一种可测定大黄蛰虫制剂及其原料的指纹图谱检测方法与流程

本发明涉及一种指纹图谱检测方法，具体涉及原料药材大黄、黄芩及大黄蛰虫制剂的指纹图谱的检测方法。

背景技术：

从2000年起正式推行中药指纹图谱，以控制中药质量。对于中药而言，指纹图谱不同于传统的检测技术之处是在于它不是从一个“点”来控制质量，而是从某一个“面”来评价中药质量，而且带有“量化”的概念。大黄蛰虫相关制剂是由熟大黄、土鳖虫（炒）、水蛭(制)、虻虫(去翅足，炒)、蛴螬(炒)、干漆（锻）、桃仁、炒苦杏仁、黄芩、地黄、白芍、甘草十二味中药制成，常见剂型有胶囊剂和丸剂，具有活血破瘀，通经消癥的作用。用于淤血内停所致的癥瘕、闭经、症见腹部肿块、肌肤甲错、面色黯黑、潮热羸瘦、经闭不行。该复方药味复杂，含有化学成分多样。现有技术的分析方法不能全面、客观地检测和评价大黄蛰虫相关制剂的质量。

技术实现要素：

发明目的:本发明的目的是解决现有技术的不足，提供一种指纹图谱检测方法，该检测方法可以同时用于检测原料药材大黄、黄芩及大黄蛰虫相关制剂中的特征成分，可以客观、全面、准确的评价药材及大黄蛰虫制剂的质量，对控制原料和制剂的内在质量与保证临床疗效具有重要意义。

技术方案:为了实现以上技术目的，本发明采取的技术方案为:

一种指纹图谱检测方法，该指纹图谱检测方法包括以下步骤:

(1)原料药材供试品溶液制备:取大黄、黄芩药材适量，粉碎，各取0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%乙醇溶液30ml，密塞，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用50%乙醇补足减失的重量，摇匀滤过，取续滤液，制成原料药材供试品溶液；

(2)大黄蛰虫丸供试品溶液制备:取大黄蛰虫丸粉末，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%乙醇溶液50ml，密塞，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用50%乙醇补足减失的重量，摇匀滤过，取续滤液，制成制剂供试品溶液；

（3）大黄蛰虫胶囊供试品溶液制备:取大黄蛰虫胶囊，研细，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%乙醇溶液50ml，密塞，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用50%乙醇补足减失的重量，摇匀滤过，取续滤液，制成制剂供试品溶液；

(4)对照品溶液的制备:精密称取黄芩苷、黄芩素、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚对照品，用甲醇溶解，配置成适宜浓度的混合对照品储备液；

（5）高效液相色谱法同时测定原料药材大黄、黄芩、大黄蛰虫丸及大黄蛰虫胶囊的对照指纹图谱：取以上供试品在适当的色谱条件下进样，测得各供试品的指纹图谱，以这些指纹图谱为基础，用相似度软件计算获得共有模式作为本品的对照指纹图谱；

(6)取对照品溶液按步骤（5)相同的色谱条件进样，测得各对照品溶液的高效液相图谱；

(7)高效液相色谱法测定供试品溶液指纹图谱:取步骤(1)、步骤（2）、步骤（3）供试品溶液按步骤（5)相同的色谱条件进样，测得供试品溶液的指纹图谱；并根据步骤(6)所得对照品溶液的高效液相图谱归属各色谱峰；

(8)将步骤(7)得到的供试品溶液指纹图谱和步骤(6)得到的对照指纹图谱用相似度软件评价。

作为优选方案，以上所述的指纹图谱检测方法，步骤（5)色谱条件：色谱柱：依利特hypersilods2c18色谱柱(规格);流动相:a:0.1%磷酸水溶液，b：乙腈；梯度洗脱；流速1.0ml/min；柱温:35℃；进样量20μl。

作为优选方案，以上所述的指纹图谱检测方法，步骤（5）梯度洗脱程序如下表：

作为优选方案，以上所述的指纹图谱检测方法，步骤（5）波长洗脱程序如下表：

作为优选方案，以上所述的指纹图谱检测方法，步骤(4)对照品溶液的制备:精密称取黄芩苷、黄芩素、大黄素、芦荟大黄素、大黄酸、大黄酚、大黄素甲醚对照品，用甲醇溶解，配置成每1ml中含黄芩苷25μg、黄芩素15μg、芦荟大黄素16μg、大黄酸16μg、大黄素16μg、大黄酚16μg、大黄素甲醚8μg的混合对照品储备液。

作为优选方案，以上所述的指纹图谱检测方法，均选用江苏颐海药业有限责任公司生产的国药准字z32020987大黄蛰虫丸及国药准字z20054026大黄蛰虫胶囊。

一、以上指纹图谱的色谱条件优化实验：

1.1样品提取溶剂的选择

本品成分复杂，其有效成分的化学结构差异较大，需选择一种合适的提取溶剂，才能将各种有效成分从原料药材及成品中提取出来。实验比较了甲醇、乙醇及不同比例的甲醇-水、乙醇-水等作为提取溶剂的提取效率。结果表明，高比例有机溶剂适合提取极性较小的大黄蒽醌类成分(如大黄素等)。经反复试验，采用50%乙醇作为提取溶剂，可以兼顾大多数目标成分。

1.2流动相的选择

实验比较了流动相为甲醇-水，乙腈-水，甲醇-0.1%磷酸水溶液v/v)，乙腈-0.1%磷酸水溶液(v/v)，甲醇-乙腈-0.1%磷酸水溶液(v/v)等体系，结果表明，甲醇体系有较好的分离能力，但要将所有成分分离开需要较长的分析时间，因而选用乙腈流动相体系。在流动相中加入磷酸作为添加剂，可以很好地改善某些化合物(如大黄素、大黄酚等)的峰形，实验比较了不同体积比的磷酸水溶液，选用0.1%磷酸水溶液(v/v)可获得最佳效果。

1.3流动相梯度选择

本发明考察了不同梯度洗脱条件对分离的影响，结果以下述优选的流动相梯度为佳，故选定该梯度为指纹图谱分析的色谱条件，

1.4检测波长的选择

由于大黄蛰虫制剂中的指标成分化学结构不同，紫外吸收差别较大(各化合物的最大紫外吸收波长见表1)，在同一波长下检测会损失某些成分的灵敏度。因此，本法采用可变波长检测器，采用不同时间段选择不同波长进行分段检测的方法，分别在各成分的最大紫外吸收处检测，使各化合物在相应波长下获得最高的检测灵敏度。

表1：各化合物的最大紫外吸收波长

二、以上指纹图谱的方法学验证：

2.1系统适用性试验

按上述色谱条件，分别对混合对照品溶液及大黄蛰虫制剂供试品溶液进行测定。理论板数按黄芩苷峰计算不低于3000，测定供试品的峰形良好，分离度大于1.5，表明方法的系统适用性好。

2.2精密度实验

取同一供试品溶液，按上述色谱条件，连续进样6次，测定峰面积，计算黄芩苷、黄芩素、芦荟大黄素、大黄素、大黄酸、大黄酚、大黄素甲醚峰面积的rsd，结果见表2，其范围在0.08%~0.62%，表明仪器的精密度良好。

表2精密度试验结果

2.3线性关系考察

精密吸取系列标准溶液各20μl进样，测定，以标准溶液质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标作线性回归方程，七种化合物的相关系数及回归方程见表3，标准曲线见附图1。

表3七种化合物的相关系数及回归方程

2.4稳定性试验

取同一供试品溶液，按上述色谱条件，每间隔6小时分别进样测定，连续考察24小时，结果见表4。24小时内黄芩苷、黄芩素、大黄素、芦荟大黄素、大黄酸、大黄酚、大黄素甲醚色谱峰面积的rsd为0.20~1.33%，表明供试品溶液在常温下24小时内稳定。

表424小时稳定性试验

本发明针对现有技术检测方法的诸多不足，通过大量实验筛选出最佳的提取溶剂、流动相组成，检测波长等分析条件，经多次实验验证表明，本发明提供的检测方法，可建立良好的指纹图谱。采用本发明提供的指纹图谱检测方法，可以同时检测大黄药材、黄芩药材、大黄蛰虫丸及大黄蛰虫胶囊的特征成分，从而可以全面、客观、准确的检测和评价原料药材及成品制剂的质量，为保证临床疗效具有重要意义。

附图说明

附图1为七种化合物的标准曲线。

附图2为大黄蛰虫胶囊的对照指纹图谱。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步阐明本发明，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。

一种指纹图谱检测方法，所述指纹图谱检测方法，包括以下步骤:

（1）大黄蛰虫胶囊供试品溶液制备:取大黄蛰虫胶囊，研细，精密称定0.4g，置具塞锥形瓶中，精密加入50%乙醇溶液50ml，密塞，称定重量，超声处理30分钟（超声功率400w，频率40hz），放冷，再称定重量，用50%乙醇补足减失的重量，摇匀滤过，取续滤液，制成制剂供试品溶液；

(2)对照品溶液的制备:精密称取黄芩苷、黄芩素、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚对照品，用甲醇溶解，配置成每1ml中含黄芩苷25μg、黄芩素15μg、芦荟大黄素16μg、大黄酸16μg、大黄素16μg、大黄酚16μg、大黄素甲醚8μg的混合对照品储备液；

(3)高效液相色谱法测定本品的对照指纹图谱:取10批大黄蛰虫胶囊供试品在适当的色谱条件下进样，测得各批次供试品的指纹图谱，以这些指纹图谱为基础，用相似度软件计算获得共有模式作为大黄蛰虫胶囊的对照指纹图谱（如图2）；

（4）取对照品溶液按步骤（3)相同的色谱条件进样，测得各对照品溶液的高效液相图谱；

（5）高效液相色谱法测定供试品溶液指纹图谱:取步骤(1)供试品溶液按步骤（3)相同的色谱条件进样，测得供试品溶液的指纹图谱；并根据步骤(4)所得对照品溶液的高效液相图谱归属各色谱峰(图2中峰1为黄芩苷，峰2为黄芩素，峰3为芦荟大黄素，峰4为大黄酸，峰5为大黄素，峰6为大黄酚，峰7为大黄素甲醚)；

(6)将步骤(5)得到的供试品溶液指纹图谱和步骤（3)得到的对照指纹图谱用相似度软件评价(如表5)。

表510批大黄蛰虫胶囊指纹图谱相似度评价结果

以上所述的大黄蛰虫胶囊的指纹图谱检测方法，色谱柱：依利特hypersilods2c18色谱柱(规格)；流动相:a:0.1%磷酸水溶液，b：乙腈；梯度洗脱；流速1.0ml/min；柱温:35℃；进样量20μl。梯度洗脱程序：

检测波长设置：

通过以上实验结果表明，本发明提供的大黄蛰虫胶囊的指纹图谱检测方法，可以客观、全面、有针对性的分析和评价大黄蛰虫胶囊的质量，对保证临床疗效具有重要意义，本发明提供的指纹图谱检测方法，较现有技术单类成分分析，取得了明显的技术进步。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。