一种光电化学生物传感器及其对BLM的检测方法与流程

本发明属于纳米新材料技术领域，具体涉及一种光电化学生物传感器及其对blm的检测方法。

背景技术：

博莱霉素（blm）作为一种天然糖肽衍生的抗生素，已被广泛用作一种可用于治疗多种癌症的化疗药物。迄今为止，已经建立了多种用于blm检测的技术，例如电化学方法，荧光和电致化学发光。然而，上述这些方法通常受到复杂样品处理或昂贵或有毒试剂的影响。迫切需要开发一种灵敏有效的化学治疗药物和临床样品中blm的定量测定方法。

光电化学（pec）传感作为一种新兴的分析方法，近年来备受关注。它实现了输入信号和输出信号的绝对分离，具有背景信号低，检测灵敏度高，测定成本低，响应快的优点。各种功能性纳米材料，在光照条件下，电子从价带(vb)转移到导带(cb)，导致光生电子和空穴的分离。合成并研究了许多三维（3d）纳米材料，如碳基，氧化物组合材料和硫化物组材料。三维纳米材料阵列由于取向性高，比表面积大，界面结构均匀，作为pec材料引起了人们的极大兴趣。在各种三维纳米硫化物中，ws2修饰的钛网（ws2/tm）具有表面积大，活性位点密度高，稳定性好，电解质扩散性好等优点，有利于产生pec信号。

通常引入天然酶以催化特定产物的形成实现信号放大。然而，天然酶存在不稳定，生产成本高，储存条件严格等缺点，限制了其广泛使用。一些基于纳米材料的酶模拟物是通过可控合成开发的，具有高催化活性和低生产成本。高还原性银纳米粒子（agnps）是高效，稳定且易于制备的模拟酶。另外，具有多孔结晶结构的金属有机骨架（mofs）是无机聚合物，由于有序稳定的多孔结构，大的比表面积，使它具有优异的催化活性。然而，mofs结构中的低密度原子会降低其活性位和吸附能力。

技术实现要素：

为解决现有技术存在的问题，本发明提供了一种ws2-au和具有多孔结晶结构的金属有机骨架ag/znmof模拟过氧化物纳米复合材料的制备方法，本发明制备的ws2/tm具有表面积大，活性位点密度高，稳定性好，电解质扩散性好等优点，有利于产生pec信号；

本发明的另一发明目的是提供了一种用于快速检测blm的光电化学生物传感器，所述传感器对blm的检测稳定性好，检测限低。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种ag/znmof模拟过氧化物纳米复合材料的制备方法，采用以下步骤：

（1）将对苯二甲酸和zn（no3）2·6h2o溶解在n,n-二甲基甲酰胺中，加热，收集mof，洗涤，纯mof干燥；

（2）将agno3溶液和gsh溶液添加到mof分散液中，搅拌，加入二氢硫辛酸溶液搅拌、温育、洗涤干燥得ag/znmof模拟过氧化物纳米复合材料。

进一步地，步骤（1）所述的将对苯二甲酸、zn（no3）2·6h2o和n,n-二甲基甲酰胺的质量体积比为（0.3-0.4）g：（1.0-1.4）g：（35-45）ml。

进一步地，步骤（2）所述agno3溶液的浓度为0.01m，所述gsh溶液的浓度为0.02m，所述mof分散液的浓度为0.8-1.2mg/ml；所述agno3溶液、gsh溶液和mof分散液体积比0.4-0.5：0.5-0.6：90-110；步骤（2）的具体操作为将agno3溶液和gsh溶液添加到mof分散液(0.8-1.2mg/ml)中，剧烈搅拌溶液1-1.2小时后，迅速加入新制备的二氢硫辛酸溶液并搅拌0.5-1小时，在23-27℃温育约1-2小时，洗涤干燥。

一种光电化学生物传感器，包括和电化学工作站连接的工作电极、参比电极、对电极，在工作电极上修饰有ws2-au，并且通过杂交链反应将ag/znmof连接到电极表面。

进一步地，所述ws2-au的制备方法为：

（1）所述ws2的制备方法，采用以下步骤：

①将0.8-0.9gna2wo3·2h2o溶解在20ml去离子水中，并逐滴加入hcl以将ph调节至1.1-1.3；

②将0.8-0.9gh2c2o4加入混合物中，稀释至45-50ml并在室温下搅拌，将0.8-0.82gnh4cl和0.82-0.84g硫脲分别溶解在上述混合物中；

③将清洁的钛网（tm）和上述溶液转移到50ml特氟隆衬里的不锈钢高压釜中，并在170-190℃下保持15-17小时，冷却至室温后，用超纯水洗涤产物，将洗涤后的产物在流动的n2气氛中在440-460℃下加热0.8-1.2小时，获得ws2/tm；

（2）ws2-au的制备方法，采用以下步骤：

①将0.8-1.2mlhaucl4（22-26mm）溶液加入到98-100ml蒸馏水中并煮沸；

②将1.9-2.1mlna3c6h5o7·2h2o溶液（67-69mm）快速加入haucl4的沸腾溶液中，继续煮沸另外8-12分钟，得到酒红色溶液为au纳米颗粒；

（3）将得到的au纳米颗粒滴加到ws2纳米棒阵列表面，通过au-s键使ws2-au复合。

一种上述的光电化学生物传感器的应用，所述光电化学生物传感器应用于对blm的灵敏检测。

进一步地，检测方法采用以下步骤进行：

（1）在工作电极表面滴加p1-au形成p1-au-ws2/tm电极，在室温下4℃孵育过夜，然后采用tris-hcl缓冲液彻底冲洗p1-au-ws2/tm电极，将得到的p1-au-ws2/tm电极用1wt％bsa钝化1-1.2小时，在室温下自然干燥；

（2）在用tris-hcl缓冲液冲洗后，将电极与13-17μlag/znmof-p2缀合物在36.5-37.5℃温育1.8-2.2小时，通过dna碱基的互补配对将ag/znmof引入生物传感器；

（3）将得到的电极ag/znmof-p2-bsa-p1-au-ws2/tm与含有0.01mh2o2的0.8-1.2mg·ml^-1dab溶液在室温下孵育4-6分钟，之后，pec测量在tris-hcl缓冲液中进行，在300w氙灯下照射，根据光电化学生物传感器光电信号变化对博莱霉素进行检测。

进一步地，所述tris-hcl缓冲液的浓度为0.01m。

高还原性agnps均匀地沉积在mofs表面，不仅消除了mofs的主要缺陷，而且避免了mofs的聚集，增加活性位点，并改善催化活性。

有益效果

（1）本发明制备ws2/tm具有表面积大，活性位点密度高，稳定性好，电解质扩散性好等优点，有利于产生pec信号；高还原性agnps均匀地沉积在mofs表面，消除了mofs的低密度原子会降低其活性位和吸附能力的主要缺陷，而且避免了agnps的聚集，增加活性位点，提高催化活性。

（2）本发明所制备的新型的用于快速检测blm的光电化学生物传感器，对blm的检测稳定性好，检测限低，检测限为0.18nm。

总之，基于使用ws2-au和ag/znmof模拟过氧化物纳米复合材料设计了用于监测blm活性的简单pec生物分析平台；实验证实构建的光电化学生物传感器平台简单且经济，并且对于blm检测具有高灵敏度，选择性和可靠性，这项工作是一种新的通用pec免疫分析格式的基础，可以扩展用于探测其他感兴趣的生物相互作用。

附图说明

图1、本发明实施例1中所制备的ws2-au和高活性ag/znmof模拟酶纳米复合材料用于检测博莱霉素的光电化学生物传感器的示意图；

图2、ws2-au电荷-载流子转移过程的示意图；

图3、（a）实施例1中ws2纳米材料扫描电镜图（sem），（b）实施例1中ws2纳米材料透射电镜图（tem），插图是ws2纳米材料高分辨率透射电镜图(hrtem),（c）实施例1中制备的au纳米颗粒的tem，插图是au纳米颗粒的hrtem图像，（d）实施例1制备的znmof的sem，（e）实施例1制备的ag/znmof的tem，（f）实施例1中ws2纳米材料的x射线能谱分析图(eds)。

图4、实施例1制备的ws2纳米材料的x射线光电子能谱分析图(xps)：（a）ws2纳米材料的w4f光谱；（b）s2s光谱。（c）实施例1中制备的ws2纳米材料的x射线衍射谱(xrd);（d）实施例1制备的znmof和ag/znmof的傅里叶变换红外光谱（ft-ir）光谱。

图5、光电化学生物传感器中，（a）在0.01mtris-hcl缓冲液中的光电流响应，（b）在5.0mm[fe（cn）6]^3-/4-中的电化学阻抗光谱（eis）。以下为各工作电极：（a）ws2/tm;（b）p1-au-ws2/tm;（c）bsa-p1-au-ws2/tm;（d）ag/znmof-p2-bsa-p1-au-ws2/tm;（e）与1.0mgml^-1dab和0.01mh2o2温育5分钟后的ag/znmof-p2-bsa-p1-au-ws2/tm;（f）ag/znmof-p2-bsa-p1-au-ws2/tm与1μmblm·fe²⁺反应后，与dab和h2o2一起温育。

图6、实施例1制备的光电化学生物传感器用于检测不同浓度的博莱霉素的电流响应（a），和与之相对应的校正曲线（b）；

图7、（a）实施例1制备的光电化学生物传感器用于检测博莱霉素选择性的对照图；（b）用光开和关测量p1-au-ws2/tm探针的稳定性和重现性

具体实施方式

实施例1

（1）将0.8gna2wo3·2h2o溶解在18ml去离子水中，并逐滴加入hcl以将ph调节至1.1。将0.8gh2c2o4加入上述混合物中，将其稀释至45ml并在室温下搅拌。随后，将总共0.8gnh4cl和0.8g硫脲分别溶解在上述混合物中。通过在水和乙醇中超声处理8分钟来清洁tm。将预处理的钛网（tm）（2×4cm）和上述溶液转移到50ml特氟隆衬里的不锈钢高压釜中，并在170℃下保持15小时。冷却至室温后，用超纯水洗涤产物三次。随后，将样品在流动的n2气氛中在440℃下加热0.8小时。然后获得ws2/tm。

（2）将0.8mlhaucl4（22mm）溶液加入到98ml蒸馏水中并煮沸。然后，将1.9mlna3c6h5o7·2h2o溶液（67mm）快速加入haucl4的沸腾溶液中，继续煮沸8分钟，得到酒红色溶液。

（3）将0.3gta和1.0gzn（no3）2·6h2o溶解在n,n-二甲基甲酰胺（35ml）中，并且在85^oc加热20小时。通过离心收集合成无色结晶的mof，并用去离子水洗涤数次。然后，将纯mof在空气气氛中干燥。

（4）为了在mof孔内生长agnp，将一定量的mof粉末与agnps前体混合。在此，将0.4ml的agno3（0.008m）和0.5ml的gsh（0.018m）溶液添加到90ml的分散的mof溶液中。剧烈搅拌溶液1小时后，迅速加入新制备的二氢硫辛酸溶液并搅拌0.5小时。在23℃温育约1小时后，洗涤干燥。

实施例2

（1）将0.9gna2wo3·2h2o溶解在22ml去离子水中，并逐滴加入hcl以将ph调节至1.3。将0.9gh2c2o4加入上述混合物中，将其稀释至45-50ml并在室温下搅拌。随后，将总共0.82gnh4cl和0.84g硫脲分别溶解在上述混合物中。通过在水和乙醇中超声处理12分钟来清洁tm。将预处理的钛网（tm）（2×4cm）和上述溶液转移到50ml特氟隆衬里的不锈钢高压釜中，并在190℃下保持17小时。冷却至室温后，用超纯水洗涤产物三次。随后，将样品在流动的n2气氛中在460℃下加热1.2小时。然后获得ws2/tm。

（2）将1.2mlhaucl4（26mm）溶液加入到100ml蒸馏水中并煮沸。然后，将2.1mlna3c6h5o7·2h2o溶液（69mm）快速加入haucl4的沸腾溶液中，继续煮沸12分钟，得到酒红色溶液。

（3）将0.3-0.4gta和1.4gzn（no3）2·6h2o溶解在n,n-二甲基甲酰胺（45ml）中，并且在95^oc加热22小时。通过离心收集合成无色结晶的mof，并用去离子水洗涤数次。然后，将纯mof在空气气氛中干燥。

（4）为了在mof孔内生长agnp，将一定量的mof粉末与agnps前体混合。在此，将0.5ml的agno3（0.012m）和0.6ml的gsh（0.022m）溶液添加到110ml的分散的mof溶液中。剧烈搅拌溶液1.2小时后，迅速加入新制备的二氢硫辛酸溶液并搅拌1小时。在27℃温育约2小时后，洗涤干燥。

实施例3

（1）将0.85gna2wo3·2h2o溶解在20ml去离子水中，并逐滴加入hcl以将ph调节至1.2。将0.85gh2c2o4加入上述混合物中，将其稀释至48ml并在室温下搅拌。随后，将总共0.81gnh4cl和0.83g硫脲分别溶解在上述混合物中。通过在水和乙醇中超声处理10分钟来清洁tm。将预处理的钛网（tm）（2×4cm）和上述溶液转移到50ml特氟隆衬里的不锈钢高压釜中，并在180℃下保持16小时。冷却至室温后，用超纯水洗涤产物三次。随后，将样品在流动的n2气氛中在450℃下加热1.0小时。然后获得ws2/tm。

（2）将1.0mlhaucl4（22-26mm）溶液加入到99ml蒸馏水中并煮沸。然后，将2.0mlna3c6h5o7·2h2o溶液（68mm）快速加入haucl4的沸腾溶液中，继续煮沸10分钟，得到酒红色溶液。

（3）将0.35gta和1.2gzn（no3）2·6h2o溶解在n,n-二甲基甲酰胺（40ml）中，并且在90^oc加热21小时。通过离心收集合成无色结晶的mof，并用去离子水洗涤数次。然后，将纯mof在空气气氛中干燥。

（4）为了在mof孔内生长agnp，将一定量的mof粉末与agnps前体混合。在此，将0.45ml的agno3（0.010m）和0.55ml的gsh（0.020m）溶液添加到100ml的分散的mof溶液中。剧烈搅拌溶液1.1小时后，迅速加入新制备的二氢硫辛酸溶液并搅拌0.8小时。在25℃温育约1.5小时后，洗涤干燥。

本发明所述的光电化学生物传感器，包括和电化学工作站连接的工作极、参比电极（ag|agcl|cl^-）、对电极（铂电极），采用氙灯照射为模拟光源，工作电极为钛网（tm），tm在修饰之前，在超纯水中超声清洗15-20min，tm电极的面积为0.5*0.5cm²。

本实施例1所述的光电化学生物传感器在tm工作电极上直接水热生成ws2纳米棒阵列。

本实施例1所述光电化学生物传感器对博莱霉素检测时，在工作电极表面滴加p1-au形成p1-au-ws2/tm电极，在室温下4℃孵育过夜，然后采用0.01mtris-hcl缓冲液彻底冲洗p1-au-ws2/tm电极，将得到的p1-au-ws2/tm电极用1wt％bsa钝化1-1.2小时，以减少非特异性吸附并在室温下自然干燥。在用tris-hcl缓冲液冲洗后，将电极与13-17μlag/znmof-p2缀合物在36.5-37.5℃温育1.8-2.2小时，通过dna碱基的互补配对将ag/znmof引入生物传感器。为了进行模拟酶促催化沉淀反应，将得到的电极（ag/znmof-p2-bsa-p1-au-ws2/tm）与含有0.01mh2o2的0.8-1.2mg·ml^-1dab溶液在室温下孵育4-6分钟。之后，pec测量在0.01mtris-hcl缓冲液中进行，在300w氙灯下照射，根据光电化学生物传感器光电信号变化对博莱霉素进行检测。

如图1所示，基于ag/znmof-p2-bsa-p1-au-ws2/tm光电极建立了一个新的平台用于blm的超灵敏检测；

如图2所示，示出了所提出的pec生物传感器的光生电子-空穴转移机制；

如图3所示，通过sem和tem图像研究了ws2，aunps，znmof和ag/znmof的形态。图3a显示ws2的sem图像，其显示均匀的纳米阵列状态。图3b中的ws2的tem图像对应于图3a，进一步揭示了ws2的纳米棒结构。图3b插图中的hrtem图像显示ws2纳米棒的晶面间距为0.618nm，对应于ws2的（002）面。通过tem表征aunp的尺寸和颗粒分布。如图3c所示，测量aunp的平均尺寸为约18nm，其呈现均匀的球形。在图3c中插图显示aunps的晶面间距为0.24nm，可以指向au（111）晶面。znmof的sem图像显示在图3d中，表明其片状结构。通过图3e中的tem图像证实agnps在znmof材料上的沉积，证明了ag/znmof复合物的成功合成；

如图4a和4b所示，ws2的xps测量光谱表明存在w和s元素，这证明了ws2的成功制备。如图4c所示，显示了ws2的x射线粉末衍射（xrd）图案。衍射峰在14.3^o，33.8^o，39.5^o，49.7^o，55.8^o，58.4^o，60.9^o和61.9^o可以分别指向ws2（jcpdsno.08-0237）的（002），（101），（103），（105），（106），（008），（112）和（007）平面。如图4d所示，ft-ir光谱证明了ag/znmof的成功制备。

如图5a，为了进一步研究逐步制造过程，还通过pec方法表征电极。使用通过用间歇可见的入射光照射改性的tm电极产生的光电流来表征制备的纳米材料的pec特性。ws2/tm电极（曲线a）光电流信号约为31.7μa，这表明ws2在pec生物传感应用中具有优异的光活性。在ws2/tm电极上进一步修改aunp后，光电流增强（曲线b，72.9μa）。这可能是由于aunps的lspr效应提高了光电转换效率，激发了ws2中的电子空穴对将等离子体能量从aunp转移到ws2。在电极上孵育bsa和ag/znmof-p2后，光电流响应逐渐降低（曲线c和d），因为来自蛋白质的空间位阻效应的电荷转移能力差。此外，还可以证明ag/znmof-p2缀合物在电极表面上的成功沉积。当用dab和h2o2孵育ag/znmof-p2-bsa-p1-au-ws2/tm时，光电流显着降低至18.7μa（曲线e），这归因于在电极表面上催化的ag/znmof的沉淀。在存在具有fe²⁺的blm的情况下，经历了不可逆的p2断裂，导致光电流增加至57.3μa（曲线f）。为了评估传感器组件的电极表面的电子转移，使用[fe（cn）6]^3-/4-作为氧化还原探针，通过奈奎斯特图的半圆直径测量eis（图5b）。如曲线a和b所示，p1-au/ws2/tm的奈奎斯特图显示出比ws2/tm小得多的半圆直径，可能是由于aunps的良好导电性改善了[fe（cn）6]^3-/4-的电子转移。在p1-au-ws2/tm电极上组装bsa后，电阻值（曲线c）略有变化。当ag/znmof-p2组装在bsa-p1-au-ws2/tm电极上时（曲线d），电阻值增加。将ag/znmof-p2-bsa-p1-au-ws2/tm与dab和h2o2一起温育后，电阻值进一步增加。由于h2o2的存在下ag/znmof催化氧化dab，产生不溶性绝缘，产物会阻碍[fe（cn）6]^3-/4-扩散和电子转移到电极表面（曲线e）。当添加blm·fe²⁺时，电阻值显着降低（曲线f），由于blm·fe²⁺特异性剪切p2使ag/znmof-p2与bsa-p1-au-ws2/tm电极表面解离。这证明了pec生物传感器的成功制造。

如图6所示，配置不同浓度的blm水溶液，测试光电化学生物传感器对不同浓度blm的电流响应曲线，看以看出，blm浓度之间呈现较好的相关性，线性回归方程为a=19.38+0.09cblm(r²=0.991)，在s/n=3时检测下限为0.18nm。

对于新制备的传感体系，需要在分析实际样品时对目标分析物具有良好的选择性，为了验证新制备的光电化学生物传感器对blm信号放大的特异性，我们使用几种抗肿瘤药物（包括柔红霉素，丝裂霉素和放线菌素）的比较进行光电流响应评估，在相同的条件下，测试该传感器对blm的选择性。由图7a可以看出，与其他几种抗肿瘤药物相比，blm具有最好的选择性,这表明该生物检测的选择性良好，具有高度特异可用于实际样本的检测。另外，当重复打开可见光照射时，pec探针的光电流强度几乎保持恒定（图7b）。这些结果支持该适体传感器用于敏感pec测定的可行性，表明该方法对于检测blm具有良好的选择性和稳定性。

另外，为了评价pec生物传感器的潜在实际应用价值，设计了一种人血清中blm·fe²⁺的回收试验。实验结果表明，pec生物传感器在实际样品中检测blm的回收率较高，该策略为blm分析在临床研究中的应用提供了一个潜在的应用前景。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。