分辨质谱；

2ab2-氨基苯甲酰胺；

pngasef肽n-糖苷酶f；

tfa三氟乙酸；

实施例1：dhbh的合成和表征

1、dhbh的合成

在圆底烧瓶中依次加入0.168g(0.001mol)的2，5-二羟基苯甲酸甲酯和10ml甲醇，室温搅拌5min混匀。然后缓慢滴加0.2ml(约0.004mol)85％的水合肼溶液，室温25℃搅拌过夜，直到原料反应完全生成棕色沉淀。

2、dhbh分离纯化

室温25℃下旋转蒸发除去过量的溶剂和水合肼，得粘稠固体。然后分别加入过量甲醇和1ml去离子水使产物复溶，使用旋转蒸发仪对其进行重结晶。控制温度为室温25℃，且减慢溶剂旋转蒸发速度，直到烧瓶中剩约3ml溶剂。将沉淀用体积百分数50％的甲醇水溶液洗涤3次，室温25℃下进行真空干燥，可得0.1g棕色粉末，即为dhbh。

3、dhbh的表征

dhbh的表征采用nmr、高分辨esi，紫外吸收光谱仪和熔点仪等。

实施例1中，图1为dhbh的合成流程示意图，合成和纯化过程需严格控制温度为室温25℃或低于室温25℃，防止副产物的生成。图2为dhbh的¹hnmr谱(2a)、¹³cnmr谱(2b)和高分辨esi负离子模式质谱图(2c)，结果如下：¹hnmr(600mhz，dmso)δ11.52(s，1h)，9.84(s，1h)，8.96(s，1h)，7.18(d，j＝2.6hz，1h)，6.83(dd，j＝8.7，2.5hz，1h)，6.72(d，j＝8.8hz，1h)，4.58(s，2h)；¹³cnmr(151mhz，dmso)δ167.39(s)，151.71(s)，149.24(s)，120.87(s)，117.62(s)，114.95(s)，112.94(s)；hrms-esi：167.0482[m-h]^-。谱图信号干净，且与其结构信息一一对应，可见通过本实施例中的分离纯化方法可获得高纯度的目标产物。图3为相同摩尔浓度dhb和dhbh的紫外吸收光谱图，dhbh与dhb的紫外吸收峰形相似，但dhbh的吸收强度更高，所以dhbh本身满足了作为基质吸收能量和传递能量的基本条件。表1中dhb熔点为195～196℃，dhbh熔点为208～210℃，可见dhbh满足质谱中高真空工作环境的要求。

实施例2：dhbh自身作为maldi基质检测糖类物质

(1)配制20pmol/μl的g6和0.1mg/ml的d2000糖溶液，可在4℃冰箱保存；

(2)配制0.1mol/l实施例1中的dhbh甲醇溶液，可在4℃冰箱保存；

(3)分别配制0.01，0.025，0.05，0.1，0.2，0.3和0.4mol/l的dhb甲醇溶液，可在4℃冰箱保存；

(4)分别取1μl步骤1中的g6糖液或d2000糖液与1μl步骤2中的dhbh甲醇溶液，依次点在polishedsteel靶板同一点样孔。使用移液枪直接在maldi靶板重复吸打10次，进行混匀。15℃下自然干燥；

(5)作为对照，分别取1μl步骤1中的g6糖液或d2000糖液与1μl步骤2中的0.1mol/ldhb甲醇溶液，依次点在polishedsteel靶板同一点样孔。使用移液枪直接在maldi靶板重复吸打10次，进行混匀。15℃下自然干燥；

(6)靶板送入maldi质谱仪，选用正离子反射模式进行数据采集。

实施例2中，图4为分别以dhb和dhbh为基质检测g6和d2000的maldi质谱图。1013.317da对应[g6+na]⁺峰，1661.528da对应[g10+na]⁺峰，可见，本实施例控制的低温条件下，dhbh不与还原糖反应，这便于考察dhbh本身作为基质的特性。图4b信噪比高于图4a，而图4d的信噪比高于图4c。可见，dhbh本身作为maldi基质与dhb性能相当，是理想的检测糖类物质的基质。

实施例3：dhbh与dhb进行组合，构建还原糖靶板衍生化策略

1、混合基质中有机酸基质与dhbh的摩尔浓度比例优化

(1)配制dhb/dhbh混合基质，以实施例2中配制的不同浓度dhb甲醇溶液为溶剂，以dhbh为溶质，分别配制0.1m的dhbh混合溶液。即为0.01∶0.1，0.025∶0.1，0.05∶0.1，0.1∶0.1，0.2∶0.1，0.3∶0.1，0.4∶0.1的dhb/dhbh混合基质溶液；

(2)分别配制0.1，0.05，0.025，0.01m的chca甲醇溶液，可在4℃冰箱保存；

(3)配制chca/dhbh混合基质，0.01∶0.1，0.025∶0.1，0.05∶0.1和0.1∶0.1的chca/dhbh混合基质可采用步骤(1)中配制方法，即以步骤(2)中不同浓度chca甲醇溶液为溶剂，以dhbh为溶质，分别配制0.1m的dhbh混合溶液。0.2∶0.1，0.3∶0.1，0.4∶0.1的chca/dhbh混合基质可采用先除去溶剂再溶解的方法，即将步骤(2)中0.1mchca甲醇溶液和实施例2中的0.1mdhbh甲醇溶液按照体积比为2∶1，3∶1和4∶1分别加入1.5ml离心管，真空离心去除溶剂，然后分别加入1个体积的甲醇溶剂，由于酸碱离子对效应，可分别获得0.2∶0.1，0.3∶0.1，0.4∶0.1的chca/dhbh混合基质溶液；

(4)分别取1μl实施例2中的g6糖液和1μl步骤1中的dhb/dhbh混合基质溶液，依次点在polishedsteel靶板同一点样孔。使用移液枪直接在maldi靶板重复吸打10次，进行混匀。65℃下反应30min；

(5)作为对照，分别取1μl实施例2中的g6糖液和1μl步骤3中chca/dhbh混合基质溶液，依次点在polishedsteel靶板同一点样孔。使用移液枪直接在maldi靶板重复吸打10次，进行混匀。65℃下反应30min；

(6)靶板送入maldi质谱仪，选用正离子反射模式进行数据采集。

实施例3中，图5为基于dhb/dhbh组合型基质的还原糖靶板衍生化原理图，其中，dhbh为反应型基质，具有酰肼基活性反应基团，可与还原糖半缩醛反应。dhb为催化剂，可显著催化dhbh与还原糖的成腙反应。dhb和dhbh均为糖类物质检测的高效基质，无需分离，适用于靶板衍生化策略，可实现对还原糖高通量检测。图6为有机酸基质与dhbh不同摩尔浓度比例对g6衍生化效率的影响。以dhb/dhbh为基质，当dhb和dhbh的摩尔浓度比为3∶1时，衍生化效率最高，可达到95％以上；以chca/dhbh为基质，当其摩尔浓度比为1∶4时，衍生化效率最高，可达到80％以上。可见，基于dhb/dhbh的靶板衍生化效率高于chca/dhbh。

2、有机酸基质与dhbh不同摩尔浓度比例的共结晶形态比较

(1)分别取1μl实施例2中的g6糖液和1μl步骤1中的dhb/dhbh混合基质溶液，依次点在polishedsteel靶板同一点样孔。使用移液枪直接在maldi靶板重复吸打10次，进行混匀。65℃下反应30min；

(2)作为对照，分别取1μl实施例2中的g6糖液和1μl步骤3中chca/dhbh混合基质溶液，依次点在polishedsteel靶板同一点样孔。使用移液枪直接在maldi靶板重复吸打10次，进行混匀。65℃下反应30min；

(3)靶板送入maldi质谱仪，共结晶形态。

实施例3中，图7为有机酸基质与dhbh不同摩尔浓度比例下的共结晶形态图。dhb/dhbh组合型基质中，随着dhb比例增加，其共结晶变得更加均匀；而chca/dhbh组合型基质中，随着chca比例增加，共结晶均匀度没有太大的变化，相对较差。结合图6中各摩尔浓度比例下g6的衍生化效率，可知基于dhb/dhbh的混合基质衍生化效率高，共结晶更均匀，最优摩尔浓度比为dhb∶dhbh＝3∶1。

实施例4：定性考察各基质检测不同分子量还原糖的能力

1、dhb/dhbh作为基质检测还原性寡多糖

(1)配制20pmol/μl的麦芽三糖水溶液，可在4℃冰箱保存；

(2)分别配制0.5mg/ml的d5000和0.5mg/ml的d12000糖溶液，可在4℃冰箱保存；

(3)分别配制20000fmol/μl的na2，na2f和a1标准糖溶液，后稀释至10000，2000，1000，200，100，50，25fmol/μl，得各梯度的na2，na2f和a1糖液；

(4)分别取1μl实施例2中的d2000糖液或步骤1中的麦芽三糖溶液或步骤2中的d5000糖液或d12000糖液与1μl实施例3中的dhb/dhbh(摩尔浓度比为3∶1)的甲醇溶液，依次点在polishedsteel靶板同一点样孔。使用移液枪直接在maldi靶板重复吸打10次，进行混匀。80℃下反应30min，保证还原糖完全反应；

(5)作为对照，分别取1μl实施例2中的d2000糖液或步骤1中的麦芽三糖溶液或步骤2中的d5000糖液或d12000糖液与1μl实施例2中的0.3mdhb甲醇溶液，依次点在polishedsteel靶板同一点样孔。使用移液枪直接在maldi靶板重复吸打10次，进行混匀。室温下自然干燥30min；

(6)作为对照，分别取1μl实施例2中的d2000糖液或步骤1中的麦芽三糖溶液或步骤2中的d5000糖液或d12000糖液与1μl实施例3中的chca/dhbh(摩尔浓度比为1∶4)的甲醇溶液，依次点在polishedsteel靶板同一点样孔。使用移液枪直接在maldi靶板重复吸打10次，进行混匀。80℃下反应30min，保证还原糖完全反应；

(7)靶板送入maldi质谱仪，选用正离子反射模式或线性模式进行数据采集。

实施例4中，图8为不同基质定性检测麦芽三糖、d2000、d5000和d12000的maldi质谱图。图8a麦芽三糖的检测，527.158da对应[g3+na]⁺峰，677.198da对应[g3+dhbh+na]⁺峰。以dhb/dhbh为基质的信噪比最高；图8bd2000的检测，1013.222da对应[g6+na]⁺峰，1163.320da对应[g6+dhbh+na]⁺峰，162da对应一个糖残基。以dhb/dhbh为基质的信噪比明显高于其他基质；图8cd5000的检测，4092.320da对应[g25+na]⁺峰，4242.360da对应[g25+dhbh+na]⁺峰，162da对应一个糖残基。以dhb/dhbh为基质的峰强度高于其他基质，且峰形呈标准的正态分布；图8dd12000的检测，以dhb/dhbh为基质的峰强度明显高于其他基质。表1中以dhb为基质检测糖蛋白上中性糖分子na2和na2f的检测限分别为500fmol和200fmol，而以dhb/dhbh为基质时na2和na2f的检测限可低至10fmol；同时，dhb/dhbh适用于酸性糖a1的检测，检测限为100fmol以下。可见，以dhb/dhbh为基质检测效果最佳，可以明显提高糖类物质的电离化效率，提高检测灵敏度，适用于寡糖和多糖等的检测。表1：基质的质子亲和势、熔点及对na2，na2f和a1的检测限。

表1

2、dhb/dhbh作为基质检测葡萄糖和蔗寡糖

(1)分别配制20pmol/μl的葡萄糖、蔗糖、蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖水溶液，可在4℃冰箱保存；

(2)分别取1μl步骤1中的葡萄糖、蔗糖、蔗果三糖、蔗果四糖或蔗果五糖溶液与1μl实施例3中的dhb/dhbh(摩尔浓度比为1∶1)的甲醇溶液，依次点在polishedsteel靶板同一点样孔。使用移液枪直接在maldi靶板重复吸打10次，进行混匀。室温下自然干燥；

(3)作为对照，分别取1μl步骤1中的葡萄糖与1μl实施例2中的0.1mdhb甲醇溶液，依次点在polishedsteel靶板同一点样孔。使用移液枪直接在maldi靶板重复吸打10次，进行混匀。室温下自然干燥；

(4)靶板送入maldi质谱仪，选用正离子反射模式进行数据采集。

实施例4中，图9为不同基质定性检测葡萄糖、蔗糖、蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖的maldi质谱图。图9a为以dhb作为基质检测葡萄糖的maldi质谱图，基质峰干扰严重，葡萄糖较难检测。图9b中以dhb/dhbh为基质检测葡萄糖，室温下干燥过程即可发生完全衍生，353.096da对应[g1+dhbh+na]⁺峰。图9c、图9d、图9e和图9f中，以dhb/dhbh为基质检测非还原糖如蔗糖、蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖，均以[m+na]⁺峰被检出，且几乎无基质峰的干扰。可见，当dhb/dhbh中dhb和dhbh的摩尔比为1或更小时，适用于小分子碳水化合物的检测，基质峰干扰小，信噪比高。

实施例5：定量考察以dhb/dhbh为基质方法的稳定性和线性范围

(1)分别配制浓度为100fmol/μl的带有2ab标签的na2和a1糖溶液，可在-20℃冰箱保存；

(2)分别取1μl实施例2中的g6糖液，1μl实施例2中的dhb基质溶液或实施例3中dhb/dhbh混合基质溶液或chca/dhbh混合基质溶液，依次点在polishedsteel靶板同一点样孔。使用移液枪直接在maldi靶板重复吸打10次，进行混匀，65℃下反应30min。靶板送入maldi质谱仪，正离子反射模式同一点样孔采样45次；

(3)分别取1μl实施例2中的g6糖液和1μl实施例3中dhb/dhbh混合基质溶液，依次点在polishedsteel靶板同一点样孔。使用移液枪直接在maldi靶板重复吸打10次，进行混匀，65℃下反应30min。maldi成像采用正离子反射模式，分辨率为200μm，每个像素500张谱图，激光强度为50％。

(4)分别取1μl实施例4中不同浓度的na2糖液，1μl步骤1中带有2ab标签的na2内标溶液，1μl实施例3中dhb/dhbh混合基质溶液，依次点在polishedsteel靶板同一点样孔。使用移液枪直接在maldi靶板重复吸打10次，进行混匀，65℃下反应30min。靶板送入maldi质谱仪，正离子反射模式采集数据；

(5)分别取1μl实施例4中不同浓度的na2f糖液，1μl步骤1中带有2ab标签的na2内标溶液，1μl实施例3中dhb/dhbh混合基质溶液，依次点在polishedsteel靶板同一点样孔。使用移液枪直接在maldi靶板重复吸打10次，进行混匀，65℃下反应30min。靶板送入maldi质谱仪，正离子反射模式采集数据；

(6)分别取1μl实施例4中不同浓度的a1糖液，1μl步骤1中带有2ab标签的a1内标溶液，1μl实施例3中dhb/dhbh混合基质溶液，依次点在polishedsteel靶板同一点样孔。使用移液枪直接在maldi靶板重复吸打10次，进行混匀，65℃下反应30min。靶板送入maldi质谱仪，负离子反射模式采集数据。

实施例5中，图10为以dhb，chca/dhbh和dhb/dhbh为基质检测还原糖时信号的重现性及线性范围。图10a和10b中，以dhb/dhbh为基质检测g6的相对标准偏差为10.0％，明显低于对照组基质。图10c中，以dhb/dhbh为基质检测g6的maldi成像图中，g6离子强度在整个点样的靶板孔较稳定。可见，以dhb/dhbh为基质检测g6时，方法的稳定性好。图10d和10e为以2ab标记的na2为内标，正离子模式下分别对na2和na2f的线性范围进行考察，发现它们在0.025～20pmol/μl呈良好的线性关系，r²＞0.995；图10f为以2ab标记的a1为内标，在负离子模式下检测a1的线性区间范围，在0.2～20pmol/μl呈良好的线性关系，r²＞0.999。可见，以dhb/dhbh为基质可分别对酸性糖和中性糖进行分析，基于dhb/dhbh的靶板衍生化策略可实现对还原性糖的高通量检测。

实施例6：dhb/dhbh定性定量检测血清中的还原n-糖链

本发明中自制n-还原糖采用标准糖蛋白n-糖的制备方法，以大肠癌患者血清中糖蛋白为例进行说明。

本发明采用pngasef酶法制备n-还原糖，步骤如下：

(1)酶解。10μl血清中加入1μl10x糖蛋白变性缓冲液，100℃加热10min使蛋白变性，后冷却至室温。加入2μl10xglycobuffer2反应缓冲液，2μl10％np-40，4μlddh2o，1μlpngasef，混匀，37℃孵育24h进行酶解。

(2)纯化。将酶解得到的样品离心，依次用c18固相萃取小柱和石墨化碳固相萃取小柱对解离的还原性n-糖进行纯化。c18固相萃取小柱用于除去杂质肽、蛋白和其他污染物，纯化过程如下：4ml甲醇用于活化柱子，4ml超纯水用于平衡柱子。吸取上清液加入小柱内，分3次用超纯水洗脱柱子，每次1ml，收集洗脱液。然后，采用石墨化碳固相萃取小柱对盐和小分子极性化合物进行除杂，具体过程如下：依次用3ml乙腈和1ml50％的乙腈水溶液对小柱进行活化，用3ml超纯水进行小柱的平衡。将c18纯化过程收集的糖液上样，5ml超纯水洗脱除杂。依次用2ml40％的乙腈水溶液洗脱中性糖，2ml60％的含有0.05％tfa的乙腈水溶液洗脱酸性多糖，分别收集洗脱糖液，室温真空离心去除溶剂，复溶于50μl超纯水中，可在-20℃冰箱保存；

(3)分别取1μl步骤2中的中性糖液，1μl实施例5中2ab标记的na2内标溶液，1μl实施例3中dhb/dhbh混合基质溶液，依次点在polishedsteel靶板同一点样孔。使用移液枪直接在maldi靶板重复吸打10次，进行混匀，65℃下反应30min。靶板送入maldi质谱仪，正离子反射模式采集数据；

(4)分别取1μl步骤2中的酸性糖液，1μl实施例5中2ab标记的a1内标溶液，1μl实施例3中dhb/dhbh混合基质溶液，依次点在polishedsteel靶板同一点样孔。使用移液枪直接在maldi靶板重复吸打10次，进行混匀，65℃下反应30min。靶板送入maldi质谱仪，负离子反射模式采集数据；

(5)内标法进行仪器质量校准。对检测到的多种还原性n-糖数据进行归一化处理，随后求得各还原性n-糖在癌症组和健康组的相对比值。

实施例6中，图11为以dhb/dhbh为基质检测癌症组和健康组血清蛋白还原性n-糖的maldi质谱图。图11a正离子模式下可检测到中性糖11种；图11b负离子模式下可检测到酸性糖11种。图10c为含量归一化后不同还原糖的癌症组和健康组比例分析。结果表明，癌症组有12种糖有明显的含量上升趋势，包括6种中性糖和和6种酸性糖。作为癌症标志物高通量筛查方法，该发明可能为临床疾病的快速诊断提供重要的数据支撑和理论指导。

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。