一种生物土壤结皮多糖的检测方法与流程

本发明涉及多糖测定技术领域，特别涉及一种生物土壤结皮多糖的检测方法。

背景技术：

干旱地区面积占到全球陆地面积的41％，更是贮存了全球27％的有机碳及95％的无机碳。据统计，全球荒漠地区贮存的c量约为10×10¹⁵g，而其中高达56×10¹²gc贮存于生物土壤结皮(biologicalsoilcrusts，bscs)的蓝藻生物量中。bscs是由蓝藻、地衣、苔藓等生物胶结、捆绑土壤颗粒从而在地表形成的生物土壤复合层，具有改善土壤水分条件、沃土增肥等重要的生态功能。

生物土壤结皮可分为藻结皮，地衣结皮和藓结皮。其中，藻结皮是后续地衣结皮和藓结皮形成的初始阶段及先决条件。而具鞘微鞘藻作为藻结皮的优势藻种，其分泌的胞外多糖，是结皮的主要胶结物质，即，多糖含量越高，结皮强度越大，稳定地表、防风固沙的能力越强。胞外多糖主要分为两个部分：一为与藻丝粘附紧密的鞘多糖(cps)，二为粘附不紧密、释放到土壤中的释放多糖(rps)。两种形式的多糖在生物土壤结皮中所发挥的作用及生态功能有所差异。鞘多糖对于蓝藻抵抗干旱、紫外及氧化损伤等胁迫均具有重要意义；释放多糖能够将土壤颗粒粘附起来形成聚合体结构，进而增加荒漠地区土地结构的稳定性。

目前，已有一些关于生物土壤结皮胞外多糖的形态及总含量的研究，但是关于生物土壤结皮胞外多糖组分的测定相对较少，且对多糖的测定，目前主要通过对生物土壤结皮进行简单处理，然后，采用气相色谱法、液相色谱法、亲和色谱、离子色谱、酶学法和毛细管电泳法等进行多糖的测定，其普遍存在灵敏度和准确度不高的问题。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明旨在提出一种生物土壤结皮多糖的检测方法，以解决现有生物土壤结皮多糖检测灵敏度和准确度不高的问题。

为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：

一种生物土壤结皮多糖的检测方法，包括以下步骤：

1)采用水提醇沉法提取待测生物土壤结皮中的多糖；

2)将所述多糖与酸溶液混合后，水浴加热，进行水解反应，待所述水解反应结束后，将水解反应得到的水解液用氮气吹干，得到单糖组分；

3)采用糖腈乙酸酯衍生化法对所述单糖组分进行衍生化处理，得到单糖离子化组分a；

4)采用三甲基硅烷衍生化法对所述单糖组分进行衍生化处理，得到单糖离子化组分b；

5)将所述单糖离子化组分a和所述单糖离子化组分b用有机溶剂稀释后，采用气相色谱-质谱分析法和内标法对所述单糖离子化组分a和所述单糖离子化组分b进行定性定量分析。

可选地，所述步骤1)中采用水提醇沉法提取待测生物土壤结皮中的多糖，包括：

将待测生物土壤结皮研磨、过筛后，水浴离心，然后，加入乙醇并加热脱脂，随后，用乙醇洗脱，再用水浴提取法提取，得到粗多糖提取液；

将所述粗多糖提取液抽滤浓缩后，加入乙醇，醇沉粗多糖，待粗多糖醇沉结束后，离心，得到粗多糖沉淀；

采用sevag法除去所述粗多糖沉淀中的蛋白，然后，透析，冷冻干燥，得到待测生物土壤结皮中的多糖。

可选地，所述水浴离心，包括：在40℃水浴下振荡2h后，以8000r/min的转速离心，去除上清液；

所述加入乙醇并加热脱脂，包括：加入80％乙醇并在80℃下冷凝回流6h；

所述水浴提取法提取，包括：按照90∶1的水料比，在80℃水浴下，提取3次，每次提取4h；

所述加入乙醇，醇沉粗多糖，包括：加入所述粗多糖提取液四倍体积的95％乙醇，醇沉粗多糖；

所述sevag法中sevag试剂包括三氯甲烷和正丁醇，且所述三氯甲烷和所述正丁醇的体积比为3∶1，所述sevag试剂与所述粗多糖提取液的体积比为1∶3。

可选地，所述步骤2)中所述酸溶液为三氟乙酸，且所述酸溶液的浓度为2-4mol/l；所述步骤2)中所述水浴加热的加热温度为90-120℃，加热时间为2-4h；所述步骤2)中所述氮气吹干的吹干温度为70℃，氮气进气量为0.5ml/min。

可选地，所述步骤3)中采用糖腈乙酸酯衍生化法对所述单糖组分进行衍生化处理，得到单糖离子化组分a，包括：

向所述单糖组分中加入盐酸羟胺、肌醇和吡啶，然后，进行第一次水浴加热，待所述第一次水浴加热结束后，加入乙酸酐，进行第二次水浴加热，待所述第二次水浴加热结束后，将所述第二次水浴加热得到的反应物用氮气吹干，得到单糖离子化组分a。

可选地，所述第一次水浴加热的加热温度为80-110℃，加热时间为1-2h；所述第二次水浴加热的加热温度为80-110℃，加热时间为2-3h。

可选地，所述步骤4)中采用三甲基硅烷衍生化法对所述单糖组分进行衍生化处理，得到单糖离子化组分b，包括：

向所述单糖组分中加入肌醇、吡啶、六甲基二硅胺烷、三甲基氯硅烷，然后，水浴加热，待所述水浴加热结束后，将所述水浴加热得到的反应物用氮气吹干，得到单糖离子化组分b。

可选地，所述水浴加热的加热温度为80℃，加热时间为20min。

可选地，所述步骤5)中将所述单糖离子化组分a和所述单糖离子化组分b用有机溶剂稀释后，采用气相色谱-质谱分析法和内标法对所述单糖离子化组分a和所述单糖离子化组分b进行定性定量分析，包括：

所述单糖离子化组分a标准曲线的制作：称取鼠李糖标准品、阿拉伯糖标准品、岩藻糖标准品、木糖标准品、甘露糖标准品、葡萄糖标准品、半乳糖标准品各0.5-1.0mg、1.0-1.5mg、1.5-2.0mg、2.0-2.5mg，并加入内标物，然后，用糖腈乙酸酯衍生化方法衍生化处理，以内标物与单糖峰面积之比为纵坐标，以内标物与单糖质量之比为横坐标制作单糖离子化组分a标准曲线；

所述单糖离子化组分b标准曲线的制作：称取果糖标准品、葡萄糖醛酸标准品、半乳糖醛酸标准品各0.5-1.0mg、1.0-1.5mg、1.5-2.0mg、2.0-2.5mg，并加入内标物，然后，用三甲基硅烷衍生化方法衍生化处理，以内标物与单糖峰面积之比为纵坐标，以内标物与单糖质量之比为横坐标制作单糖离子化组分b标准曲线；

单糖离子化组分a待测液的制备：向所述单糖离子化组分a中加入三氯甲烷溶解，并将溶解液稀释、过滤，得到单糖离子化组分a待测液；

单糖离子化组分b待测液的制备：向所述单糖离子化组分b中加入正己烷溶解，并将溶解液稀释、过滤，得到单糖离子化组分b待测液；

单糖组分的测定：采用气相色谱-质谱分析法对所述单糖离子化组分a待测液和所述单糖离子化组分b待测液进行单糖组分测定，并将所述单糖离子化组分a待测液和所述单糖离子化组分b待测液的测定结果与相对应的所述单糖离子化组分a标准曲线和所述单糖离子化组分b标准曲线进行比对，以对所述单糖离子化组分a和所述单糖离子化组分b进行定性定量分析。

可选地，所述采用气相色谱-质谱分析法对所述单糖离子化组分a待测液进行单糖组分测定中的检测条件为：载气：99.9％氦气；体积流量：1ml/min；分流比：30∶1；进样口温度：220℃；程序升温梯度：起始温度为100℃，以10℃/min的速度升至160℃，保持2min，以5℃/min的速度升至170℃，保持1min，以1℃/min的速度升至180℃，保持1min，以1℃/min的速度升至185℃，保持1min，以1℃/min的速度升至190℃，保持1min，以10℃/min的速度升至220℃，保持5min；离子源温度：230℃；前进样口温度：250℃；

所述采用气相色谱-质谱分析法对所述单糖离子化组分b待测液进行单糖组分测定中的检测条件为：体积流量：1ml/min；分流比：20∶1；进样量：1ul；溶剂延迟时间：5min；进样口温度：250℃；传输管路温度：250℃；梯度升温程序：起始温度为80℃，保持3min，以10℃/min的速度升至250℃，保持10min；

所述气相色谱-质谱分析法中质谱分析条件为：溶剂延迟：7min；ei能量：70ev；离子源温度：230℃；四级杆温度：150℃。

相对于现有技术，本发明所述的生物土壤结皮多糖的检测方法具有以下优势：

本发明的生物土壤结皮多糖的检测方法，一方面，采用水提醇沉法对生物土壤结皮胞外多糖进行提取，提取方法经济快捷，设备简单，多糖产率高，另一方面，同时采用糖腈乙酸酯衍生化和三甲基硅烷衍生化方法对提取后水解的多糖进行衍生化处理，可检测不同种类的单糖，确保了检测的全面性，另外，采用气相色谱-质谱分析法和内标法对衍生化处理后单糖组分进行定性定量分析，三者共同作用，使得采用本发明的生物土壤结皮多糖的检测方法对多糖进行检测具有较高的灵敏度和精确度，同时，本发明检测方法易于实现，从而使得本发明易于推广和应用。

附图说明

构成本发明的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1为本发明实施例1的生物土壤结皮形态；

图2为本发明实施例1的糖腈乙酸酯衍生化混合标准单糖总离子图；

图3为本发明实施例1的糖腈乙酸酯衍生化混合标准单糖停留时间以及峰面积；

图4为本发明实施例1的三甲基硅烷衍生化混合标准单糖总离子流图；

图5为本发明实施例1的糖腈乙酸酯衍生化样品停留时间总离子流图；

图6为本发明实施例1的糖腈乙酸酯衍生化样品停留时间及峰面积；

图7为本发明实施例1的三甲基硅烷衍生化样品停留时间总离子流图。

具体实施方式

需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

下面将结合附图和实施例来详细说明本发明。

实施例1

一种生物土壤结皮多糖的检测方法，具体包括以下步骤：

1)样品采集和保存：利用无菌铲采集荒漠地区生物土壤结皮，其形态如图1所示，于无菌塑料平皿保存，并尽快运回，运回过程中，粘结捆绑，尽量将其固定，且运输过程中保证其平稳，不出现大的波动，以保证其结构不受破坏，运回后将其放在阴凉处保存，置于干燥的密封罐中，用凡士林密封罐口；

2)采用水提醇沉法提取待测生物土壤结皮中的多糖：将5g待测生物土壤结皮用研磨、过80目筛，除去树叶等杂质后，在40℃水浴下振荡2h，并以8000r/min的转速离心，去除上清液，以除去结皮中松散结合的胞外多糖物质(rps)，然后，加入80％乙醇并在80℃下冷凝回流6h，脱去脂质，随后，用80％乙醇洗脱2-3次，再按照90∶1的水料比，在80℃水浴下，提取3次，每次提取4h，得到粗多糖提取液，其中，水料比是指水浴提取过程中的水和用80％乙醇洗脱2-3次后的物质的质量比；

将粗多糖提取液抽滤浓缩至粗多糖提取液原体积的1/4后，加入粗多糖提取液四倍体积的95％乙醇，使浓缩物中的粗多糖沉淀出来(醇沉粗多糖)，待粗多糖醇沉结束后，将醇沉得到的物质放置在离心管中以6000r/min的转速离心15min，除去乙醇上清液，得到粗多糖沉淀；

采用sevag法除去粗多糖沉淀中的蛋白，其中，sevag法中sevag试剂包括体积比为3∶1的三氯甲烷和正丁醇，且sevag试剂与粗多糖提取液的体积比为1∶3，然后，对除去蛋白后的粗多糖沉淀进行透析，透析时间为24h，去除小分子离子，随后，在-55℃的温度和0.05-0.1kpa的干燥真空度下，对透析后的提取物冷冻干燥12h，得到干燥的待测生物土壤结皮中的多糖，经测试知，本实施例的多糖产率为695.2ug/mg；

3)将多糖与三氟乙酸(酸溶液)混合后置于安培瓶中并密封，将安培瓶放入100℃的水浴锅水浴加热2h，进行水解反应，待水解反应结束后，将水解反应得到的水解液用氮气吹干，其中，吹干过程中，吹干温度为70℃，氮气进气量为0.5ml/min，得到单糖组分，其中，当采用糖腈乙酸酯衍生化法对单糖组分进行衍生化处理时，将1mg多糖与2ml浓度为2mol/l的三氟乙酸(酸溶液)混合后置于安培瓶中并密封，当采用三甲基硅烷衍生化法对所述单糖组分进行衍生化处理时，将2mg多糖与2ml浓度为3mol/l的三氟乙酸(酸溶液)混合后置于安培瓶中并密封；

4)采用糖腈乙酸酯衍生化法对单糖组分进行衍生化处理，得到单糖离子化组分a：向单糖组分中加入20mg盐酸羟胺、2.1mg肌醇和1ml吡啶，然后，于90℃的水浴锅中水浴加热1h(第一次水浴加热)，待第一次水浴加热结束后，加入1ml乙酸酐，于90℃的水浴锅中水浴加热2h(第二次水浴加热)，待第二次水浴加热结束后，将第二次水浴加热得到的反应物用氮气吹干，得到单糖离子化组分a；

5)采用三甲基硅烷衍生化法对所述单糖组分进行衍生化处理，得到单糖离子化组分b：向单糖组分中加入2.5mg肌醇、2ml吡啶、4ml六甲基二硅胺烷、2ml三甲基氯硅烷，密封后在80℃下水浴加热20min，待水浴加热结束后，将水浴加热得到的反应物(硅烷衍生化产物)用氮气吹干，吹干温度控制在20-30℃，得到单糖离子化组分b；

6)将单糖离子化组分a和单糖离子化组分b用有机溶剂稀释后，采用气相色谱-质谱分析法和内标法对单糖离子化组分a和单糖离子化组分b进行定性定量分析：

单糖离子化组分a标准曲线的制作：依次精密称取鼠李糖标准品、阿拉伯糖标准品、岩藻糖标准品、木糖标准品、甘露糖标准品、葡萄糖标准品、半乳糖标准品各0.5-1.0mg、1.0-1.5mg、1.5-2.0mg、2.0-2.5mg，置于四个不同安培瓶中形成四个混标(每个混标均含有上述7种单糖标准品，且各个单糖标准品的质量相同，如第一个混标由质量均为0.5-1.0mg的7种单糖标准品构成，第二个混标由质量均为1.0-1.5mg的7种单糖标准品构成，以此类推)，每个安培瓶中均加入2.5mg内标物肌醇，然后，用糖腈乙酸酯衍生化方法衍生化处理，并采用气相色谱-质谱分析法(gc-ms)对四个混标进行测试，测试结果如图2和图3所示，以内标物与单糖峰面积之比为纵坐标，以内标物与单糖质量之比为横坐标制作单糖离子化组分a标准曲线，其中，单糖离子化组分a标准曲线如表1所示；

单糖离子化组分b标准曲线的制作：依次精密称取称取果糖标准品、葡萄糖醛酸标准品、半乳糖醛酸标准品各0.5-1.0mg、1.0-1.5mg、1.5-2.0mg、2.0-2.5mg，置于四个不同安培瓶中形成四个混标(每个混标均含有上述3种单糖标准品，且各个单糖标准品的质量相同，如第一个混标由质量均为0.5-1.0mg的3种单糖标准品构成，第二个混标由质量均为1.0-1.5mg的3种单糖标准品构成，以此类推)，每个安培瓶中均加入2.5mg内标物肌醇，然后，用三甲基硅烷衍生化方法衍生化处理，并采用气相色谱-质谱分析法(gc-ms)对四个混标进行测试，测试结果如图4所示，以内标物与单糖峰面积之比为纵坐标，以内标物与单糖质量之比为横坐标制作单糖离子化组分b标准曲线；

单糖离子化组分a待测液的制备：向单糖离子化组分a中加入5ml三氯甲烷溶解，并将10ul溶解液稀释至1ppm，用0.22um滤头过滤后，得到单糖离子化组分a待测液，将其置于进样小瓶中准备进样；

单糖离子化组分b待测液的制备：向单糖离子化组分b中加入正己烷溶解，并将溶解液稀释至1ppm，用0.22um滤膜过滤后，得到单糖离子化组分b待测液，将其置于进样小瓶中准备进样；

单糖组分的测定：采用气相色谱-质谱分析法(gc-ms)对单糖离子化组分a待测液进行单糖组分测定，并将单糖离子化组分a待测液与单糖离子化组分a标准曲线进行比对，以对单糖离子化组分a进行定性定量分析，测试结果如表2和图5、图6所示，其中，gc-ms系统为：agilent5977bgc/msd，gc-ms检测条件为：载气：99.9％氦气；体积流量：1ml/min；分流比：30∶1；进样口温度：220℃；程序升温梯度：起始温度为100℃，以10℃/min的速度升至160℃，保持2min，以5℃/min的速度升至170℃，保持1min，以1℃/min的速度升至180℃，保持1min，以1℃/min的速度升至185℃，保持1min，以1℃/min的速度升至190℃，保持1min，以10℃/min的速度升至220℃，保持5min；离子源温度：230℃；前进样口温度：250℃；sim扫描定性离子为：103.0，115.0，127.0，145.0，157.0，187.1，212.1，225.1，314.1；sim扫描时间段为：16-20min，27-32min；

采用气相色谱-质谱分析法对单糖离子化组分b待测液进行单糖组分测定，并将单糖离子化组分b待测液的测定结果与单糖离子化组分b标准曲线进行比对，以对单糖离子化组分b进行定性定量分析，测试结果如图7所示，其中，gc-ms系统为：agilent5977bgc/msd，gc-ms检测条件为：体积流量：1ml/min；分流比：20∶1；进样量：1ul；溶剂延迟时间：5min；进样口温度：250℃；传输管路温度：250℃；梯度升温程序：起始温度为80℃，保持3min，以10℃/min的速度升至250℃，保持10min；sim扫描中定性离子为73.0，147.0，191.0，204.0，217.0。

另外，采用气相色谱-质谱分析法和内标法对单糖离子化组分a和单糖离子化组分b进行定性定量分析过程中，质谱分析条件为：溶剂延迟：7min；ei能量：70ev；离子源温度：230℃；四级杆温度：150℃；全扫范围为：m/z50-500amu。

由表2和图5、图6可知，采用本实施例的检测方法测得本实施例样品中多糖的各单糖摩尔比为：鼠李糖∶阿拉伯糖∶岩藻糖∶木糖∶甘露糖∶葡萄糖∶半乳糖＝1.42∶1.19∶0.998∶1.34∶0.726∶2.86∶1.25，生物土壤结皮胞外多糖中葡萄糖，鼠李糖，木糖，半乳糖占比较高。

经过三甲基硅烷衍生化处理样品(单糖离子化组分b待测液)并用gc-ms进行定性定量检测后发现生物土壤结皮中检测不到果糖，葡萄糖醛酸，半乳糖醛酸。

表1

表2

以上仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。