一种基于响应面法优化超临界萃取高纯度小茴香精油的方法与流程

本发明涉及植物成分提取技术领域，具体的说是一种基于响应面法优化超临界萃取高纯度小茴香精油的方法。

背景技术：

小茴香又名阿日帕巴地洋、刺则牙纳、刺则牙那、刺西牙那，是伞形科植物茴香(foeniculumvulgaremill.)的干燥成熟果实，是中医常用药材。在我国新疆、甘肃、内蒙、山西、陕西及东北等地区均有栽培。

小茴香在医药上的食品加工商常用的药材，是具有健胃、明目、通络的功能，主治胃液过多引起的胃纳不佳，胃寒腹胀，恶心、呃逆、脑虚肝虚引起的视力下降，肾虚引起的尿道不通等症。小茴香精油除了具有抑菌和抗氧化活性外还具有其他一些生理活性，还具有驱风作用、抗菌作用,促进胃排空作用、利尿作用；改善肝功能，降低肝硬化的作用，既可作为调料品使用,可用于香精。为此,研究小茴香精的萃取方法及萃取工艺,对开发利用小茴香这一宝贵资源具有很重要的意义。

目前,小茴香精油的提取方法常用的有水蒸汽蒸馏法、超临界萃取技术、溶剂提取法等。sfe技术与传统提取法和溶剂提取法相比具有以下独特的优点：(1)操作温度低：特别适用于对热敏感性强、容易被氧化分解、破坏的成分的提取与分离。(2)选择性强，提取完全、在高压、密闭、惰性环境中可选择性提取有效成分；提取物纯度高，收率高。(3)co2无毒、安全、环保：能循环使用，萃取产品无溶剂残留。(4)萃取工艺简单、生产周期短、产率高，不存在有机溶剂污染等问题；特别适合于香精香料的提取。

虽然利用sfe技术提取种子精油是具有以上的优势，但一些提取工艺参数不佳的原因，在精油的萃取过程中也出来有些色素、脂肪油等杂质，影响精油的质量。本发明中为了克服sfe技术的这些困难，利用gc/fid检测手段测定每克精油中反式茴香脑的含量，然后根据得到精油的得率和及其反式茴香脑的含量，计算精油得率的综合评分，通过此项综合评分作为中心组合(box-behnken)实验的响应值，对所得的精油得率和它的质量进行综合性分析，确实保证了精油的质量和纯度。在同样的gc/ms分析条件下进检测，在此优化的工艺参数条件下所得到的精油成分和sd法提取的小茴香挥发油成分基本是一致的，而且在成分上得到了和传统方法得不到的一系列挥发性成分。

响应曲面法是试验设计、数理统计和最优化技术的一种综合应用,是数学方法与统计方法结合的产物,使用方便,优选条件预测性好。目前鲜见响应曲面法应用于小茴香精油工艺参数优化的报道,而且本发明在单因素初步试验的基础上,利用响应曲面法对小茴香种子中精油提取的主要工艺条件进行了优化。

技术实现要素：

本发明目的在于，提供一种基于响应面法优化超临界萃取高纯度小茴香精油的方法，该方法以小茴香种子为原料，药材除杂、粉碎和过筛后，运用designexpert8.0.6软件进行box-behnken设计，根据软件提供的预测值优化小茴香精油超临界萃取工艺用超临界co2萃取法萃取小茴香精油；利用gc/fid和gc/ms技术对精油中的反式茴香脑进行定性、定量；以得出的精油得率综合评分为指标，为小茴香精油提取的综合评价和开发利用提供参考依据。

本发明所述的一种基于响应面法优化超临界萃取高纯度小茴香精油的方法，按下列步骤进行：

超临界萃取小茴香精油：

a.称取小茴香种子粉碎，用粒度为18-40目的筛子筛分后，密封保存；

b.运用designexpert8.0.6软件进行box-behnken设计，得到萃取温度30-45℃，萃取压力100-300bar，萃取时间30-120min，将步骤a得到的物料一次性投料量50-120g置于超临界二氧化碳萃取装置的萃取釜中，粉碎粒度18-40目，co2流量2l/min-8l/min的条件下，得到小茴香精油质量比3-5％；

测定小茴香精油中反式茴香脑纯度：

c、用气相色谱外标法测定精油中反式茴香脑的含量：先配制浓度为400μg/ml的反式茴香脑的母溶液，然后用乙酸乙酯溶解并分别稀释成浓度为400μg/ml、200μg/ml、100μg/ml、40μg/ml和20μg/ml的反式茴香脑标准溶液，外标法测定，以峰面积为纵坐标y，以对照品浓度为横坐标xμg/ml，进行线性回归，得回归方程:y＝1.9241x-1.5978(r²＝0.99979,n＝5)，按线性关系测定条件进样分析；

利用气相色谱和气质联用色谱，其中气相色谱条件：hp-5毛细管色谱柱30m×320μm×0.25μm，检测器：火焰离子化检测器，气化室温度220℃，加热器温度300℃；载气：高纯n2，流速2ml/min；气质联用色谱条件：接口温度280℃，离子源：ei电子轰击源，离子源温度230℃，电离电压70ev，传输线温度280℃，四级杆温度150℃，扫描范围m/z：30-500aum全扫描，溶质延迟5min；调谐文件为标准调谐测定每克精油中反式茴香脑的含量到达90-95mg/g。

本发明所述的一种基于响应面法优化超临界萃取高纯度小茴香精油的方法，该方法中：

样品的前处理：称取小茴香种子粉碎，用粒度为18-40目的筛子筛分后，密封保存；

运用designexpert8.0.6软件进行box-behnken设计，得到萃取温度30-45℃，萃取压力100-300bar，萃取时间30-120min，将步骤a得到的物料一次性投料量50-120g置于超临界二氧化碳萃取装置的萃取釜中，粉碎粒度18-40目，co2流量2l/min-8l/min的条件下，得到小茴香精油质量比3-5％；

精油得率(p)＝萃取的精油质量/装料质量×100％；(a)

精油中反式茴香脑的定性：取co2超临界法提取的小茴香精油100μl，用乙酸乙酯稀释20倍，进行gc/fid和gc/ms检测，小茴香精油和反式茴香脑溶液tr值(tr＝5.25min)的一致性，而进行定性(图2)；根据gc/ms法，小茴香精油和反式茴香脑质谱特征一致性，而进行定性(图3)；

精油的gc(fid)和gc/ms条件：cg条件:agilent7890b(美国agilent公司)，包括fid检测器，ctc自动进样器，7890a型色谱工作站；gc条件：hp-5毛细管色谱柱(30m×320μm×0.25μm)；检测器：火焰离子化检测器(fid)，气化室温度220℃，加热器温度300℃；载气：高纯n2，流速2ml/min；ms条件：接口温度280℃，离子源：ei电子轰击源，离子源温度230℃，电离电压70ev，传输线温度280℃，四级杆温度150℃，扫描范围(m/z)：30-500aum全；调谐文件为标准调谐；

用气相色谱外标法测定精油中反式茴香脑的含量测定：先配制浓度为400μg/ml的反式茴香脑的母溶液，然后用乙酸乙酯溶解并分别稀释成浓度为400μg/ml、200μg/ml、100μg/ml、40μg/ml、20μg/ml的反式茴香脑标准溶液，外标法测定，以峰面积为纵坐标y，以对照品浓度为横坐标x(μg/ml)，进行线性回归，得回归方程：y＝1.9241x-1.5978(r²＝0.99979,n＝5)(图4)，按线性关系测定条件进样分析，分别测定每克精油中反式茴香脑的含量。

综合评分的计算：根据以上17组实验所得到的精油得率和测定的反式茴香脑含量，分别计算每组实验所得到的精油得率的综合评分(％)，对精油得率及其质量进行综合性评价，计算公式如下：

y(％)＝y×40％+ρ×60％(b)

式中y为精油得率的综合评分(％)；y为精油得率；ρ为每克精油中反式茴香脑的含量；

响应面实验设计：超临界萃取小茴香种子精油过程中的工艺参数用响应曲面分析法优化。根据单因素实验结果，以小茴香种子精油得率的综合评分(y)为指标，为指标进行中信组合(box-behnken)实验设计，选取对小茴香种子精油得率综合评分影响最大的3个因素(萃取温度，压力，时间)为自变量，分别以x1、x2、x3来表示，并以+1、0、-1分别代表自变量的高、中、低水平，按方程xi＝(xi-x0)/△x对自变量进行编码，其中，xi为自变量的编码值，xi为自变量的真实值，x0为实验中心点处自变量的真实值，△x为自变量的变化步长。利用统计软件designexpert软件对试验数据进行回归分析，预测以小茴香种子精油萃取的最佳工艺参数，显著水平(p≤0.05)；

工艺优化与验证:本发明以小茴香种子精油得率的综合评分指标，选取对小茴香种子影响最大的3个因素(萃取温度，压力，时间)为自变量，采用响应曲面分析法对小茴香种子精油提取过程中的工艺参数进行优化，再通过designexpert软件对优化后的模型回归分析，确定小茴香种子精油萃取的最佳工艺参数；结果表明：时间对精油得率的综合评分的影响极显著；提取率3-5％，反式茴香脑的含量94—97μg/mg，综合评分为0.774—0.805；为了其实际操作性,将其条件改为：最佳的正数为单位的萃取压力，萃取温度和萃取时间，进行验证试验(n＝3)，在此条件下按照本发明所述的方法从小茴香种子中提取精油所得到的得率为3.802％,反式茴香脑的含量97μg/mg,合评分为0.798，得率与理论预测值相差0.051，用气质联用色谱共鉴定出45个成分，占总成分的97.76％；其中萜类化合物5.64％，含氧萜类化合物70.16％，其余其他挥发性成分，鉴定的成分比传统法多。充分说明响应曲面分析法对超临界萃取小茴香种子精油及其提高反式茴香脑含量工艺参数的优化可靠，有实用性；

结果与结论：从以上结果可以看出，本发明相对于传统的水蒸气蒸馏法和溶剂萃取法，避免使用有机溶剂萃取、水提醇沉、高温煎煮等对药材有效成分的破坏；不但可以实现高效率、高产率，且萃取时间短、工艺简单、操作方便，产物纯度高，无溶剂残留，对环境无污染。尤其是本发明的另一个有点是：不但可以提高精油的产量，而且在萃取过程中避免有些脂肪油，色素等有些杂质的出来，有效的保证精油的质量，不影响药渣继续使用。

附图说明

图1为本发明流程图；

图2为本发明小茴香精油和反式茴香脑gc/fid定性分析色谱图，其中(a)为小茴香精油，(b)为反式茴香脑标准品；

图3为本发明反式茴香脑gc/ms特征离子质谱图；

图4为本发明反式茴香脑含量测定标准曲线图；

图5为本发明萃取时间和萃取温度及两者的交互作用对小茴香种子精油得率综合评分影响的相应曲面图(a)及对应等高线图(b)；

图6为本发明萃取时间和萃取压力及两者的交互作用对小茴香种子精油得率综合评分影响的相应曲面图(a)及对应等高线图(b)；

图7为本发明萃取温度和萃取压力及两者的交互作用对小茴香种子精油得率综合评分影响的相应曲面图(a)及对应等高线图(b)；

图8为本发明小茴香精油得率综合评分的预测值与实测值的关系。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，对本发明进行进一步详细说明，应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，但不以任何方式对本发明加以限制。

实施例1

超临界萃取小茴香精油：

a.称取小茴香种子粉碎，用粒度为18目的筛子筛分后，密封保存；

b.运用designexpert8.0.6软件进行box-behnken设计，得到萃取温度30℃，萃取压力100bar，萃取时间30min，将步骤a得到的物料一次性投料量50g置于超临界二氧化碳萃取装置的萃取釜中，粉碎粒度18目，co2流量2l/min的条件下，得到小茴香精油质量比3％；

测定小茴香精油中反式茴香脑纯度：

c、用气相色谱外标法测定精油中反式茴香脑的含量：先配制浓度为400μg/ml的反式茴香脑的母溶液，然后用乙酸乙酯溶解并分别稀释成浓度为400μg/ml、200μg/ml、100μg/ml、40μg/ml和20μg/ml的反式茴香脑标准溶液，外标法测定，以峰面积为纵坐标y，以对照品浓度为横坐标xμg/ml，进行线性回归，得回归方程:y＝1.9241x-1.5978(r²＝0.99979,n＝5)，按线性关系测定条件进样分析；

利用气相色谱和气质联用色谱，其中气相色谱条件：hp-5毛细管色谱柱30m×320μm×0.25μm，检测器：火焰离子化检测器，气化室温度220℃，加热器温度300℃；载气：高纯n2，流速2ml/min；气质联用色谱条件：接口温度280℃，离子源：ei电子轰击源，离子源温度230℃，电离电压70ev，传输线温度280℃，四级杆温度150℃，扫描范围m/z：30-500aum全扫描，溶质延迟5min；调谐文件为标准调谐测定每克精油中反式茴香脑的含量到达90mg/g。

实施例2

超临界萃取小茴香精油：

a.称取小茴香种子粉碎，用粒度为30目的筛子筛分后，密封保存；

b.运用designexpert8.0.6软件进行box-behnken设计，得到萃取温度40℃，萃取压力200bar，萃取时间70min，将步骤a得到的物料一次性投料量100g置于超临界二氧化碳萃取装置的萃取釜中，粉碎粒度30目，co2流量6l/min的条件下，得到小茴香精油质量比4％；

测定小茴香精油中反式茴香脑纯度：

c、用气相色谱外标法测定精油中反式茴香脑的含量：先配制浓度为400μg/ml的反式茴香脑的母溶液，然后用乙酸乙酯溶解并分别稀释成浓度为400μg/ml、200μg/ml、100μg/ml、40μg/ml和20μg/ml的反式茴香脑标准溶液，外标法测定，以峰面积为纵坐标y，以对照品浓度为横坐标xμg/ml，进行线性回归，得回归方程:y＝1.9241x-1.5978(r²＝0.99979,n＝5)，按线性关系测定条件进样分析；

利用气相色谱和气质联用色谱，其中气相色谱条件：hp-5毛细管色谱柱30m×320μm×0.25μm，检测器：火焰离子化检测器，气化室温度220℃，加热器温度300℃；载气：高纯n2，流速2ml/min；气质联用色谱条件：接口温度280℃，离子源：ei电子轰击源，离子源温度230℃，电离电压70ev，传输线温度280℃，四级杆温度150℃，扫描范围m/z：30-500aum全扫描，溶质延迟5min；调谐文件为标准调谐测定每克精油中反式茴香脑的含量到达95mg/g。

实施例3

超临界萃取小茴香精油：

a.称取小茴香种子粉碎，用粒度为40目的筛子筛分后，密封保存；

b.运用designexpert8.0.6软件进行box-behnken设计，得到萃取温度45℃，萃取压力300bar，萃取时间120min，将步骤a得到的物料一次性投料量120g置于超临界二氧化碳萃取装置的萃取釜中，粉碎粒度40目，co2流量8l/min的条件下，得到小茴香精油质量比5％；

测定小茴香精油中反式茴香脑纯度：

c、用气相色谱外标法测定精油中反式茴香脑的含量：先配制浓度为400μg/ml的反式茴香脑的母溶液，然后用乙酸乙酯溶解并分别稀释成浓度为400μg/ml、200μg/ml、100μg/ml、40μg/ml和20μg/ml的反式茴香脑标准溶液，外标法测定，以峰面积为纵坐标y，以对照品浓度为横坐标xμg/ml，进行线性回归，得回归方程:y＝1.9241x-1.5978(r²＝0.99979,n＝5)，按线性关系测定条件进样分析；

利用气相色谱和气质联用色谱，其中气相色谱条件：hp-5毛细管色谱柱30m×320μm×0.25μm，检测器：火焰离子化检测器，气化室温度220℃，加热器温度300℃；载气：高纯n2，流速2ml/min；气质联用色谱条件：接口温度280℃，离子源：ei电子轰击源，离子源温度230℃，电离电压70ev，传输线温度280℃，四级杆温度150℃，扫描范围m/z：30-500aum全扫描，溶质延迟5min；调谐文件为标准调谐测定每克精油中反式茴香脑的含量到达93mg/g。

本发明所述的一种基于响应面法优化超临界萃取高纯度小茴香精油的方法，该方法精油中反式茴香脑的含量测定：助于响应面软件设计(3因素三水平)各组试验所得到的17个样品作为供试品，用乙酸乙酯溶解并在线性范围内稀释后在线性关系测定条件下测定，每组精油中反式茴香脑的含量；

综合评分的计算：根据以上17组实验所得到的精油得率和测定的反式茴香脑含量，分别计算每组实验所得到的精油得率的综合评分(％)，对精油得率及其质量进行综合性评价，计算公式如下：

y(％)＝y×40％+ρ×60％(b)

式中y为精油得率的综合评分(％)；y为精油得率；ρ为每克精油中反式茴香脑的含量；

因素水平的选取：根据单因素试验结果选取最佳的萃取压力，萃取温度和萃取时间，然后利用响应曲面分析法中心复组合模型试验设计软件，采用三因素三水平的响应曲面分析法设计试验，选取萃取压力100—200bar，萃取温度35—45℃，萃取时间30—90min进行后续的响应曲面法设计，优化小茴香精油得率的综合评价。响应面分析因素与水平见表1；

表1响应面分析因素与水平

x1＝(x1-150)/50；x2＝(x2-35)/5；x3＝(x3-60)/60

利用designexpert8.0.6软件对表中的数据进行多元回归拟合分析，得到响应回归方程:根据单因素实验结果，以小茴香种子精油得率的综合评分(y)为指标，为指标进行rsm实验设计，选取对小茴香种子精油提取率影响最大的3个因素(萃取温度，压力，时间)为自变量，分别以x1、x2、x3来表示，并以+1、0、-1分别代表自变量的高、中、低水平，按方程xi＝(xi-x0)/△x对自变量进行编码，其中，xi为自变量的编码值，xi为自变量的真实值，x0为实验中心点处自变量的真实值，△x为自变量的变化步长。利用统计软件designexpert软件对试验数据进行回归分析，预测以小茴香种子精油萃取的最佳工艺参数，显著水平(p≤0.05)。

利用designexpert软件对表5试验数据进行回归分析，假设由最小二乘法拟合的二次多项方程为：

y＝0.75-0.001625x1-0.0025x2+0.009125x3-0.009x1x2+0.00425x1x3+0.0015x2x3-0.033x1²-0.047x2²-0.03x3²；(c)

根据box-behnken模型设计的实验组数，进行三因素三水平的响应曲面随机实验，响应曲面实验设计与数据处理见表2；

表2响应曲面试验设计与数据处理

对响应曲面多元回归模型进行方差分析和显著性检验:由表方差分析可知,小茴香挥发有得率的综合评分二次多元回归模型极显著(p<0.0001)；失拟性不显著(p＝0.4218>0.05)，决定系数r²＝0.9866，校正系数r²adj＝0.9694，这表明方程的拟合度和可信度均很高，实验的可靠性越高,结果如表3所示；

表3小茴香精油得率综合评分的回归模型方差分析表

注：*表示：显著，p<0.05；**表示：极显著p<0.01，ns表示：不显著；决定系数r²＝0.9866，校正系数r²adj＝0.9694。

综上所述，该回归模型拟合程度良好，试验误差小，能够准确的分析和预测小茴香精油得率的综合评价，说明实验操作可信度高，具有一定的实践指导意义，由回归系数显著性表明，在所取因素水平范围内，各因素对小茴香精油得率综合评分的影响顺序为：萃取时间>萃取温度>萃取压力；

根据所得到的回归模型，由designexpert8.0.6软件对实验参数进一步优化，得到了以上最佳条件和最好质量的最高得率；为了其实际操作性,将其条件改为：最佳的正数为单位的萃取压力，萃取温度和萃取时间，进行验证试验(n＝3)。在此条件下按照本发明所述的方法从小茴香种子中提取精油所得到的得率为3.802％,反式茴香脑的含量97mg/g,综合评分为0.798，得率与理论预测值相差0.051，并利用气相色谱质谱联用技术分离、鉴定后共鉴定出45个成分，占总成分的97.76％；其中萜类化合物5.64％，含氧萜类化合物70.16％，在成分上得到了和传统方法得不到的一系列挥发性成分；这些数据充分说明响应曲面分析法对超临界萃取小茴香种子精油及其提高反式茴香脑含量工艺参数的优化可靠，有实用性；

本发明在单因素试验基础上选取对精油得率综合评分影响较大的3种因素,即萃取压力、萃取温度和萃取时间进行考察,通过相应曲面法建立了小茴香精油得率综合评分与三个因素之间关系的二次多项式方程模型,并绘制出三维曲面图,对其综合分析,得出最佳的萃取温度，萃取压力和萃取时间等工艺参数。

本发明利用中心组合试验设计和效应面分析法，借助统计软件(design-expert.v8.0.6)简便、可靠地进行优化试验和数据分析,对超临界萃取小茴香种子精油提取的工艺参数进行优化,取得了较好的效果。本发明对开发利用小茴香这一宝贵资源，提取大量的小茴香精油及加工和利用方面提供参考，为小茴香精油新产品的推广奠定一定的基础。