一种辅助鉴定植物性食物过敏原线性表位的方法与流程

本发明涉及食品安全检测技术领域，尤其涉及一种辅助鉴定植物性食物过敏原线性表位的方法。

背景技术：

食物过敏是机体暴露于某种特定食物时出现的不良反应，即免疫系统对过敏原进行特异性免疫应答所致的可涉及全身不同器官的过敏反应。据流行病学调查全世界范围内婴幼儿的发病率已达到8％，成人达到5％。食物过敏大多是由ige介导的i型超敏反应，可引发哮喘、腹泻、荨麻疹、过敏性皮炎等全身性多系统反应，甚至会产生休克危及生命，严重影响患者的生活质量。

自然界中的食物过敏原种类繁多，主要来源于植物、动物和微生物，但是引起食物过敏性疾病的过敏原大多数来源于植物。到目前为止，世界卫生组织/国际免疫学会联合会(who/iuis)过敏原命名小组委员会共鉴定了314种食物过敏原，其中有216种来源于植物。而联合国粮农组织(fao)报道的八类过敏性食物中有四类是植物性食物，即花生、大豆、坚果类和小麦。

与生物界存在的多种蛋白质相比，植物性食物过敏原蛋白质仅占很小的一部分，说明这类蛋白质保守的结构和生物活性决定了其致敏的特点。根据蛋白质具有的相似氨基酸序列和三维结构进行分类，发现大多数植物性食物过敏原归属于醇溶蛋白超家族、cupin超家族、抑制蛋白超家族和betv1相关蛋白家族。cupin超家族的大多数过敏原都属于种子贮藏蛋白家族，包括豆类、树坚果和种子过敏原。醇溶蛋白超家族是谷物类植物等最主要的种子贮藏蛋白(除了水稻和燕麦)，富含脯氨酸和谷氨酰胺。过敏性抑制蛋白主要存在于开花植物中，如植物花粉、水果和蔬菜。betv1相关蛋白在空间上具有相似的三维结构，大多数含有7个β折叠和3个α-螺旋结构，在c端有一个亲水的螺旋结构。

食物过敏原分子表面具有特定的结构和氨基酸序列，可以刺激机体产生免疫反应，该免疫活性区被称为抗原表位。根据抗原表位中氨基酸的空间分布特点，可以分为连续性表位和不连续性表位。连续性表位又称为线性表位，是由一级序列中氨基酸连续组成；不连续性表位又称为构象表位，在一级序列中并不连续，但能在正确折叠的蛋白空间结构表面彼此靠近，形成被抗体特异性识别的表位。研究表明，在所有抗原表位中超过90％属于构象表位，只有不到10％是线性表位。但食物过敏原经口摄入后会被胃和小肠消化，胃酸、消化酶等因素均会破坏大量的构象表位，而线性表位依然能被鉴定出，并刺激机体产生过敏反应。因此，食物过敏原线性表位的研究对预防和治疗食物过敏至关重要。

目前，用于鉴定抗原线性表位的方法主要有多肽合成技术和氨基酸定点突变技术等。多肽合成技术是将合成的短重叠肽段通过斑点印迹或免疫印迹实验与过敏患者血清共孵育，检测其与特异性ige抗体的结合情况，从而判断和筛选线性表位，但需要收集过敏患者血清，耗时长、工作量较大、盲目性较高，有可能忽略重叠区间的表位，难以保证精准性。氨基酸定点突变技术是通过依次突变目的蛋白的某个或几个特定氨基酸，然后比较天然目的蛋白和突变后重组蛋白与抗体的结合程度筛选出主要的表位，整个过程突变、重组和筛选工作量都很大。

因此，需要一种辅助鉴定植物性食物过敏原线性表位的方法，使得鉴定工作量减少，结果更准确。

技术实现要素：

针对现有技术存在的问题，本发明提供一种辅助鉴定植物性食物过敏原线性表位的方法，使得鉴定工作量减少，结果更准确。

本发明提供一种辅助鉴定植物性食物过敏原线性表位的方法，包括以下步骤：

(1)以植物性食物蛋白经模拟胃肠消化后的产物为样品，采用高效液相色谱分离；

(2)将步骤(1)分离后的样品进行质谱检测，得到抗消化肽段的质谱信息；

(3)将步骤(2)得到的抗消化肽段质谱信息与植物性食物过敏原的氨基酸全序列进行对比分析，得到与所述植物性食物过敏原匹配的肽段。

上述技术方案中，基于高效液相色谱串联质谱(lc-ms/ms)检测出抗消化肽段质谱信息，再与过敏原的氨基酸全序列进行对比分析，得到与过敏原匹配的肽段，这些肽段与过敏原的线性表位具有相关性，或覆盖或存在交叉，因此，通过上述技术方案可将鉴定线性表位的范围缩小至与过敏原匹配的抗消化肽段，之后再结合生物信息学等其它手段，进一步鉴定过敏原的线性表位。与现有的鉴定线性表位的方法相比，该辅助方法使得整个鉴定过程工作量减少，鉴定结果更准确。

优选地，步骤(1)中所述经模拟胃肠消化为经胃蛋白酶或胰酶消化。

优选地，所述消化时间为50～70min，更优选为60min。

优选地，步骤(1)中采用高效液相色谱分离时，缓冲液a液为0.05％～0.2％甲酸水溶液，缓冲液b液为0.05％～0.2％甲酸乙腈溶液。

采用上述的缓冲液a液和b液，有利于检测过程中样品的稳定，以及得到适当的分离度和灵敏度。

优选地，所述缓冲液a液为0.1％甲酸水溶液，所述缓冲液b液为0.1％甲酸乙腈溶液。

优选地，色谱柱以95％～98％的所述缓冲液a液平衡；样品流速为500～700nl/min。

优选地，步骤(2)中进行质谱检测时，扫描范围为300～1400m/z。

作为一种优选的具体实施方式，所述辅助鉴定植物性食物过敏原线性表位的方法包括以下步骤：

(1)以植物性食物蛋白经胃蛋白酶或胰酶消化50～70min后的产物为样品，采用高效液相色谱分离，色谱分离条件：缓冲液a液为0.05％～0.2％甲酸水溶液，缓冲液b液为0.05％～0.2％甲酸乙腈溶液，色谱柱以95％～98％的所述缓冲液a液平衡，样品流速为500～700nl/min；

(2)将步骤(1)分离后的样品进行质谱检测，质谱仪扫描范围为300～1400m/z，得到抗消化肽段的质谱信息；

(3)将步骤(2)得到的抗消化肽段质谱信息与植物性食物过敏原的氨基酸全序列进行对比分析，得到与所述植物性食物过敏原匹配的肽段。

本发明基于高效液相色谱串联质谱检测出抗消化肽段质谱信息，再与过敏原的氨基酸全序列进行对比分析，得到与过敏原匹配的肽段，这些肽段与过敏原的线性表位具有相关性，或覆盖或存在交叉。因此，本发明的方法可将鉴定线性表位的范围缩小，且更具针对性，与现有的鉴定线性表位的方法相比，该辅助方法使整个鉴定过程工作量减少，鉴定结果更准确。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例1中花生蛋白经胃蛋白酶消化产物的一级质谱图；

图2为本发明实施例1中花生蛋白经胰酶消化产物的一级质谱图；

图3为本发明实施例2中抗消化肽段在jugr2氨基酸序列上的定位；

图4为本发明实施例2中jugr2抗消化肽段的氨基酸组成情况；

图5为本发明实施例3中抗消化肽段及预测表位在cm16氨基酸序列上的定位。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

花生过敏原arah1为7s球蛋白，属于cupin超家族，经血清学分析发现可被90％以上的花生过敏患者血清识别。由于cupin超家族的结构序列具有高度保守性、热稳定性强、抗酶解和不易消化的特点，所以arah1被选为本发明中的模式过敏原。

本实施例提供一种辅助鉴定花生过敏原arah1线性表位的方法，包括以下步骤：

s1、以花生蛋白经胃蛋白酶消化60min后的产物为样品，采用纳升级hplc液相系统easy-nlc1000进行分离，其中缓冲液：a液为0.1％甲酸水溶液，b液为0.1％甲酸乙腈溶液；色谱柱以95％的a液平衡；样品由自动进样器上样到预柱c18trapcolumn(3mm,0.10×20mm)，再经分析柱c18column(1.9mm,0.15×120mm)分离，流速为600nl/min；相关液相梯度如表1所示：

表1液相色谱洗脱梯度参数

s2、将分离后的样品经q-exactive质谱仪进行检测，质谱仪主要参数设置包括：扫描类型为fullms，扫描范围为300～1400m/z，polarity选择正离子扫描，分辨率为70000，microscans选择为1，agctarget选择3e⁶，maxinjectiontime选择60ms。检测得到的样品一级质谱图如图1所示，图中每个谱峰代表一种肽段，可经二次质谱确定其组成，一级质谱共鉴定出5302个肽段，且多肽混合物的质荷比(m/z)集中分布于300-500之间；

s3、从uniprot数据库获取花生过敏原蛋白序列，用于pfind搜索引擎检索，检索参数设置如下：酶为蛋白酶或胰酶；漏切位点：2；固定修饰：酰甲基化修饰(c)；可变修饰：乙酰化(n端)、谷氨酰胺→焦谷氨酸(n端)、氧化(m)；前体质量偏差：±1.5da；碎片质量偏差：±0.5da；肽段可信度：高；肽段长度：>4；肽段fdr：≤0.01。

结果共检索出28条属于花生过敏原蛋白质的肽段，其中有15条与arah1匹配，列于表2。这15条多肽覆盖了arah1全序列的19.38％，且主要分布于蛋白质的氨基端。其中，在299-313处裂解产生三个片段、401-411和415-426处分别裂解产生两个片段，表明这些区域具有消化稳定性。与已知arah1的线性表位进行比较，结果发现，5-15号多肽均与线性表位存在部分氨基酸序列的交叉，且5-7号多肽和9-12号多肽都覆盖了2个线性表位序列。

表2胃蛋白酶抗消化肽段与arah1匹配的肽段

以花生蛋白经胰酶消化60min后的产物为样品，重复上述s1-s3步骤，检测得到样品一级质谱图如图2所示，共鉴定出5037个肽段，其质荷比分布与胃酶消化相似，同样集中在300-500m/z。用pfind搜索引擎共检测出8条属于花生过敏原蛋白的肽段，其中有4条与arah1匹配，列于表3，覆盖了arah1全序列的6.39％。与已知arah1的线性表位进行比较，其中1号和2号肽段涵盖了94-104位点，另外2个肽段的氨基酸序列附近也存在已知的线性表位，证明了表位的抗消化性。

表3胰酶抗消化肽段与arah1匹配的肽段

综上可知，arah1的抗消化肽段在蛋白质全序列的位置附近含有已知的线性表位，且存在一些对应于表位的抗消化重叠肽段；经胃酶消化后可以获取比胰酶消化更多的肽段信息，有助于鉴定更多的线性表位。总之，可以通过本实施例的辅助鉴定方法，将鉴定范围缩小至与过敏原匹配的抗消化肽段，再结合生物信息学等其它手段，进一步鉴定过敏原的线性表位。

实施例2

核桃过敏原jugr2属于7s豌豆球蛋白家族，与花生过敏原arah1同家族，一级序列由593个氨基酸组成，分子量约为44kda，天然条件下以三聚体低聚物形式存在。

本实施例提供一种辅助鉴定核桃过敏原jugr2线性表位的方法，包括以下步骤：

s1、以核桃蛋白经胃蛋白酶消化60min后的产物为样品，采用纳升级hplc液相系统easy-nlc1000进行分离，其中缓冲液：a液为0.1％甲酸水溶液，b液为0.1％甲酸乙腈溶液；色谱柱以95％的a液平衡；样品由自动进样器上样到预柱c18trapcolumn(3mm,0.10×20mm)，再经分析柱c18column(1.9mm,0.15×120mm)分离，流速为600nl/min；

s2、将分离后的样品经q-exactive质谱仪进行检测，共检测出4953个肽段；

s3、从uniprot数据库获取核桃过敏原蛋白序列，用于pfind搜索引擎检索，检索参数设置如下：酶为蛋白酶或胰酶；漏切位点：2；固定修饰：酰甲基化修饰(c)；可变修饰：乙酰化(n端)、谷氨酰胺→焦谷氨酸(n端)、氧化(m)；前体质量偏差：±1.5da；碎片质量偏差：±0.5da；肽段可信度：高；肽段长度：>4；肽段fdr：≤0.01。

结果共检索出11条属于核桃过敏原蛋白质的肽段，其中有4条与jugr2匹配，覆盖其氨基酸全序列的11％，列于表4。

表4胃蛋白酶抗消化肽段与jugr2匹配的肽段

以核桃蛋白经胰酶消化60min后的产物为样品，重复上述s1-s3步骤，共检测出6493个肽段，用pfind搜索引擎共检测出44条属于花生过敏原蛋白的肽段，其中有13条与jugr2匹配，列于表5，覆盖了jugr2氨基酸全序列的46％。

表5胰酶抗消化肽段与jugr2匹配的肽段

为了进一步观察这些抗消化肽段在过敏原jugr2一级氨基酸序列上的分布，从ncbi数据库获取了jugr2的序列，将肽段进行标记，如图3所示，其中方框内为抗消化肽段。整体来看，这些抗消化肽段主要分布于jugr2的c-端区域，覆盖了428-572位点约74％的序列。其中经胃蛋白酶消化后，在515-528处产生了两条重叠肽段，而经胰酶消化后，分别在470-483、488-513和545-572处产生重叠肽段，证明了这些区域的抗消化性。此外，在胰酶作用下的6-13号抗消化肽段几乎相互连接，覆盖了470-572位点的全序列。值得注意的是，2-4号抗胃蛋白酶消化肽段与8-11号抗胰酶消化肽段存在重合区域，这段区域的高度消化抗性很可能保留了大量的线性表位。

使用bioedit软件对jugr2抗消化肽段中各种氨基酸出现的频率进行分析，结果如图4所示。jugr2抗消化肽段由19种氨基酸组成，缺少构成全序列的半胱氨酸(cys)残基。在这些肽段中，富含带负电荷的谷氨酸(glu)和带正电荷的精氨酸(arg)，与全序列的氨基酸组成相比，疏水性氨基酸，如：丙氨酸(ala)、亮氨酸(leu)和异亮氨酸(ile)等的出现频率升高。对这些肽段中出现的氨基酸进行分类统计，其中亲水性氨基酸占43％，中性氨基酸占15％，疏水性氨基酸占42％。结果表明，jugr2抗消化肽段的氨基酸组成与cupin超家族模式抗原arah1线性表位的氨基酸组成存在相似性，该区域可能含有未知的表位。

利用高效液相色谱/质谱鉴定jugr2的抗消化肽段，共确定11个无重叠的氨基酸序列，且主要分布在c-端区域。经过氨基酸组成和空间结构定位分析，发现除了位于215-220位点的序列位于三聚体核心，不具有溶剂可及性外，其余10条肽段均符合cupin超家族中线性表位的组成特性，可能含有线性表位。将jugr2的抗消化肽段与arah1的线性表位进行比对，发现二者之间存在多个重合区域，即jugr2抗消化肽段可能会引发arah1过敏患者产生交叉过敏反应。

综上所述，jugr2的抗消化肽段具有与cupin超家族模式抗原arah1线性表位相同的分布规律，可能含有未知的线性表位，所以可以通过本实施例的辅助鉴定方法，将鉴定范围缩小至得到的jugr2抗消化肽段，再进一步鉴定出具体的线性表位。

实施例3

小麦过敏原cm16是分子量为17kda，由143个氨基酸组成的蛋白质，属于醇溶蛋白超家族，含有多个半胱氨酸残基，可构成分子内二硫键，保证蛋白质的结构稳定性，并具有耐热性。

本实施例提供一种辅助鉴定小麦过敏原cm16线性表位的方法，包括以下步骤：

以小麦蛋白经胰酶消化60min后的产物为样品，采用同实施例1中s1-s3步骤，共检测出6753个肽段，根据uniprot数据库提供的小麦过敏原氨基酸序列构建检索数据库，用pfind搜索引擎共检测出23条属于小麦过敏原蛋白的肽段，且大部分来源于α-淀粉酶/胰蛋白酶抑制剂亚型和高分子量谷蛋白亚基，其中3条与cm16匹配，见表6。

表6胰酶抗消化肽段与小麦主要过敏原匹配的肽段

其中高分子量谷蛋白(hmw-gs)属于醇溶蛋白超家族，一般含有630-830个氨基酸，由n端、c端的亲水区和中间的疏水重复结构域3个区域组成。由于hmw-gs分子量较大，结构具有重复性且无同源性较高的建模模板，无法进行准确深入地分析，因此后续选取α-淀粉酶/胰蛋白酶抑制剂cm16进行线性表位与抗消化肽段之间关系的研究。

利用dnastar软件预测cm16可能的线性表位，结果如表7所示。

表7dnastar预测得到的cm16的线性表位

将预测表位与抗消化肽段在过敏原cm16的一级氨基酸序列上的分布进行标注，如图5所示，方框表示预测的线性表位，下划线表示抗胰酶消化肽段。整体来看，预测表位和抗消化肽段主要分布于中部和c末端，而1、2号抗消化肽段与2、3号预测表位有部分序列重合，表明线性表位具有抗消化性，同时也支持了本实施例的辅助鉴定线性表位方法的可行性和适用性。

综合以上结果，本发明建立了利用高效液相色谱/质谱法检测植物性食物过敏原肽段序列，辅助鉴定过敏原线性表位的方法，适用于cupin超家族和醇溶蛋白超家族的过敏原，并可适用于其他家族的植物性食物过敏原。与现有技术相比，此方法更具有针对性，且更精准，减少工作量，对抗消化肽段进行初步鉴定后，可再结合生物信息学或其它手段进一步鉴定线性表位，对开发新型、精准线性表位检测的方法也具有重要意义。此方法适用于所有具有完整空间结构，且易被胃肠道消化的食物过敏原线性表位的鉴定。

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。