促血管生成因子PDGFC在作为诊断和治疗肝肺综合征的标志物中的应用的制作方法

本发明涉及生物医药领域，具体涉及促血管生成因子pdgfc在作为诊断和治疗肝肺综合征的标志物中的应用。

背景技术：

肝肺综合征(hepatopulmonarysyndrome,hps)是在慢性肝病基础上出现的病理性肺微血管扩张(intrapulmonaryvasculardilatation,ipvd)、新生(angiogenesis)、严重低氧血症，在肝硬化患者中发病率可达15％，是引起围术期肺部感染及呼吸衰竭的主要原因。目前，临床上仍缺乏有效的防治手段。

病理性血管新生是hps进程中的核心变化之一，即在毛细血管水平的广泛扩张和新生血管导致通气与灌注不匹配、氧气交换弥散功能受限和动静脉分流，同时扩张的毛细血管由于缺乏平滑肌细胞而对内源性和外源性缩血管因子反应小，导致传统治疗效果差；研究显示消炎痛、三苯氧胺、生长抑素类和拟交感神经类药物、β受体阻滞剂等均未显示确切作用。因此，寻找关键的促血管新生因子是有效治疗hps的一个重要策略。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种血小板生长因子c(platelet-derivedgrowthfactorc，pdgfc)，在作为诊断和治疗肝肺综合征的标志物中的应用；本发明的目的之二在于提供pdgfc在制备促进肺微血管生成的药物中的应用；本发明的目的之三在于提供特异结合pdgfc的抗体在制备治疗肝肺综合征的药物中的应用。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1、促血管生成因子pdgfc在作为诊断和治疗肝肺综合征的标志物中的应用。

2、促血管生成因子pdgfc在制备促进肺微血管生成的药物中的应用。

优选的，所述促血管生成因子pdgfc在制备肺微血管内皮细胞增殖的药物中的应用。

优选的，所述促血管生成因子pdgfc在制备肺微血管内皮细胞迁移的药物中的应用。

优选的，所述促血管生成因子pdgfc在制备肺微血管内皮细胞成管的药物中的应用。

3、特异结合促血管生成因子pdgfc的抗体在制备治疗肝肺综合征的药物中的应用。

优选的，所述抗体为多克隆抗体或单克隆抗体。

本发明的有益效果在于：本发明利用蛋白质组学方法筛选hps模型大鼠血液中丰度高的可能与血管新生相关的分子，经研究发现，筛选到的促血管生成因子pdgfc能够促进肺微血管内皮细胞增殖、迁移、成管性能，因此可以作为促进肺微血管生成的药物。给予pdgfc抗体后hps组肺部损伤评分明显好转，因此特异结合pdgfc的抗体可以作为治疗hps的药物。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1为itraq蛋白质组学分析hps大鼠血清中差异表达的蛋白(a：热图分析差异表达的蛋白；b：不同时间点差异表达蛋白情况)。

图2为pdgfc可促进血管新生(a：ki67染色分析pdgfc过表达可促进肺微血管内皮细胞增殖；b：transwell实验分析pdgfc过表达可促进肺微血管内皮细胞迁移；c：内皮细胞成管实验证明，pdgfc的过表达可促进肺微血管内皮细胞成管)。

图3为pdgfc多克隆抗体干预hps大鼠(a：给药方案；b：大鼠肺脏he染色；c：大鼠肺he染色病理评分；d：大鼠动脉血氧分压；e：大鼠动脉二氧化碳分压分析)。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

实施例1、促血管新生因子筛选

利用蛋白质组学方法筛选hps模型大鼠血液中丰度高的可能与血管新生相关的分子，具体方法如下：

(1)利用胆总管结扎的方法构建肝肺综合征大鼠模型

利用胆总管结扎法(cbdl)构建hps大鼠模型，sham组与手术组各30只。sd雄性成年大鼠，200-220g，采用胆总管结扎法(commonbileductligation，cbdl)构建hps动物模型。对照组大鼠只开腹，不结扎胆总管。血气分析评判肺微血管扩张程度：大鼠称重后，5％水合氯醛按照7ml/g进行麻醉；迅速打开腹腔，暴露腹主动脉，用血气针进行抽血。完成后迅速用血气分析仪abl800(radiometercopenhagen)进行分析；采用腹主动脉采血，样品用于蛋白质组学分析。

(2)itraq蛋白质组学分析

样品处理：分别将收集好的hps大鼠第一周、第三周、第五周的血清样本采用除盐试剂盒去除样品中的盐离子，然后加入样品裂解液中，30℃温水水浴溶解1小时，充分溶解蛋白。将溶液在室温下15000g离心15min，并再次离心取上清，充分去除不容性杂质。上清液即为组织的总蛋白溶液，分装后储存于-80度冰箱或直接用于itraq分析。

利用bca法测定蛋白质浓度。

itraq标记、2d-lc-msms及反向色谱-tripletof分析结果如图1所示，其中上调的蛋白有68个，下调的有44个。其中pdgfc在hps血液中上调4.6倍。而信息学分析显示，该分子与血管新生相关。

实施例2、验证pdgfc的促血管生成功能

利用构建好的pdgfc敲低、过表达的慢病毒(follenzia,aillesle,bakovics,geunam,naldinil:genetransferbylentiviralvectorsislimitedbynucleartranslocationandrescuedbyhiv-1polsequences.naturegenetics2000,25(2):217-222.)处理肺微血管内皮细胞，通过微血管内皮细胞的增殖、迁移、成管能力衡量微血管内皮细胞的促血管生成功能。

细胞增殖实验结果(图2，a)显示，pdgfc过表达组ki67阳性细胞数显著高于对照组，pdgfc敲低组ki67阳性细胞数显著低于对照组，这表明pdgfc过表达可以促进肺微血管内皮细胞的血管生成能力。

细胞迁移实验结果(图2，b)显示，pdgfc过表达组肺微血管内皮细胞迁移能力显著高于对照组，pdgfc敲低组肺微血管内皮细胞迁移能力显著低于对照组，这表明pdgfc过表达可以促进肺微血管内皮细胞的迁移能力。

细胞成管实验结果(图2，c)显示，pdgfc过表达组肺微血管内皮细胞成管能力显著高于对照组，pdgfc敲低组肺微血管内皮细胞的成管能力显著低于对照组，这表明pdgfc过表达可以促进肺微血管内皮细胞形成血管的能力。

实施例3、制备多克隆抗体，评估对hps大鼠病情的影响

首先，制备pdgfc多克隆抗体。制备多克隆抗体的方法是由1975年英国科学家milstein和kohler所发明，并因此获得1984年诺贝尔医学奖。但就目前了解，市面上并没有针对pdgfc的多克隆抗体，或抗体药物/制剂。故我们基于前期的研究，构建pdgfc多克隆抗体，用于hps大鼠的治疗，有望将其运用在hps患者身上，以达到疾病的干预。

将制备好的pdgfc多克隆抗体利用尾静脉注射的方式注入hps大鼠体内，单次注射剂量为120ml/天/kg，1ml/kg/天给药方式为尾静脉给药，如图3中a。给药三周后解剖，分析结果如下：

pdgfc多抗处理组相比较hps组肺部损伤评分明显好转(图3中b和c)；而多抗处理组与hps组相比，氧分压和二氧化碳分压均明显恢复(图3中d和e)。这说明pdgfc多抗处理，对hps的典型病征是有明显的改善的。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。