一种南柴胡注射液的质量控制方法与流程

本发明属于中药注射液的质量控制方法，具体涉及一种南柴胡注射液的质量控制方法。
背景技术：
：柴胡注射液具有清热解表之功效，用于治疗感冒、流行性感冒及疟疾等的发热。它的临床应用非常广泛，为我国第一个研制出来的中药注射液，是清热解表类常用中成药。目前市场上流通的柴胡主要有北柴胡、南柴胡和竹叶柴胡，因品种不同，其主要成分和含量区别较大，因此制备的注射液无法采用统一的检测方法进行质量评价。目前2015版中国兽药典中柴胡质量标准针对的主要是北柴胡注射液，缺乏南柴胡注射液的质控手段，而2017版兽药质量标准-中药卷中尽管有南柴胡注射液的质量标准，但其对南柴胡注射液的质量控制方法主要是检查吸光度和ph值。经过大量文献的检索及实验研究发现，南柴胡注射液质量标准的〔检查〕项在277nm测定的吸光度主要是有毒成分糠醛和5-甲基糠醛等的贡献。标准规定吸光度应不小于0.45，造成企业为保证吸光度合格，采用酸-盐或加碱条件下提取南柴胡挥发油或长时间加热，导致中间产物糠醛和5-甲基糠醛的产生。糠醛(c5h4o2)又称2-呋喃甲醛，属中等毒性物质，其蒸汽具有强烈的刺激性，并有麻醉作用。动物吸入、摄入或经皮肤吸收均可引起急性中毒，表现有呼吸道刺激、肺水肿、肝损害、中枢神经系统损害、呼吸中枢麻痹以致死亡。糠醛在大鼠经口摄入时其急性毒性半数致死剂量(ld50)为127mg·kg-1；在其亚急性和慢性毒性时，如人长期处于糠醛浓度为5～16mg·l-1的环境中，会发生黏膜刺激、结膜炎、流泪、头痛。糠醛还具有一定的致畸、致突变性，可诱发精子畸形。此外，该检测方法无专属性鉴别和含量测定等有效的质量控制方法，加之南柴胡注射液为南柴胡药材经蒸馏所得芳香水，主要含挥发油成分，其质量更加不稳定，严重影响了南柴胡注射液的临床疗效和安全性。因此，目前需要一种准确有效的方法对南柴胡注射液进行质量控制，并能将其与其他柴胡品种制备的注射液进行有效区分。技术实现要素：本发明的目的在于解决上述技术问题，提供一种南柴胡注射液的质量控制方法，所述方法应用中药指纹图谱和南柴胡的含量测定技术，具有重复性好，稳定性高等优点，可有效监控南柴胡注射液的质量，提升南柴胡注射液临床使用的稳定性和安全性。为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：本发明提供了一种南柴胡注射液的质量控制方法，包括如下步骤：(1)气相色谱法建立南柴胡注射液对照指纹图谱：以5％二苯基-95％二甲基聚硅氧烷(sh-rtx-5)为固定相的毛细管柱(柱长为30m，内径为0.32mm，膜厚度为0.25μm)，柱温为程序升温，用氢火焰离子化检测器检测，检测器温度250-270℃，进样口温度220-250℃，分流进样，分流比为20:1，载气为氮气，流速为每分钟2.0ml，顶空进样，将至少8批南柴胡注射液供试品注入气相色谱仪，记录色谱图，利用中药指纹图谱相似度评价软件生成南柴胡注射液对照指纹图谱；(2)按步骤(1)方法分别测定南柴胡注射液、北柴胡注射液和竹叶柴胡注射液检测样品的指纹图谱；(3)计算南柴胡注射液、北柴胡注射液和竹叶柴胡注射液检测样品的指纹图谱与对照指纹图谱的相似度，南柴胡注射液检测样品的相似度应不小于0.75；(4)考察并计算不同产地的南柴胡注射液4号峰(相对保留时间0.547±8％min)和6号峰(相对保留时间1.881±8％min)的峰面积，其注射液中4号峰与参照物溶液(20ug/ml)峰峰面积比值应为0.4-4.0，6号峰与参照物溶液(20ug/ml)峰峰面积比值应为0.25-2.5；(5)南柴胡注射液检测样品都满足步骤(3)和步骤(4)的要求，即为合格产品。作为本发明优选的实施方案，所述程序升温的条件为：初始温度为35℃，保持2min，以每分钟1℃升温至40℃，保持2min，以每分钟3℃升温至60℃，保持3min，以每分钟7℃升温至100℃，保持3min，以每分钟20℃升温至250℃，保持2min。作为本发明优选的实施方案，所述顶空进样的条件为：顶空瓶平衡温度80-90℃，平衡时间为10-30min，进样阀温度100-120℃，传输线温度115-125℃，顶空瓶充压时间1-3min，定量环填充时间0.1-0.5min，定量环平衡时间0.3-1.5min，进样时间0.5-1.5min。作为本发明优选的实施方案，所述南柴胡注射液供试品制备方法为：精密量取南柴胡注射液1ml，置5ml顶空瓶中，加盖密封瓶口，即得南柴胡注射液供试品溶液。作为本发明优选的实施方案，所述参照物溶液制备方法为：取正己醛对照品适量，精密量取，加稀释液(含0.3％吐温-80和0.9％氯化钠)溶解并稀释，制成每1ml约含20ug的溶液，精密量取1ml，置5ml顶空瓶中，密封瓶口，即得。作为本发明优选的实施方案，所述南柴胡注射液、北柴胡注射液和竹叶柴胡注射液检测样品按照南柴胡注射液供试品制备方法制备。作为本发明优选的实施方案，所述南柴胡注射液的制备方法为：取道地南柴胡药材1000g(产地：陕西、黑龙江)，冲洗干净，干燥，粉成粗粉，加纯化水10000ml，80℃温浸6h。经水蒸气蒸馏(保持提取温度为100℃，避免暴沸)，收集初馏液5300ml，再重新蒸馏，收集重馏液约1000ml。加入3g吐温-80，加热搅拌使油完全溶解，再加入氯化钠9g，溶解后，滤过，加注射用水至1000ml，用10％氢氧化钠溶液调节ph值至6.5，用微孔滤膜(0.45um)滤过，灌封，121℃灭菌20min，即得南柴胡注射液。作为本发明优选的实施方案，所述北柴胡注射液和竹叶柴胡注射液的制备方法按照南柴胡注射液的制备方法制备。综上，与现有技术相比，本发明具有的有益效果为：本发明通过建立南柴胡注射液的指纹图谱，应用指纹图谱和含量测定对南柴胡注射液的质量进行质控，具有重复性好，稳定性高等优点，可有效监控南柴胡注射液的质量，提升南柴胡注射液临床使用的稳定性和安全性。说明书附图图18批南柴胡注射液样品指纹图谱叠加图；图2南柴胡注射液对照指纹图谱；图3不同气相色谱仪检测的南柴胡注射液指纹图谱；图4南柴胡注射液精密度考察图谱；图5南柴胡注射液日间精密度考察图谱；图6南柴胡注射液稳定性考察；图7南柴胡注射液重复性考察；图8南、北和竹叶柴胡注射液指纹图谱相似度评价；图9不同企业南、北柴胡注射液指纹图谱相似度评价；图10不同品种柴胡的tic图谱差异；图11不同品种柴胡的指纹图谱差异；图12本发明方法与其他方法建立的指纹图谱差异。具体实施方式下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细描述。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本
发明内容所实现的技术均属于本发明的范围。实验例1一、南柴胡注射液对照指纹图谱建立1、检测方法的选择：南柴胡注射液主要含挥发性成分，故采用gc-fid法建立指纹图谱；2、色谱柱筛选：分别对sh-rtx-5(30m×0.32mm×0.25μm)；agilenthp-5(30m×0.32mm×0.25μm)两种色谱柱进行了考察，结果表明sh-rtx-5毛细管柱(固定相为5％二苯基-95％二甲基聚硅氧烷)分离效果最好，更适合于南柴胡注射液指纹图谱的检测。3、色谱条件、参照物溶液及供试品溶液的制备：以5％二苯基-95％二甲基聚硅氧烷(sh-rtx-5)为固定相的毛细管柱(柱长30m，内径为0.32mm，膜厚度为0.25μm)，柱温为程序升温，初始温度为35℃，保持2min，以每分钟1℃升温至40℃，保持2min，以每分钟3℃升温至60℃，保持3min，以每分钟7℃升温至100℃，保持3min，以每分钟20℃升温至250℃，保持2min；用氢火焰离子化检测器检测，检测器温度250℃；进样口温度220℃，分流进样，分流比为20:1。载气为氮气，流速为每分钟2.0ml。顶空进样，顶空瓶平衡温度85℃，平衡时间为15min，进样阀温度100℃，传输线温度115℃；顶空瓶充压时间2min，定量环填充时间0.2min，定量环平衡时间0.5min，进样时间1.0min。理论板数按参照物溶液正己醛峰计算应不低于40000。参照物溶液的制备：取正己醛对照品适量，精密量取，加稀释液(含0.3％吐温-80和0.9％氯化钠)溶解并稀释，制成每1ml约含20ug的溶液，精密量取1ml，置5ml顶空瓶中，密封瓶口，即得。供试品溶液的制备：取南柴胡1000g，粗粉，加水10000ml，80℃温浸6h。经水蒸气蒸馏(保持提取温度为100℃，避免暴沸)，收集初馏液5300ml，再重新蒸馏，收集重馏液约1000ml。加入3g吐温-80，搅拌使油完全溶解，再加入氯化钠9g，溶解后，滤过，加注射用水至1000ml，用10％氢氧化钠溶液调节ph值至6.5，用微孔滤膜(0.45um)滤过，灌封，灭菌，即得。精密量取1ml注射液置于5ml顶空瓶中，密封瓶口，即得。测定法：分别精密量取参照物溶液和供试品溶液顶空瓶气体，注入气相色谱仪，测定，即得。4、南柴胡注射液对照指纹图谱的建立南柴胡注射液制备方法：取道地南柴胡药材1000g(产地：陕西、黑龙江)，冲洗干净，干燥，粉成粗粉，加纯化水10000ml，80℃温浸6h。经水蒸气蒸馏(保持提取温度为100℃，避免暴沸)，收集初馏液5300ml，再重新蒸馏，收集重馏液约1000ml。加入3g吐温-80，加热搅拌使油完全溶解，再加入氯化钠9g，溶解后，滤过，加注射用水至1000ml，用10％氢氧化钠溶液调节ph值至6.5，用微孔滤膜(0.45um)滤过，灌封，121℃灭菌20min，即得南柴胡注射液。南柴胡注射液供试品溶液的制备：精密量取南柴胡注射液1ml，置5ml顶空瓶中，加盖密封瓶口，即得南柴胡注射液供试品溶液。按南柴胡注射液制备方法制备8个批次的注射液，测定南柴胡注射液供试品的指纹图谱，8批南柴胡注射液的指纹图谱叠加图见图1，采用相似度评价软件对8批样品指纹图谱进行相似度计算。结果见表1。表18批南柴胡注射液指纹图谱相似度计算结果利用相似度评价系统软件生成南柴胡注射液对照指纹图谱，如图2。各共有峰以正己醛峰(峰5)为参照峰，计算各特征峰与正己醛峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的8％之内，规定值：0.265(1号峰)、0.294(2号峰)、0.362(3号峰)、0.547(4号峰)、1.000(正己醛峰)、1.881(6号峰)。二、南柴胡注射液的方法学考察1、不同气相色谱仪对色谱峰的影响考察了不同气相色谱仪对色谱峰的影响，结果表明：三台不同的岛津气相色谱仪所测得的色谱峰无明显差异，相似度均大于0.95。结果见图3。2、精密度连续进样5针，5针之间相似度均为0.999，结果表明进样精密度良好。同时还考察了日间精密度，在不同日期、人员，对相同批次的样品进行指纹图谱检测，计算相似度，结果表明本品指纹图谱测定日间精密度良好(日间精密度rsd均<0.20％)。结果见图4、图5。3、稳定性南柴胡注射液供试品溶液在室温下放置0、2、4、6、8、12h测定结果，各时间点相似度的rsd为0.10％。结果表明：在室温下放置12h，供试品稳定性良好。结果见图6。4、重复性考察了6份样品的测定结果，各样品指纹图谱相似度rsd为0.05％，表明本方法重复性良好，结果见图7。三、南柴胡注射液相似度分析和含量测定1、南、北和竹叶柴胡注射液指纹图谱相似度分析按南柴胡注射液的制备方法分别制备3个批次的北柴胡注射液和竹叶柴胡注射液。采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004a版，对南、北和竹叶柴胡注射液指纹图谱进行相似度评价和计算，结果见图8和表2。表2南、北和竹叶柴胡注射液指纹图谱相似度测定结果序号名称(批号)相似度(标准图谱)1南柴胡注射液(20190601)0.9942南柴胡注射液(20190501)0.9923南柴胡注射液(20190502)0.9944北柴胡注射液(20190501)0.4335北柴胡注射液(20190502)0.4326北柴胡注射液(20190503)0.4287竹叶柴胡注射液(20190501)0.3948竹叶柴胡注射液(20190502)0.3989竹叶柴胡注射液(20190503)0.41510南柴胡注射液(半年加速)0.80511南柴胡注射液(半年加速)0.8032、不同企业南、北柴胡注射液相似度分析采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004a版，对不同企业生产的南、北柴胡注射液指纹图谱进行相似度评价和计算，其中，南柴胡注射液(恒通)即是采用本发明所述方法制备的南柴胡注射液。结果见图9和表3。表3不同企业南、北柴胡注射液指纹图谱相似度测定结果序号名称(企业)相似度(参照图谱)1南柴胡注射液(恒通)0.9962南柴胡注射液(恒通)0.9933北柴胡注射液(恒通)0.6824北柴胡注射液(恒通)0.6875南柴胡注射液(某公司1)0.8356南柴胡注射液(某公司2)0.8377南柴胡注射液(某公司3)0.1798南柴胡注射液(某公司4)0.1809北柴胡注射液(某公司5)0.66210北柴胡注射液(某公司6)0.658对上述南、北及竹叶柴胡注射液、不同企业的南、北柴胡注射液和半年加速试验样品的指纹图谱进行检测，并采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004a版对各样品指纹图谱进行相似度计算，结果表明：用中药指纹图谱相似度评价系统计算相似度，南柴胡注射液样品指纹图谱与标准指纹图谱比较，相似度应不得小于0.75。3、南柴胡注射液含量测定(增加4号峰和6号峰的相对含量比值)按照上述南柴胡注射液制法要求对不同产地差异较大的南柴胡进行注射液的制备并进行稳定性考察(6个月加速试验)，记录4号峰和6号峰的峰面积，计算其与参照物(20ug/ml)峰峰面积的比值，为其质控中比值范围的确定提供数据支持。结果见表4。表4南柴胡注射液4和6号峰与参照物峰峰面积的比值由以上结果可知，当前市场上的南柴胡原药材由于产地、气候、采集方法和贮藏手段等多方面的原因，再加上南柴胡挥发性成分的多变性，导致南柴胡有效成分的含量差异较大，考虑这个方面的原因，为了方便南柴胡注射液的质量控制，初步拟定南柴胡注射液中峰4与参照物(20ug/ml)峰峰面积比值应为0.4-4.0；峰6与参照物(20ug/ml)峰峰面积比值应为0.25-2.5。四、不同柴胡品种的检测结果差异1、南柴胡和竹叶柴胡注射液tic图谱差异通过gc-ms对南柴胡和竹叶柴胡注射液进行检测，发现其tic图谱存在较大差异，见图10(其中，a为南柴胡注射液、b为竹叶柴胡注射液tic图谱)。2、南柴胡注射液、北柴胡注射液和竹叶柴胡注射液指纹图谱差异分别建立南柴胡注射液、北柴胡注射液和竹叶柴胡注射液的指纹图谱，发现三者相似度差异较大，因此，无法通过一种笼统的方法对南柴胡、北柴胡等多种柴胡注射液进行质控。见图11(其中，a为南柴胡注射液指纹图谱、b为北柴胡注射液指纹图谱，c为竹叶柴胡注射液指纹图谱)和表5。表5南、北和竹叶柴胡注射液指纹图谱相似度测定结果序号名称(批号)相似度(标准图谱)1南柴胡注射液(20190601)0.9942南柴胡注射液(20190501)0.9923南柴胡注射液(20190502)0.9944北柴胡注射液(20190501)0.4335北柴胡注射液(20190502)0.4326北柴胡注射液(20190503)0.4287竹叶柴胡注射液(20190501)0.3948竹叶柴胡注射液(20190502)0.3989竹叶柴胡注射液(20190503)0.4153、本发明方法与cn101013110a所述方法建立的指纹图谱分离度差异通过本发明方法和cn101013110a公开的检测方法对南柴胡注射液测定后发现，cn101013110a公开的方法测得的南柴胡注射液指纹图谱分离度明显不如本发明建立的检测方法。结果见图12(其中，a为本发明所述方法测得的南柴胡注射液指纹图谱，b为cn101013110a公开的方法测得的南柴胡注射液指纹图谱)。当前第1页12