用于荧光显微镜的光盘显微术的制作方法

政府利益

本发明是在美国国家科学基金会资助的授权号mcb-1652512的政府支持下完成的。政府拥有本发明的某些权利。

优先权声明

本申请要求于2018年3月12日提交的美国临时专利申请序列号62/641598的权益，其全部内容通过引用合并于此。

本说明书总体涉及荧光显微镜，并且更具体地涉及用于荧光显微镜的光盘(lightdisc)显微术。

背景技术：

光片荧光显微术(lsfm)已经成为一种强大的方法，它通过形成薄的、伪非衍射光“片”来限制荧光显微术的激发体积。这个片通常比样本薄，使得不会生成离焦荧光，并且显着减少了光漂白。借助于lsfm，细胞生物学家已经能够大大延长其活荧光生物体的成像寿命，而无需引入不必要的荧光团的光漂白或样本的光毒性。

lsfm中限制所生成的图像的质量(定性信息)以及以高精度地量化荧光信号的能力(定量信息)的一个当前障碍是“阴影”问题。该阴影问题来自激发光必须通过样本的在光学上不一致的路径。例如，如果光学密集的结构吸收、散射或折射来自光片的光，则位于第一个结构“后面”的光路径更下方的结构将比其他附近的结构受到更低强度的照明。这种阴影效应会沿样本产生条纹图案，条纹图案使得难以量化不同条纹中的荧光强度。

文献中已经呈现了几种缓解条纹伪影的解决方案，例如在单次曝光中快速抖动片以使阴影成锥形，使用具有自然锥形阴影的“自修复”贝塞尔光束(1)，或使用随机照亮彼此的阴影区域的多个共面光片(2)。后一种阴影校正技术的实际示例包括具有两个、四个甚至六个共面光片的显微镜。通过添加每个共面光片，可以减少阴影。引入更多共面光片的缺点是多个片的对准变得更加复杂。另外，由于每个光片都需要单独的透镜，因此对于可引入柱面透镜型的物镜元件的光片的数量有实际限制。

技术实现要素：

本说明书描述了一种用于引入理论上无限数量的共面光片以将lsfm中的阴影降低到理论最小值的解决方案。可以使用单个光学元件(抛物面镜)而不是多个独立定位的柱面透镜来实现这种照明方案。在一些示例中，一种方法包括定位样本，使得样本的受关注平面与显微镜的检测物镜的焦平面共面。该方法包括将抛物面镜定位在样本周围，使得抛物面镜的焦点与检测物镜的焦平面和样本的受关注平面共面。该方法包括将环形准直的激发光的光束引导在抛物面镜上，以将光盘聚焦在样本上，并且从而提供样本的360度横向照明。该方法包括通过检测物镜对样本进行成像。

附图说明

图1是使用荧光显微术对样本进行成像的示例系统的图；

图2是其中抛物面镜反平行于检测物镜安装的示例系统的图；

图3是用于荧光显微镜的示例照明系统的图；

图4是示出通过光的薄“盘”照明的图；

图5是示出光盘照明阴影的图；以及

图6是使用荧光显微术对样本进行成像的方法的流程图。

具体实施方式

本说明书描述了用于使用荧光显微术对样本进行成像的方法、用于使用荧光显微术对样本进行成像的系统以及用于荧光显微镜的照明系统。

图1是用于使用荧光显微术对样本102进行成像的示例系统100的图。系统100包括显微镜的检测物镜104。样本102被定位在例如盖玻片上，使得样本102的受关注平面与检测物镜104的焦平面共面。系统100包括围绕样本102定向的抛物面镜106，使得抛物面镜106的焦点与检测物镜104的焦平面和样本102的受关注平面共面。系统100包括照明系统108，照明系统108被配置用于将环形准直的激发光的光束引导到抛物面镜106上以将光盘聚焦在样本102上，并且用于通过检测物镜104对样本102进行成像。

图1示出了一种潜在的布置，其中抛物面镜可以将环形准直的激发光的光束引导到盖玻片上，以聚焦到荧光样本中衍射受限的“片”，其然后由检测物镜成像。抛物面镜的弯曲特性允许平行于其光轴的任何准直光聚焦到一个点。抛物面镜的应定位为使得其焦点与检测物镜焦平面共面。为了查看样本，还应将其定位为使得受关注平面与检测物镜焦平面共面。

为了与需要盖玻片的高数值孔径(na)的检测物镜兼容，激发光在其到达样本之前不得与玻璃盖玻片相交。因此，必须将环形准直的激发光聚焦，使得最接近盖玻片的边缘光线平行于盖玻片传播。从理论上讲，这可以使用平行于检测物镜(图1)或反平行于检测物镜(图2)安装的抛物面镜实现。图2是其中抛物面镜反平行于检测物镜安装的示例系统的图。

实际上，无限数量的共面光片中的每一个都需要相对于检测物镜焦平面倾斜。这些片需要倾斜的角度的计算首先由fadero等人在2018(3)描述；该计算也可以容易地被应用于抛物面生成的光片。

通过改变环形准直的激发光的厚度，可以调节会聚光束在盖玻片上的有效倾斜角。例如，增加准直光的厚度将成比例地增大聚焦光的会聚角，反之亦然。对于需要盖玻片的物镜，这种照明方法无法以0°倾斜角执行。fadero等(2018)描述了针对任何给定检测物镜优化的光片的空间维度(长度、宽度)和倾斜角(3)。只要针对此设置的倾斜角大于或等于fadero等描述的此非零值(3)，此设置便与任何检测物镜兼容。

为了有效地生成环形准直的光束，我们提议使用图3中描述的技术，该技术涉及两个锥形镜。

图3是用于荧光显微镜的示例照明系统300的图。系统300包括圆锥形内镜302和圆锥形外镜304。圆锥形内镜302和圆锥形外镜304可与抛物面镜(例如，图1的抛物面镜106)一起使用以对样本进行成像。系统300可以包括如下结构(例如运动台或其他合适的装置)：该结构用于将圆锥形内镜302定位在准直的激发光束的中心处，使得激发光围绕圆锥形内镜302以每个角度对称地反射；并且将圆锥形外镜304定位成以锥形内镜302为中心，使得从圆锥形内镜302对称反射的激发光被圆锥形外镜304反射成指向抛物镜的环形准直的激发光的光束。在一些示例中，该结构被配置用于将抛物面镜定位在样本周围，使得抛物面镜的焦点与显微镜的检测物镜的焦平面和样本的受关注平面共面。

圆锥形镜关于激发光传播轴对称，并充当非聚焦镜，使得光保持准直。圆锥形内镜的半角为45°，使得入射到其上的任何准直光均以90°的角度反射。圆锥形内镜应被定位在准直激发光束的中心处，使得光以每个角度对称反射。然后，光被以圆锥形内镜为中心的圆锥形外镜第二次反射。

外镜是反射材料的空心圆锥体，半角为45°。内镜和外镜不必具有正好45°的半角；相反，圆锥形镜的半角应彼此互补(即，它们的总和等于90°)。互补角度确保生成的最终环面不会发散。然后，该环应该入射到上述抛物面聚焦镜上。

图4是示出通过薄的光“盘”照明的图。来自聚焦抛物面镜的聚焦片的性质在理论上形成薄的光“盘”，而不是来自单个聚焦透镜的薄片。这是因为无限数量的径向对称片聚焦到同一点会导致衍射受限的轮廓，其具有恒定的高度(h)和对称的直径(d)，分别类似于光片的宽度(w)和长度(l)。盘和片的侧视图显示在图4的左侧。从这个角度看，盘和片是相同的。

旋转到纸平面的视图表明，盘的横向(x/y)维度不同于片的横向维度，因为所有光都会聚到中心(并从中心发散)。因为会聚光源自单个相干光束，所以该光将在抛物面镜的焦点处形成相干的盘形状，其维度(h和d)由fadero等针对光片维度概述的相同公式描述。

图5是示出光盘照明阴影的图。盘也将具有最小量的阴影，如图5中阻挡光的光学密集对象所示。该阴影减少发生的原因是，盘内的每个点均从所有水平角度被同等照亮。以前的lsfm系统可以通过有限数量的共面光片来近似该盘，但是只有通过无限数量的共面光片才会形成光盘，通过这种形式，阴影可以减少到其理论最小值。

本技术广泛适用于荧光显微术的所有用户，因为它是与任何检测物镜兼容的lsfm形式。这对于活细胞荧光成像特别重要，因为光盘可以减少离焦的荧光信号并减少光漂白/光毒性；然而，该技术可以用在任何适当类型的样本上，包括固定的样本。它甚至更适用于作为对lsfm当前实现方式的显着改进，因为最小的阴影将使lsfm图像质量及其定量信息最大化。

图6是用于使用荧光显微术对样本进行成像的方法600的流程图。方法600包括定位样本，使得样本的受关注平面与显微镜的检测物镜的焦平面共面(602)。方法600包括将抛物面镜定位在样本周围，使得抛物面镜的焦点与检测物镜的焦平面和样本的受关注平面共面(604)，例如，如以上参考图1-2所描述的。方法600包括将环形准直的激发光的光束引导到抛物面镜上，以将光盘聚焦在样本上(606)，例如，如以上参考图3所描述。方法600包括通过检测物镜对样本进行成像(608)。

尽管上面已经描述了特定示例和特征，但是即使在关于特定特征仅描述单个示例的情况下，这些示例和特征也不旨在限制本公开的范围。除非另有说明，否则本公开中提供的特征的示例旨在是说明性的而非限制性的。上文的描述旨在覆盖受益于本公开的本领域技术人员显而易见的替代、修改和等同形式。

本公开的范围包括在本说明书中公开的任何特征或特征的组合(明确地或隐含地)，或所公开的特征的任何概括，无论这些特征或概括是否缓解了本说明书中描述的任何或所有问题。因此，可以在对本申请(或要求本申请优先权的申请)的审查期间对特征的任何这种组合提出新的权利要求。特别地，参考所附权利要求，可以将从属权利要求的特征与独立权利要求的特征相结合，并且可以以任何适当的方式而不是仅以所附权利要求中列举的特定组合的方式将各个独立权利要求的特征相结合。

参考文献

以下参考文献中的每一个均通过引用整体并入本文。

1.chen,b.c.,w.r.legant,k.wang,l.shao,d.e.milkie,m.w.davidson,c.janetopoulos,x.s.wu,j.a.hammeriii,z.liu,etal.2014.latticelight-sheetmicroscopy:imagingmoleculestoembryosathighspatiotemporalresolution.science.346:1257998.doi:10.1126/science.1257998

2.huisken,j.andstainier,d.y.r.2007.evenfluorescenceexcitationbymultidirectionalselectiveplaneilluminationmicroscopy(mspim).opticslett.32(17),2608-2610.

3.fadero,t.c.,gerbich,t.m.,rana,k.,suzuki,a.,disalvo,m.,schaefer,k.n.,heppert,j.k.,boothby,t.c.,goldstein,b.,peifer,m.,allbritton,n.l.,gladfelter,a.s.,maddox,a.s.,andmaddox,p.s.2018.litemicroscopy:tiltedlight-sheetexcitationofmodelorganismsoffershighresolutionandlowphotobleaching.journ.cellbiol.doi:10.1083/jcb.201710087