本发明涉及土壤中酶活性的测定方法领域，具体是一种土壤芳基硫酸酯酶活性的荧光光谱检测法。
背景技术：
土壤芳基硫酸酯酶是土壤硫素循环过程中的关键酶，可以把有机硫水解为硫酸盐，其活性强弱影响着土壤中硫的代谢和微生物的活性，对土壤肥力状况有指示作用。土壤中芳基硫酸酯酶的活性受土壤理化性质，如土壤水分、温度、质地、农田耕作措施、种植作物及人为管理措施的影响，因此，对芳基硫酸酯酶的检测意义重大。到目前为止，有关土壤芳基硫酸酯酶的测定基本上多为紫外分光光度法，用410nm比色测定释放的对硝基苯酚含量来估算芳基硫酸酯酶的活性，但是实验培养过程中有机质的分解会产生褐色的物质，对比色产生干扰，影响比色结果，另外此种方法操作步骤繁琐，培养时间长，样品用量大，并且试验结果随土壤质地和肥力状况的不同在称样量上以及培养时间程度有差异性和不确定性，还要防止有机质的分解对测定结果的影响，使其难以适应土壤中芳基硫酸酯酶的定性比较和定量分析研究，降低了试验的效率，增加了试验结果的不确定性。因此需要对现有测定土壤芳基硫酸酯酶的方法进行改进，使样品用量更少，更加快捷、准确和节约。
技术实现要素：
本发明为了解决现有测定土壤芳基硫酸酯酶的方法样品用量大，而且试验效率低的问题，提供了一种改进后的土壤芳基硫酸酯酶活性的荧光光谱检测法。
本发明是通过如下技术方案来实现的：一种土壤芳基硫酸酯酶活性的荧光光谱检测法，包括如下步骤：
一、试剂准备：
①芳基硫酸酯酶荧光底物制备：将芳基硫酸酯酶的荧光底物4-甲基伞形酮基硫酸酯钾盐（methylumbelliferylsulfatepotassiumsalt，分子式为c10h7ko6s，分子量294.3）14.72mg用无菌去离子水稀释至250ml，如果7天内不使用，则贮存于50ml塑料管中冷冻；
②乙酸盐缓冲液：将4.1g乙酸钠（sodiumacetate，c2h3o2na,fw82.03）溶于200ml去离子水中；滴加乙酸调节至ph5.0；用去离子水稀释至250ml，并在4℃下保存备用，至多保存两周；
③氢氧化钠终止剂：将20gnaoh溶解在500ml去离子水中，冷却后，在容量瓶中稀释至1l；
④mu标准品：将19.82mg的甲基伞形酮（methylumbelliferone,sodiumsalt，c10h7o3na，分子量198.16）用去离子水定容于100ml的容量瓶中，溶液包含标准品为1nmolmuml-1；将mu标准品溶液以1ml等份冷冻；分析当天，将其融化，吸取0.5ml，用去离子水稀释，定容至50ml容量瓶中；
⑤叠氮化钠溶液：将0.65gnan3溶解在10l去离子水中；
二、试验步骤：
（1）微孔板制备：采用96孔微孔板；
①每8个孔对应一列，对照组和样品组均包括一列空白、一列mu标准品和一列芳基硫酸酯酶荧光底物，使用8通道移液枪给每一列的孔中各加入50µl缓冲液；
②样品组部分：空白对应列，每个孔中再加入100µlnan3溶液；mu标准品对应列，每个孔中再加入100µlmu标准品；芳基硫酸酯酶荧光底物对应列，每个孔中再加入100µl芳基硫酸酯酶荧光底物；
③对照组部分：空白对应列，每个孔中再加入150µlnan3溶液，mu标准品对应列，每个孔中再加入50µlnan3溶液和100µlmu标准液；芳基硫酸酯酶荧光底物对应列，每个孔中再加入50µlnan3溶液和100µl芳基硫酸酯酶荧光底物；
（2）土壤样品制备：
①称重质量为2.00±0.05g鲜土样，到1l塑料烧杯中，然后加入200mlnan3溶液；
②将其中添加一个搅拌棒，并使用磁力搅拌板搅拌15~20分钟，在进行测定之前，确保土壤分散均匀良好；
（3）检测步骤：
①使用8通道移液枪分别将50µl土壤悬浮液吸移到样品组所有列中，然后将微孔板置于标准测定温度为30°c的培养箱中培养3个小时；
②取出微孔板，向所有孔中加入50µlnaoh以终止测定；
③设定酶标仪的参数，然后将微孔板放入进料口，读取酶标仪荧光板测定值；
④使用微孔板后，首先在水龙头下冲洗，然后在去离子水中用超声波清洗，晾干；
⑤计算每列孔的平均荧光，然后按以下方式计算土壤芳基硫酸酯酶活性，最终单位为nmolmug-1土壤min-1：
i）针对对照组，计算源自芳基硫酸酯酶荧光底物的荧光（nmolmu）：标准*（对照–空白）/（标准–空白）；
ii）针对样品组，计算源自芳基硫酸酯酶荧光底物的荧光（nmolmu）：标准*（测定–空白）/（标准品–空白）；
iii）乘以稀释倍数：溶液总体积(ml)/分析中使用的土壤悬浮液体积(ml)/干燥土壤重量(g)；
iv）除以分析时间(min)，即得到活性值。
本发明所提供的土壤芳基硫酸酯酶活性的荧光光谱检测法，测定的原理为：甲基伞形酮在360nm波长处可以被激发，并且在460nm处能被检测到荧光，它与某些物质结合荧光特性消失，通过芳基硫酸酯酶的水解作用甲基伞形酮释放出来，通过荧光量来表征酶活性。
与现有技术相比本发明具有以下有益效果：本发明所提供的土壤芳基硫酸酯酶活性的荧光光谱检测法，与过去的分析方法相比较，测定过程中培养时间短，培养结束后直接加入终止剂用酶标仪测定，且并微孔板上的荧光数据可以在几秒钟内同时获得平行数据，可以进行大批量样品测定，提高工作效率；操作简单，分析结果稳定可靠，重现性好；药品用量少。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步说明。
一种土壤芳基硫酸酯酶活性的荧光光谱检测法，包括如下步骤：
一、试剂准备：
①芳基硫酸酯酶荧光底物制备：将芳基硫酸酯酶的荧光底物4-甲基伞形酮基硫酸酯钾盐14.72mg用无菌去离子水稀释至250ml，如果7天内不使用，则贮存于50ml塑料管中冷冻；
②乙酸盐缓冲液：将4.1g乙酸钠（sodiumacetate，c2h3o2na,fw82.03）溶于200ml去离子水中；滴加乙酸调节至ph5.0；用去离子水稀释至250ml，并在4℃下保存备用，至多保存两周；
③氢氧化钠终止剂：将20gnaoh溶解在500ml去离子水中，冷却后，在容量瓶中稀释至1l；
④mu标准品：将19.82mg的甲基伞形酮（methylumbelliferone,sodiumsalt，c10h7o3na，分子量198.16）用去离子水定容于100ml的容量瓶中，溶液包含标准品为1nmolmuml-1；将mu标准品溶液以1ml等份冷冻；分析当天，将其融化，吸取0.5ml，用去离子水稀释，定容至50ml容量瓶中；
⑤叠氮化钠溶液：将0.65gnan3溶解在10l去离子水中；
二、试验步骤：
（1）微孔板制备：采用96孔微孔板；
①每8个孔对应一列，对照组和样品组均包括一列空白、一列mu标准品和一列芳基硫酸酯酶荧光底物，使用8通道移液枪给每一列的孔中各加入50µl缓冲液；
②样品组部分：如表1右侧所示，空白对应列，每个孔中再加入100µlnan3溶液；mu标准品对应列，每个孔中再加入100µlmu标准品；芳基硫酸酯酶荧光底物对应列，每个孔中再加入100µl芳基硫酸酯酶荧光底物；
③对照组部分：如表1左侧所示，空白对应列，每个孔中再加入150µlnan3溶液，mu标准品对应列，每个孔中再加入50µlnan3溶液和100µlmu标准液；芳基硫酸酯酶荧光底物对应列，每个孔中再加入50µlnan3溶液和100µl芳基硫酸酯酶荧光底物；
（2）土壤样品制备：
①称重质量为2.00±0.05g鲜土样，到1l塑料烧杯中，然后加入200mlnan3溶液；
②将其中添加一个搅拌棒，并使用磁力搅拌板搅拌15~20分钟，在进行测定之前，确保土壤分散均匀良好；
（3）检测步骤：
①使用8通道移液枪分别将50µl土壤悬浮液吸移到样品组所有列中，然后将微孔板置于标准测定温度为30°c的培养箱中培养3个小时；
②取出微孔板，向所有孔中加入50µlnaoh以终止测定；
③设定酶标仪的参数，然后将微孔板放入进料口，读取酶标仪荧光板测定值；酶标仪参数设置如下：通用参数设置：位置延迟0.2s，动力学窗数1，循环数1，测量开始时间0.0s，每个孔和周期的闪烁次数10，周期1min；过滤器和集成参数设置：荧光强度check，励磁过滤器360nm，排放过滤器460nm，获得值1500，扫描井none；
④使用微孔板后，首先在水龙头下冲洗，然后在去离子水中用超声波清洗，晾干；
⑤计算每列孔的平均荧光，然后按以下方式计算土壤芳基硫酸酯酶活性，最终单位为nmolmug-1土壤min-1：
i）针对对照组，计算源自芳基硫酸酯酶荧光底物的荧光（nmolmu）：标准*（对照–空白）/（标准–空白）；
ii）针对样品组，计算源自芳基硫酸酯酶荧光底物的荧光（nmolmu）：标准*（测定–空白）/（标准品–空白）；
iii）乘以稀释倍数：溶液总体积(ml)/分析中使用的土壤悬浮液体积(ml)/干燥土壤重量(g)；
iv）除以分析时间(min)，即得到活性值。
实施例1
本实施案例为盆栽试验，采用的土壤为黄土母质上发育的褐土，土壤上种植黑丰1号苦荞，由山西省农业科学院高寒作物研究所提供。设置三个不同的处理：1号为常氮处理（1.6g·10kg-1），2号为低氮处理（0.8g·10kg-1），3号为对照（不施氮肥），氮肥为尿素（含氮量46.4%），其中磷肥（p2o5，150mg·kg-1）和钾肥（k2o，60mg·kg-1）均作为底肥施用。采用上述方法来检测三种不同处理后的土壤的芳基硫酸酯酶活性，包括如下步骤：
一、土壤样品制备：
①称重质量为2.00±0.05g鲜土样，到1l塑料烧杯中，然后加入200mlnan3溶液；
②将其中添加一个搅拌棒，搅拌棒选择的大些，并使用磁力搅拌板剧烈搅拌15~20分钟，在进行测定之前，确保土壤分散均匀良好；
二、检测步骤：
①使用8通道移液枪分别将50µl土壤悬浮液吸移到样品组所有测定孔中（空位参照表1），从标准移液器吸头上切下末端可防止堵塞（切掉末端2毫米），然后将微孔板置于标准测定温度为30°c的培养箱中培养3个小时；
②取出微孔板，向所有孔中加入50µlnaoh以终止测定；
③设定酶标仪的参数，然后将微孔板放入进料口，读取酶标仪荧光板测定值；酶标仪参数设置如表2所示：通用参数设置：位置延迟0.2s，动力学窗数1，循环数1，测量开始时间0.0s，每个孔和周期的闪烁次数10，周期1min；过滤器和集成参数设置：荧光强度check，励磁过滤器360nm，排放过滤器460nm，获得值1500，扫描井none；
④使用微孔板后，首先在水龙头下冲洗，然后在去离子水中用超声波清洗，晾干；
⑤计算每列孔的平均荧光，然后按以下方式计算土壤芳基硫酸酯酶活性，最终单位为nmolmug-1土壤min-1：
i）针对对照组，计算源自芳基硫酸酯酶荧光底物的荧光（nmolmu）：标准*（对照–空白）/（标准–空白）；
ii）针对样品组，计算源自芳基硫酸酯酶荧光底物的荧光（nmolmu）：标准*（测定–空白）/（标准品–空白）；
iii）乘以稀释倍数：溶液总体积(ml)/分析中使用的土壤悬浮液体积(ml)/干燥土壤重量(g)；
iv）除以分析时间(min)，即得到活性值。
表1对照和样品微孔板试剂和样品用量
表2.酶标仪荧光板读取参数
试验结果如下：
由表中数据可以看出，较小的标准差值表明该分析方法结果之间的偏差较小，精确度较高，重现性好。
实施例2
试验地位于中国江苏省江都市小记镇马凌村良种场（32゜35’5’n,119゜42’0’e）稻麦轮作农田生态系统，土壤类型为下位砂姜土。本实施例利用稻-麦轮作faoe（free-airozoneenrichment）系统平台对臭氧浓度升高条件下根际土壤芳基硫酸酯酶活性，设置3个处理：1号为烟农19（y19），2号杨麦16（y16），3号为杨麦15（y15）。具体步骤同实施案例1。
试验结果如下：
表中数据显示了分析结果的稳定性及较高的精密度。
本发明要求保护的范围不限于以上具体实施方式，而且对于本领域技术人员而言，本发明可以有多种变形和更改，凡在本发明的构思与原则之内所作的任何修改、改进和等同替换都应包含在本发明的保护范围之内。