一种离子交换层析法检测糖化血红蛋白HbA1c的试剂的制作方法

本发明涉及医学检验中糖化血红蛋白检测技术领域，具体为一种离子交换层析法检测糖化血红蛋白hba1c的试剂。

背景技术：

糖化血红蛋白hba1c是红细胞中的血红蛋白与血液中的葡萄糖缓慢、持续且不可逆反应的产物，它浓度相对恒定，能够反映机体近2-3个月平均血糖水平目前，作为国际糖尿病研究权威机构之一的美国糖尿病协会(ada)已将其作为糖尿病控制的金标准。它对糖尿病的筛选、诊断、疗效观察具有十分重要的意义。

糖化血红蛋白测定方法多达60余种，主要分为两大类：①基于电荷差异的检测方法，包括离子交换层析、高效液相色谱分析和电泳法等；②基于结构差异的检测方法，包括亲和层析法和免疫法等。

亲和层析法利用其与hba1c残基中的葡萄糖特异性结合达到分离测定的目的，且受糖化血红蛋白变异体和衍生物干扰最小，但是只要血红蛋白分子上有糖基化结构，都能被亲和柱捕捉到，因此该方法的检测结果为糖化血红蛋白总量，比其他方法学测值偏高。

免疫法采用抗体介导的乳胶凝集抑制原理定量测定hba1c，但易受许多同源的糖化血红蛋白变体的干扰，且对应试剂原料需要用到动物性的抗体抗原，价格偏贵，还需在低温条件下保存，运输成本也较高。

电泳法是根据糖化血红蛋白与非糖化血红蛋白所带电荷的不同而进行分离，电泳结束后，血红蛋白hb各组分从负极到正极分别是hba1a、hba1b、hba1c、hba0。通过吸光度扫描，可计算得出hba1c的百分含量。但此方法的缺点是需成批进行样本分析，速度比较慢，无法进行实时检测，自动化程度低，急诊插入、自动维护等功能比较欠缺。

离子交换高效液相色谱分析法是检测糖化血红蛋白hba1c的金标准，它是基于血红蛋白β链n末端缬氨酸糖化后所带电荷不同，与阳离子交换树脂的附着力不同而建立。因此可通过hplc法将不同组分区分开，得到分离，并用检测器对分离后的各种血红蛋白组分的吸光度进行检测，分析结束后，以百分率表示各种血红蛋白组分结果。

本发明中的试剂及其原理同离子交换高效液相色谱分析法，均是洗脱液和溶血剂组成，其中，溶血剂作为样品的处理用产品，使全血样品中的细胞膜破裂而释放出全血样本中的血红蛋白，起到破膜的作用，不发生化学反应而产生新的化学物质。层析柱中的阳离子交换树脂因其活化后具有一定的阳离子极性，与全血样品中不同电荷的糖化血红蛋白、糖化血红蛋白变异体以及非糖化血红蛋白形成一定强弱差异的离子键，当特定ph强度的洗脱液通过吸附有全血样品的层析柱时，则可使离子键较弱的糖化血红蛋白率先从层析柱上洗脱分离下来，而糖化血红蛋白变异体和非糖化血红蛋白则因结合力较强，只能被ph强度较高的洗脱液分次洗脱下来，因此，本发明中的洗脱液与全血样品并不发生生物或化学反应，只是一种吸附、置换、脱离的过程。

技术实现要素：

(一)解决的技术问题

针对现有技术的不足，本发明提供了一种离子交换层析法检测糖化血红蛋白hba1c的试剂，解决了上述背景技术中的问题。

(二)技术方案

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种离子交换层析法检测糖化血红蛋白hba1c的试剂，包括以下溶液：

a洗脱液的主要成份为0.2～1g/l的磷酸氢二钠、0.5～1.5g/l的磷酸二氢钠、0.2～1g/l的氯化钾和0.02～0.4g/l的防腐剂，ph范围为6.1～7.1。

b洗脱液的主要成份为0.2～1g/l的磷酸氢二钠、0.5～1.5g/l的磷酸二氢钠、0.2～1g/l的氯化钾、1～5g/l的氯化钠和0.02～0.4g/l的防腐剂，ph为6.1～7.1。

c洗脱液的主要成份为0.2～1g/l的磷酸氢二钠、0.5～1.5g/l的磷酸二氢钠、0.2～1g/l的氯化钾、2～10g/l的氯化钠、0.02～0.4g/l的防腐剂，ph为5.9～6.9。

d洗脱液的主要成份为0.2～1g/l的磷酸氢二钠、0.5～1.5g/l的磷酸二氢钠、10～20g/l的氯化钠和0.02～0.4g/l的防腐剂，ph为6.1～7.1。

溶血剂的主要成分为15～30g/l的硼酸、5～20g/l的硼砂、1～5g/l的表面活性剂和0.02～0.4g/l的防腐剂，ph为7.0～8.0。

其中本发明选用含量为0.01％至99.9％甲基异噻唑啉酮为本发明防腐剂添加剂。

进一步优化本技术方案，所述表面活性剂的替代成分有triton-x100、brj-35，聚乙二醇。

(三)有益效果

与现有技术相比，本发明提供了一种离子交换层析法检测糖化血红蛋白hba1c的试剂，具备以下有益效果：

1、该离子交换层析法检测糖化血红蛋白hba1c的试剂，试剂原料来源广泛易得，对人体无害，制备过程简单，无需复杂的制作工艺，成品试剂在常温条件下即可储存。

2、该离子交换层析法检测糖化血红蛋白hba1c的试剂，检测步骤方便，只需将试剂放置在配套仪器上，配合使用便可出测试结果。

附图说明

图1为发明试验效果图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例对本发明作进一步详细描述：

实施例1

注：“—”代表不含此成分；

实施例2

注：“—”代表不含此成分；

实施例3

注：“—”代表不含此成分；

同时基于本实施例1、2、3中各成分组成以及根据中华人民共和国医药行业标准yy/t1246-2014《糖化血红蛋白分析仪》中重复性、线性和准确度条款应符合下列要求：

重复性：测定浓度为4.0％～6.5％的样本，连续测定20次，重复测量结果变异系数cv应不大于3.0％；

线性：在检测区间内，检测结果的线性相关系数r应不小于0.9900；

准确度：用可溯源至ifcc或ngsp的正常参考物质、异常参考物质进行测量，相对偏差应在±8％区间内；

试验数据：

1、重复性

实施例1：

实施例2：

实施例3：

2、线性

实施例1：

实施例2：

实施例3：

3、准确度

实施例1：

实施例2：

实施例3：

由以上结果可以看出，本发明试剂配方与现有的仪器配套使用，检测结果均符合行业标准要求。

从说明书附图1可以看出，本发明的试剂配方能够分离出hba1a、hba1b、hba1c、hba0组分，糖化血红蛋白hba1c的检测结果有3种表示方法，美国国家糖化血红蛋白标准计划(ngsp)单位(％)和国际临床化学协会(ifcc)单位(mmol/mol)以及平均血糖(eag)单位(mmol/l)。

同时，经过大量的选材试验后发现，目前市面上已有的防腐剂在用于液相层析色谱柱的洗脱试剂或其他配套试剂时都会对液相层析色谱层析柱和层析柱内部微球填料的寿命和性能产生巨大影响，其表现是使液相层析色谱柱的填料发黑和堵住层析柱内部微球填料之间的间隙，造成整个液相层析色谱系统的压力快速增高或填料位移形成层析柱空隙状，使得层析柱的原有寿命和填料吸附能力下降，而使用甲基异噻唑啉酮作为液相色谱层析柱的洗脱液或配套试剂就不存在此类问题，与叠氮钠的防腐性能相仿，选择新的防腐剂的主要原因是因为叠氮钠属于遇水产生剧毒物质，并且在干粉状态下在剧烈震动和40℃以上的环境容易发生爆炸，容易造成环境污染和人员伤害。

本发明未经描述的技术特征可以通过或采用现有技术实现，在此不再赘述，当然，上述具体实施方式并非是对本发明的限制，本发明也并不仅限于上述具体实施方式，本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内所做出的变化、改型、添加或替换，也应落入本发明的保护范围内。