一种便携式真菌毒素免疫层析定量检测装置及检测方法与流程

本发明涉及免疫检测技术领域，具体地，涉及一种便携式真菌毒素免疫层析定量检测装置及检测方法。

背景技术：

真菌毒素(mycotoxin)是由真菌产生、广泛存在于农产品中的有毒次生代谢产物，主要有黄曲霉毒素(aflatoxin，aft)、赭曲霉毒素(ochratoxin，ota)、玉米赤霉烯酮(zearalenone，zen)等，能污染几乎所有种类的食品及饲料。据联合国粮农组织(fao)统计，全球每年有25％的农产品受到真菌毒素污染，造成的经济损失每年达数千亿美元。这些霉变的食品或饲料通过食物链进入人体后，可造成致癌、致畸、致突变等严重危害。真菌毒素污染不仅造成了巨大的经济损失，还成为威胁人类健康安全的重大风险隐患。因此，加强真菌毒素的防控已成为保障我国乃至世界粮食安全、食品安全和环境安全的迫切需求。

真菌毒素的残留检测主要有仪器分析法和免疫分析法。仪器方法灵敏度高，特异性强，但需要昂贵的设备、专业的操作人员和繁琐的样品前处理，不适合大量样本的快速筛查。而免疫分析方法以其快速简单、成本低、灵敏度高、适合实际生产中现场监控及大规模样本筛查等优势，在真菌毒素检测领域发展迅速。免疫分析技术目前应用最广泛的是elisa和免疫层析方法。免疫层析方法因样本前处理简单、结果可在5～20min获取而备受研究者和用户的青睐。但免疫层析检测方法大多数只能实现定性或半定量检测，同时现有的定量检测的装置或系统大多数存在体积大、数据处理不方便、准确性低、不能及时发布结果或检测结果容易出错等一系列的问题。如专利cn201520397285.7中使用比色卡实现免疫层析技术的半定量检测，因免疫层析检测技术受检测温度、湿度等客观条件的影响，显色强度有着较大的变化，比色卡比色的定量方法较难实现免疫层析技术的准确定量；专利cn201510415935.0公开了一种通过光感传感器实现免疫层析技术的定量检测技术，数据处理繁琐且无法快速传输样本检测结果和地理信息；janeruchoi和martinazangheri研发的基于智能手机的免疫层析定量检测装置能够较好实现定量检测，但检测装置体积较大或采集的图像不清晰并且只通过一组标准样品数据得出标准曲线均不利于准确实现大量样本现场定量检测(janeruchoietal.,2016；martinazangherietal.,2015)。针对上述问题，现有技术中尚未提出有效的解决方案。因此，需要研发一种新的真菌毒素免疫层析定量检测装置以解决上述问题。

技术实现要素：

本发明的目的是为了克服现有技术的上述不足，提供一种便携式真菌毒素免疫层析定量检测装置及检测方法，通过本发明装置能实现对玉米、大豆、小麦等谷物和饲料等样本现场快速、准确的定量检测，并能够实现数据的快速传输。

为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：

一种真菌毒素免疫层析定量检测卡，包括底板，所述底板上依次设有样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸；所述吸水纸和结合垫分别交叠压在硝酸纤维素膜的两端，在硝酸纤维素膜的表面形成检测区；所述样品垫交叠压在结合垫上；所述结合垫上固定有胶体金、彩色乳胶微球或荧光微球标记的真菌毒素抗体；所述检测区内的硝酸纤维素膜上固定有真菌毒素抗原构成的检测线(t线)和羊抗鼠或羊抗兔igg二抗构成的质控线(c线)。

优选地，所述检测线位于检测区中靠近结合垫的一端，所述质控线位于检测区中靠近吸水纸的一端。

优选地，所述真菌毒素免疫层析定量检测卡还包括外壳，所述底板、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸均置于外壳内，所述外壳壳面上对应于硝酸纤维膜的位置设有观察窗，外壳壳面上对应于样品垫的位置设有加样孔。

优选地，所述样品垫为经含表面活性剂、蛋白保护剂的缓冲液浸泡处理后干燥的玻璃纤维构件。

优选地，所述底板为聚苯乙烯构件或者聚乙烯构件。

优选地，所述外壳包括塑料上壳和塑料下壳，所述塑料上壳扣合塑料下壳后形成外壳。

本发明还请求保护一种便携式真菌毒素免疫层析定量检测装置，包括上述真菌毒素免疫层析定量检测卡，依次连接的暗箱、微距镜头、手机支架和智能手机，所述真菌毒素免疫层析定量检测卡嵌合于暗箱中。

本发明可根据真菌毒素免疫层析定量检测卡和智能手机的尺寸分别设计暗箱和手机支架的规格，将真菌毒素免疫层析定量检测卡插入相应规格的暗箱中，通过智能手机后置摄像头以及微距镜头组成的光路系统实现图像的采集；通过内置于智能手机的自编程定量app检测软件，对后置摄像头捕获的图像的rgb信号进行处理并转化成相应的数值，通过一系列浓度的检测，建立标准曲线，实现对待测样品的检测分析。

具体的检测原理如下：随着样品中真菌毒素浓度不断升高在免疫层析系统(即真菌毒素免疫层析定量检测卡)中的t线(检测线)显色越浅，通过图像采集系统(即依次连接的暗箱、微距镜头、手机支架和智能手机)采集一系列浓度样品的图像信息，通过图像分析系统(即内置于智能手机的自编程定量app检测软件)中的人工模式读取免疫层析检测卡中t灰度值和c灰度值并自动计算t灰度值/c灰度值，通过分析一系列浓度的样本信息，以真菌毒素浓度为横坐标，t灰度值/c灰度值为纵坐标拟合标准曲线，并通过未知样品的t灰度值/c灰度值得出未知样品浓度或通过ai模式将云服务器的数据在电脑上通过机器学习建立规则，比对位置样品的相关信息便可得出未知样品的浓度。

其中，所述暗箱一方面起到固定真菌毒素检测卡的作用，另一方面为图像采集提供黑暗环境，使之不受外界环境的影响。

优选地，所述暗箱是由光敏树脂通过3d打印制成的。

所述微距镜头即可以缩短拍摄距离，使整个装置更加便携；又可以放大所拍摄区域，使拍摄区域更加清晰，利于数据采集、读取和分析。

优选地，所述微距镜头包括相连接的第一微距镜头和第二微距镜头，第一微距镜头的另一端与智能手机的后置摄像头相接，第二微距镜头的另一端与暗箱相接。通过设置两个微距镜头使得整体装置更加小巧、便携且可以采集到更加清晰的图像。

所述手机支架与智能手机连接，将整个装置固定在智能手机上。

所述智能手机通过后置摄像头和闪光灯读取图像信息，内置定量app检测软件分析图像信息。

所述定量app检测软件包括项目管理板块，针对不同种类的真菌毒素可创建不同的项目。图像采集板块，采集图片信息，并可上传至云服务器；图像分析板块，分为人工模式和ai模式，人工模式通过分析一组标准样本图像的rgb信息计算t灰度值/c灰度值，并拟合标准曲线，实现定量检测，ai模式分析上传至后台的大量样本信息；检测结果模块，显示检测结果并可定位上传地理至网络。

本发明还请求保护一种真菌毒素的检测方法，是采用上述便携式真菌毒素免疫层析定量检测装置对真菌毒素标准样品或待测样品进行检测；先通过智能手机后置摄像头以及微距镜头组成的光路系统实现图像的采集；再通过内置于智能手机的自编程定量app检测软件，对后置摄像头捕获的图像的rgb信号进行处理并转化成相应的数值；最后通过一系列浓度的检测，建立标准曲线，实现对待测样品中真菌毒素的定量检测分析。

优选地，所述定量app检测软件包括人工模式和ai模式两种运行模式；当样本量小时采用人工模式，通过分析一组标准样本图像的rgb信息计算t灰度值/c灰度值，并拟合标准曲线，实现定量检测；当样本量大时采用ai模式，通过ai模式将云服务器的数据在电脑上通过机器学习建立规则，比对位置样品的相关信息得出未知样品的浓度。

优选地，所述检测方法包括如下步骤：

s1.向真菌毒素免疫层析定量检测卡加样孔中加入等量不同浓度的真菌毒素标准样品，反应3～5min；

s2.操作真菌毒素免疫层析定量检测app图像采集板块采集图像并上传至云服务器；

s3.操作真菌毒素免疫层析定量检测app图像分析板块人工模式得到样本rgb信息和检测标准曲线；若样本量大，采用ai模式；

s4.向真菌毒素免疫层析定量检测卡加样孔中加入适量待测真菌毒素样品，反应3～5min；

s5.操作真菌毒素免疫层析定量检测app图像采集板块采集图像并上传至云服务器；

s6.通过操作真菌毒素免疫层析定量检测app检测结果板块显色检测结果，并上传结果和样本地理信息至网络。

优选地，所述真菌毒素为玉米赤霉烯酮。

优选地，所述的真菌毒素免疫层析检测卡中，所述结合垫上固定有蓝色乳胶微球标记的玉米赤霉烯酮单克隆抗体；所述检测区内的硝酸纤维素膜上固定有玉米赤霉烯酮抗原zen-ova构成的检测线和羊抗鼠igg二抗构成的质控线。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明所提供的便携式真菌毒素免疫层析定量检测装置，具有体积小、操作简便、检测时间快、准确的优点，并可以进行定性检测，能够快速将检测结果通过无线网络进行共享。既能实现对玉米、大豆、小麦等谷物和饲料等样本现场快速、准确的定量检测，又能够实现数据的快速传输。

(2)目前已知的智能手机检测系统，主要是针对液体rgb、荧光等信号，而本发明的装置是开创性地针对固相免疫层析试纸条rgb信号，实现真菌毒素的快速、准确定量检测。

(3)与已知同类型便携式检测装置对比，本发明便携式真菌毒素免疫层析定量检测装置在检测app方面，在同类型检测装置的检测模块基础上增加ai检测模式，将样品信息上传至云服务器，后台通过机器学习规则对样品信息进行批量处理，从而在大批量样品检测中大大减少检测时间，并可以防止在现场检测中由于检测人员不专业而在数据处理上出现错误或人为修改数据等问题。

附图说明

图1为真菌毒素免疫层析定量检测卡的整体结构示意图。

图2为便携式真菌毒素免疫层析定量检测装置的整体结构示意图。

图3为便携式真菌毒素免疫层析定量检测装置的侧视图。

图4为便携式真菌毒素免疫层析定量检测装置的整体结构拆分示意图。

图5为便携式真菌毒素免疫层析定量检测装置的整体结构拆分侧视图。

附图标记：1-真菌毒素免疫层析定量检测卡；2-暗箱；3-微距镜头；4-手机支架；5-智能手机；11-底板；12-样品垫；13-结合垫；14-硝酸纤维素膜；15-吸水纸；16-外壳；17-观察窗；18-加样孔；31-第一微距镜头；32-第二微距镜头。

具体实施方式

下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1

一种真菌毒素免疫层析定量检测卡1，如图1所示，包括外壳16和底板11，底板11上依次设有样品垫12、结合垫13、硝酸纤维素膜14和吸水纸15；吸水纸15和结合垫13分别交叠压在硝酸纤维素膜14的两端，在硝酸纤维素膜14的表面形成检测区；样品垫12交叠压在结合垫13上；结合垫13上固定有胶体金、彩色乳胶微球或荧光微球标记的真菌毒素抗体；检测区内的硝酸纤维素膜14上固定有真菌毒素抗原构成的检测线和羊抗鼠或羊抗兔igg二抗构成的质控线；检测线位于检测区中靠近结合垫13的一端，质控线位于检测区中靠近吸水纸15的一端；底板11、样品垫12、结合垫13、硝酸纤维素膜14和吸水纸15均置于外壳16内，外壳16壳面上对应于硝酸纤维膜14的位置设有观察窗17，外壳16壳面上对应于样品垫12的位置设有加样孔18；外壳16包括塑料上壳和塑料下壳，塑料上壳扣合塑料下壳后形成外壳16。

其中，样品垫12为经含表面活性剂、蛋白保护剂的缓冲液浸泡处理后干燥的玻璃纤维构件；底板11为聚苯乙烯构件或者聚乙烯构件。

实施例2

一种便携式真菌毒素免疫层析定量检测装置，如图2～图4所示，包括实施例1中的真菌毒素免疫层析定量检测卡1，依次连接的暗箱2、微距镜头3、手机支架4和智能手机5，真菌毒素免疫层析定量检测卡1嵌合于暗箱2中；暗箱2是由光敏树脂通过3d打印制成的；微距镜头3包括相连接的第一微距镜头31和第二微距镜头32，第一微距镜头31的另一端与智能手机5的后置摄像头相接，第二微距镜头32的另一端与暗箱2相接。

其中，暗箱2一方面起到固定真菌毒素检测卡1的作用，另一方面为图像采集提供黑暗环境，使之不受外界环境的影响。微距镜头3即可以缩短拍摄距离，使整个装置更加便携；又可以放大所拍摄区域，使拍摄区域更加清晰，利于数据采集、读取和分析。通过设置两个微距镜头使得整体装置更加小巧、便携且可以采集到更加清晰的图像。手机支架4与智能手机5连接，将整个装置固定在智能手机5上。智能手机5通过后置摄像头和闪光灯读取图像信息，内置定量app检测软件分析图像信息。定量app检测软件包括项目管理板块，针对不同种类的真菌毒素可创建不同的项目。图像采集板块，采集图片信息，并可上传至云服务器；图像分析板块，分为人工模式和ai模式，人工模式通过分析一组标准样本图像的rgb信息计算t灰度值/c灰度值，并拟合标准曲线，实现定量检测，ai模式分析上传至后台的大量样本信息；检测结果模块，显示检测结果并可定位上传地理至网络。

可根据真菌毒素免疫层析定量检测卡1和智能手机5的尺寸分别设计暗箱2和手机支架4的规格，将真菌毒素免疫层析定量检测卡1插入相应规格的暗箱2中，通过智能手机5后置摄像头以及微距镜头组成的光路系统实现图像的采集；通过内置于智能手机5的自编程定量app检测软件，对后置摄像头捕获的图像的rgb信号进行处理并转化成相应的数值，通过一系列浓度的检测，建立标准曲线，实现对待测样品的检测分析。

具体的检测原理如下：随着样品中真菌毒素浓度不断升高在免疫层析系统(即真菌毒素免疫层析定量检测卡1)中的t线(检测线)显色越浅，通过图像采集系统(即依次连接的暗箱2、微距镜头3、手机支架4和智能手机5)采集一系列浓度样品的图像信息，通过图像分析系统(即内置于智能手机5的自编程定量app检测软件)中的人工模式读取免疫层析检测卡1中t灰度值和c灰度值并自动计算t灰度值/c灰度值，通过分析一系列浓度的样本信息，以真菌毒素浓度为横坐标，t灰度值/c灰度值为纵坐标拟合标准曲线，并通过未知样品的t灰度值/c灰度值得出未知样品浓度或通过ai模式将云服务器的数据在电脑上通过机器学习建立规则，比对位置样品的相关信息便可得出未知样品的浓度。

实施例3

一种真菌毒素的检测方法，是采用实施例2的便携式真菌毒素免疫层析定量检测装置对真菌毒素标准样品或待测样品进行检测；先通过智能手机后置摄像头以及微距镜头组成的光路系统实现图像的采集；再通过内置于智能手机的自编程定量app检测软件，对后置摄像头捕获的图像的rgb信号进行处理并转化成相应的数值；最后通过一系列浓度的检测，建立标准曲线，实现对待测样品的中真菌毒素的定量检测分析。

其中，定量app检测软件包括人工模式和ai模式两种运行模式；当样本量小时采用人工模式，通过分析一组标准样本图像的rgb信息计算t灰度值/c灰度值，并拟合标准曲线，实现定量检测；当样本量大时采用ai模式，通过ai模式将云服务器的数据在电脑上通过机器学习建立规则，比对位置样品的相关信息得出未知样品的浓度。

上述检测方法包括如下步骤：

s1.向真菌毒素免疫层析检测卡加样孔中加入等量不同浓度的真菌毒素标准样品，反应3～5min；

s2.操作真菌毒素免疫层析定量检测app图像采集板块采集图像并上传至云服务器；

s3.操作真菌毒素免疫层析定量检测app图像分析板块人工模式得到样本rgb信息和检测标准曲线；若样本量大，采用ai模式；

s4.向真菌毒素免疫层析检测卡加样孔中加入适量待测真菌毒素样品，反应3～5min；

s5.操作真菌毒素免疫层析定量检测app图像采集板块采集图像并上传至云服务器；

s6.通过操作真菌毒素免疫层析定量检测app检测结果板块显色检测结果，并上传结果和样本地理信息至网络。

该便携式真菌毒素免疫层析定量检测装置检测的样本可为玉米、大豆、小麦等谷物和饲料等。下面以玉米赤霉烯酮的检测为例，具体见实施例4。

实施例4

本实施例为玉米赤霉烯酮的检测方法，具体包括如下步骤：

先将待测样品磨粉，称取1g粉末，加入2ml50％甲醇溶液，剧烈振荡3min，于常温下5000rpm/min离心5min，取上清液，并用0.02mpb溶液(ph＝7.4)稀释4倍，用胶头滴管吸取2滴上清液加入玉米赤霉烯酮免疫层析定量检测卡加样孔中，操作玉米赤霉烯酮免疫层析定量检测app计算不同浓度玉米赤霉烯酮在玉米赤霉烯酮免疫层析检测卡t、c线显色强度，并得出玉米赤霉烯酮含量和t灰度值/c灰度值的标准曲线，实现玉米赤霉烯酮的定量检测，并可将检测结果通过无线网络共享。

其中，便携式玉米赤霉烯酮免疫层析定量检测装置，包括免疫层析系统、图像采集系统、图像读取分析系统。免疫层析系统为玉米赤霉烯酮蓝色乳胶微球免疫层析定量检测卡；图像采集系统由光敏树脂通过3d打印的暗箱、手机支架、微距镜头和智能手机组成；图像采集分析系统通过玉米赤霉烯酮免疫层析定量检测app实现。

玉米赤霉烯酮蓝色乳胶微球免疫层析定量检测卡由外壳、底板、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜(nc膜)、吸水纸组成。结合垫上喷有蓝色乳胶微球标记好的玉米赤霉烯酮单克隆抗体，nc膜上划有玉米赤霉烯酮抗原zen-ova和羊抗鼠igg，抗原zen-ova为t线，羊抗鼠igg为c线。

(1)划膜

抗原zen-ova浓度为0.1mg/ml，羊抗鼠igg浓度为0.2mg/ml，抗原zen-ova和羊抗鼠igg通过pb溶液(0.02m,ph＝7.4)稀释，通过喷金划膜仪将抗原zen-ova、羊抗鼠igg划到nc膜上，用量为0.8μl/cm，划好后37℃烘箱干燥2h，密封备用。

(2)蓝色乳胶微球玉米赤霉烯酮抗体标记

溶解：在1.5ml离心管加入1mlmes溶液(0.05m，ph＝5.5)，随后加入0.5mg蓝色乳胶微球溶液(5mg/ml)；

活化：在上述溶液中加入15μl0.5mg/mledc溶液、18μl0.5mg/mlnhs溶液；200rpm/min反应15min，随后在4℃下14000rpm/min，离心15min；

标记：去除上清液，加入1mlbb溶液(0.05m，ph＝8.0)加入1μl玉米赤霉烯酮单克隆抗体(5mg/ml)200rpm/min反应30min；

封闭：在上述溶液中加入20μl20％bsa溶液，200rpm/min反应15min，随后在4℃下14000rpm/min离心15min；

复溶：去除上清液，加入200μl复溶液，4℃保存待用。

复溶液配方为：0.02mpb溶液(ph＝7.4)含有0.5％triton-100、5％海藻糖、0.5％bsa、0.5％pvp和0.03％procline-300。

(3)喷球

将标记上玉米赤霉烯酮单克隆抗体的蓝色乳胶微球溶液通过喷金划膜仪以3.5μl/cm喷在结合垫上，37℃烘箱干燥30min，密封备用。

(4)检测卡组装

在pvc底板上贴上干燥好的nc膜，结合垫叠加nc膜1～2mm，样品垫叠加结合垫1～2mm，吸水纸叠加nc膜1～2mm。组装好后用裁条机裁剪成3.05mm，装入卡壳中，放入干燥剂待用。

(5)样品前处理

称取1g样品，加入2ml50％甲醇溶液，剧烈震荡3min，常温下5000rpm/min离心5min，收集上清液，并用pb溶液(0.02m，ph＝7.4)稀释4倍待用。

(6)跑样

用胶头滴管吸取2滴不同浓度的玉米赤霉烯酮样品加入组装好的检测卡加样孔中，反应3～5min。

(7)图像采集分析

用胶头滴管向玉米赤霉烯酮免疫层析定量检测卡加样孔中加入2滴不同浓度的玉米赤霉烯酮标准样品；反应3～5min后，操作玉米赤霉烯酮免疫层析定量检测app图像采集板块采集图像并上传至云服务器；操作玉米赤霉烯酮免疫层析定量检测app图像分析板块人工模式得到样本rgb信息和检测标准曲线，如若样本多，便使用ai模式；胶头滴管向玉米赤霉烯酮免疫层析定量检测卡加样孔中加入2滴待测玉米赤霉烯酮样品；反应3～5min后，操作玉米赤霉烯酮免疫层析定量检测app图像采集板块采集图像并上传至云服务器；通过操作玉米赤霉烯酮免疫层析定量检测app检测结果板块显色检测结果，并上传结果和样本地理信息至网络。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。