一种甲硝唑原料药中残留溶剂乙二醇和二甘醇的检测方法与流程

本发明涉及甲硝唑原料残留溶剂乙二醇与二甘醇的检测方法
技术领域：
，更具体的说是涉及一种甲硝唑原料药中残留溶剂乙二醇和二甘醇的检测方法。
背景技术：
：甲硝唑原料药是一种硝基咪唑类抗生素原料药，甲硝唑原料药在生产过程中会残留溶剂，其中两个主要残留溶剂为乙二醇和二甘醇，需要检测甲硝唑原料药中含有的残留溶剂含量，可以直观地反映出甲硝唑原料药的质量。现有技术中，采用的是外标法进行测定，但是对于甲硝唑原料药残留溶剂的测量方法无法做到对照与样品加标平行，无法通过外标法计算目标物含量，所以无法准确测量甲硝唑原料药中的残留溶剂含量。技术实现要素：针对现有技术存在的不足之处，本发明的目的在于提供一种甲硝唑原料药中残留溶剂的检测方法，可定性或可定量地检测出甲硝唑中残留溶剂乙二醇与二甘醇，从而保证了甲硝唑的质量、提高临床用药的安全性。为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：一种甲硝唑原料药中残留溶剂乙二醇和二甘醇的检测方法，包括以下步骤：步骤1：配制甲硝唑供试品溶液：取甲硝唑适量溶于甲醇中得到甲硝唑甲醇饱和溶液；步骤2：线性梯度加标溶液的配制：取甲硝唑适量溶解于至少两个不同体积比的甲醇和对照储备液的混合溶液中得到线性梯度加标溶液；步骤3：取步骤1-步骤2中得到的各溶液中的上清液，分别注入气相色谱仪中进行分析测定；记录气相色谱仪中所产生的色谱图，以线性梯度加标溶液浓度与所得峰面积关系制成线性方程，若有检出则将供试品目标峰面积带入线性方程中计算残留浓度。上述步骤1中，所述甲硝唑甲醇饱和溶液的具体配制步骤为：取甲硝唑适量，加入甲醇，在温度为58℃～62℃的水浴条件下加热溶解，然后冷却至晶体不再析出，取上清液即为甲硝唑甲醇饱和溶液。上述步骤2中，所述线性梯度加标溶液包括基准线性加标溶液a，线性加标溶液b，线性加标溶液c，线性加标溶液d，线性加标溶液e，其中，线性加标溶液b中对照储备液的浓度为基准线性加标溶液a中对照储备液的浓度的40％；线性加标溶液c中对照储备液的浓度为基准线性加标溶液a中对照储备液的浓度的60％；线性加标溶液d中对照储备液的浓度为基准线性加标溶液a中对照储备液的浓度的160％；线性加标溶液e中对照储备液的浓度为基准线性加标溶液a中对照储备液的浓度的200％。进一步的技术方案在于，所述步骤2中，所述的甲醇和对照储备液的体积比为98-90:2-10；其中，在基准线性加标溶液a中，甲醇和对照储备液的体积比分别为95:5；在线性加标溶液b中，甲醇和对照储备液的体积比分别为98:2；在线性加标溶液c中，甲醇和对照储备液的体积比分别为97:3；在线性加标溶液d中，甲醇和对照储备液的体积比分别为92:8；在线性加标溶液e中，甲醇和对照储备液的体积比分别为90:10。进一步的，所述步骤2中，所述甲硝唑溶解在甲醇和对照储备液的混合溶液中的温度条件为：58℃～62℃的水浴。进一步的，所述对照储备液为乙二醇、二甘醇和甲醇的混合溶液。上述步骤3中，气相色谱仪的色谱条件如下：色谱柱为hp-innowax或db-wax；载气为氮气。进一步的，所述步骤3中，所述气相色谱仪中的柱温程序为110℃维持3～8分钟，以每分钟20℃的速率升温至150℃，维持8～10分钟，再以40℃的速率升温至240℃，维持18-25分钟。进一步的，所述步骤3中，其中色谱条件如下：气相色谱仪中的检测器采用fid检测器，fid检测器的检测器温度为290～300℃。进一步的，所述步骤3中，气相色谱仪采用液体进样，进样体积为1.0～2.0μl，进样口温度为240～255℃，色谱柱流量为0.9～1.1ml/min，分流比为5：1。本发明与现有技术相比具有的有益效果是：本发明具有专属性强、灵敏度高、精密度好、耐用性强等优点，可定性或可定量检测出甲硝唑原料药中残留溶剂乙二醇和二甘醇，从而保证了甲硝唑的质量、提高临床用药的安全性。附图说明图1为乙二醇线性方程示意图；图2为二甘醇线性方程示意图。具体实施方式下面结合实施例对本发明作进一步的描述，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，并不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域的普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的其他所有实施例，都属于本发明的保护范围。实施例1:一种甲硝唑原料药中残留溶剂乙二醇和二甘醇的检测方法，包括以下步骤：步骤1：配制甲硝唑供试品溶液：从甲硝唑原料药中取出1.0g样品置20ml顶空瓶中，加入甲醇10ml并密封，于60℃水浴加热并时时振摇至完全溶解，放冷至晶体不再析出，取上清液离心；步骤2：线性梯度加标溶液的配制：配制基准线性加标溶液a：从甲硝唑原料药中取出样品1.0g置顶空瓶中，加入甲醇9.5ml和对照储备液0.5ml，密封，于60℃水浴加热并时时振摇至完全溶解，放冷至晶体不再析出，取上清液离心；配制线性加标溶液b：从甲硝唑原料药中取出样品1.0g置顶空瓶中，加入甲醇9.8ml和对照储备液0.2ml，密封，于60℃水浴加热并时时振摇至完全溶解，放冷至晶体不再析出，取上清液离心；配制线性加标溶液c：从甲硝唑原料药中取出样品1.0g置顶空瓶中，加入甲醇9.7ml和对照储备液0.3ml，密封，于60℃水浴加热并时时振摇至完全溶解，放冷至晶体不再析出，取上清液离心；配制线性加标溶液d：从甲硝唑原料药中取出样品1.0g置顶空瓶中，加入甲醇9.2ml和对照储备液0.8ml，密封，于60℃水浴加热并时时振摇至完全溶解，放冷至晶体不再析出，取上清液离心；配制线性加标溶液e：从甲硝唑原料药中取出样品1.0g置顶空瓶中，加入甲醇9.0ml和对照储备液1.0ml，密封，于60℃水浴加热并时时振摇至完全溶解，放冷至晶体不再析出，取上清液离心；步骤3：取步骤1-步骤2中得到的各溶液中的上清液，分别注入气相色谱仪中进行分析测定；其中色谱条件如下：色谱柱为色谱柱为hp-innowax或db-wax；毛细管柱的规格为30m×0.25mm×0.25μm；载气为氮气；所述气相色谱仪中的柱温程序为110℃维持3～8分钟，以每分钟20℃的速率升温至150℃，维持8～10分钟，再以40℃的速率升温至240℃，维持18-25分钟。气相色谱仪中的检测器采用fid检测器，fid检测器的检测器温度为290～300℃。气相色谱仪采用液体进样，进样体积为1.0～2.0μl，进样口温度为240～255℃，色谱柱流量为0.9～1.1ml/min，分流比为5：1。记录气相色谱仪中所产生的色谱图，以线性梯度加标溶液浓度与所得峰面积关系制成线性方程，若有检出则将供试品目标峰面积带入线性方程中计算残留浓度。上述步骤1中，所述甲硝唑甲醇饱和溶液的具体配制步骤为：取甲硝唑适量，加入甲醇，在温度为58℃～62℃的水浴条件下加热溶解，然后冷却至晶体不再析出，取上清液即为甲硝唑甲醇饱和溶液。在本实施例中，对照储备液为乙二醇与二甘醇和甲醇的混合溶液，配制方法为：精密称取乙二醇63.20mg与二甘醇51.10mg置于同一100ml量瓶中，加甲醇溶解定容至100ml刻度处，作为对照储备液。在配制各线性梯度加标溶液的过程中，对照储备液的浓度均相同。乙二醇与二甘醇的比例和浓度可以任意调整，只要满足检测要求(即浓度不能低于定量限)即可。由上述可以得知，所述线性梯度加标溶液包括基准线性加标溶液a，线性加标溶液b，线性加标溶液c，线性加标溶液d，线性加标溶液e，其中，线性加标溶液b中对照储备液的浓度为基准线性加标溶液a中对照储备液的浓度的40％；线性加标溶液c中对照储备液的浓度为基准线性加标溶液a中对照储备液的浓度的60％；线性加标溶液d中对照储备液的浓度为基准线性加标溶液a中对照储备液的浓度的160％；线性加标溶液e中对照储备液的浓度为基准线性加标溶液a中对照储备液的浓度的200％。测定法：以标准加入法进行计算，以所得峰面积(扣除供试品中目标峰面积)和进样浓度制成线性方程。将供试品目标峰面积带入回归方程计算残留溶剂含量。c供＝ka+b式中：k为线性溶液以所得峰面积(扣除供试品中目标峰面积)和进样浓度制成线性方程的斜率。b为线性溶液以所得峰面积(扣除供试品中目标峰面积)和进样浓度制成线性方程的截距。a为供试品溶液中残留溶剂峰面积。c供表示供试品溶液中残留溶剂峰面积代入线性方程计算后所得的浓度，mg/ml；m供表示供试品称样量，mg；v供表示供试品溶液稀释体积，ml。线性实验：40％线性加标溶液(线性加标溶液b)：精密称取甲硝唑1.0g，置20ml顶空瓶中，精密加入0.2ml对照储备液，再精密加入甲醇9.8ml，密塞，60℃加热振摇使溶解，放冷至晶体不再析出，取上清液即得。60％线性加标溶液(线性加标溶液c)：精密称取甲硝唑1.0g，置20ml顶空瓶中，精密加入0.3ml对照储备液，再精密加入甲醇9.7ml，密塞，60℃加热振摇使溶解，放冷至晶体不再析出，取上清液即得。100％线性加标溶液(基准线性加标溶液a)：精密称取甲硝唑1.0g，置20ml顶空瓶中，精密加入0.5ml对照储备液，再精密加入甲醇9.5ml，密塞，60℃加热振摇使溶解，放冷至晶体不再析出，取上清液即得。160％线性加标溶液(线性加标溶液d)：精密称取甲硝唑1.0g，置20ml顶空瓶中，精密加入0.8ml对照储备液，再精密加入甲醇9.2ml，密塞，60℃加热振摇使溶解，放冷至晶体不再析出，取上清液即得。200％线性加标溶液(线性加标溶液e)：精密称取甲硝唑1.0g，置20ml顶空瓶中，精密加入1.0ml对照储备液，再精密加入甲醇9.0ml，密塞，60℃加热振摇使溶解，放冷至晶体不再析出，取上清液即得。乙二醇在0.012514～0.062570mg/ml限度浓度范围内，线性方程为y＝1512.5x-1.1618；相关系数r为0.9996，大于0.990，表明线性关系良好。二甘醇在0.010118～0.050590mg/ml限度浓度范围内，线性方程为y＝1612.2x-1.2831；相关系数r为0.9998，大于0.990，表明线性关系良好。统计结果见表1线性范围。以上述举例所得的线性方程如下表1：表1线性范围灵敏度实验：乙二醇定量限溶液：精密量取乙二醇单标储备溶液(0.6355mg/ml)3ml，置100ml量瓶中，用甲醇稀释定容。精密量取该溶液1ml，加入甲硝唑1g，置20ml顶空瓶中，精密加入甲醇9.0ml，密塞，60℃加热振摇使溶解，放冷至晶体不再析出，取上清液即得。浓度：1.9065μg/ml。乙二醇检测限溶液：精密量取乙二醇单标储备溶液(0.6355mg/ml)3ml，置100ml量瓶中，用甲醇稀释定容。精密量取该溶液0.3ml，加入甲硝唑1g，置20ml顶空瓶中，精密加入甲醇9.0ml，密塞，60℃加热振摇使溶解，放冷至晶体不再析出，取上清液即得。浓度：0.5720μg/ml。二甘醇定量限溶液：精密量取二甘醇单标储备溶液(0.5052mg/ml)7ml，置100ml量瓶中，用甲醇稀释定容。精密量取该溶液1ml，加入甲硝唑1g，置20ml顶空瓶中，精密加入甲醇9.0ml，密塞，60℃加热振摇使溶解，放冷至晶体不再析出，取上清液即得。浓度：3.5364μg/ml。二甘醇检测限溶液：精密量取二甘醇单标储备溶液(0.5052mg/ml)7ml，置100ml量瓶中，用甲醇稀释定容。精密量取该溶液0.3ml，加入甲硝唑1g，置20ml顶空瓶中，精密加入甲醇9.0ml，密塞，60℃加热振摇使溶解，放冷至晶体不再析出，取上清液即得。浓度：1.0610μg/ml。以基线噪音3-5倍为方法检测限，以基线噪音的10倍以上为方法的定量限，乙二醇浓度1.9065μg/ml(相当于限度浓度的0.002％，信噪比为13.3)为定量限，乙二醇浓度0.5720μg/ml(相当于限度浓度的0.001％，信噪比为4.4)为检测限；二甘醇浓度3.5364μg/ml(相当于限度浓度的0.004％，信噪比为14.3)为定量限，二甘醇浓度1.0610μg/ml(相当于限度浓度的0.001％，信噪比为3.6)为检测限。灵敏度满足残留溶剂测定要求，统计结果见表2灵敏度结果。表2灵敏度结果乙二醇二甘醇定量限信噪比13.314.3定量限浓度1.9065μg/ml3.5364μg/ml最小定量量0.002％0.004％检测限信噪比4.43.6检测限浓度0.5720μg/ml1.0610μg/ml，最小检出量0.001％0.001％定量限重复性实验：照上述定量限溶液制备方法，平行制备6份作为定量限重复性，定量限重复性溶液中乙二醇保留时间的rsd值为0.04％，小于2％，峰面积的rsd值为17.43％，小于20％；二甘醇保留时间的rsd值为0.07％，小于2％，峰面积的rsd值为19.96％，小于20％，表明定量限重复性良好。统计结果见表3定量限重复性。表3定量限重复性准确度试验：供试品溶液：从甲硝唑原料药中取出1.0g样品置20ml顶空瓶中，加入甲醇10ml并密封，于60℃水浴加热并时时振摇至完全溶解，放冷至晶体不再析出；对照储备液：乙二醇、二甘醇和甲醇的混合对照储备液制备：精密称取乙二醇63.20mg与二甘醇51.10mg置于同一100ml量瓶中，加甲醇溶解定容至100ml刻度处，作为对照储备液。40％线性加标溶液(线性加标溶液b)：精密称取甲硝唑1.0g，置20ml顶空瓶中，精密加入0.2ml对照储备液，再精密加入甲醇9.8ml，密塞，60℃加热振摇使溶解，放冷至晶体不再析出，取上清液即得。60％线性加标溶液(线性加标溶液c)：精密称取甲硝唑1.0g，置20ml顶空瓶中，精密加入0.3ml对照储备液，再精密加入甲醇9.7ml，密塞，60℃加热振摇使溶解，放冷至晶体不再析出，取上清液即得。平行制备3份。100％线性加标溶液(基准线性加标溶液a)：精密称取甲硝唑1.0g，置20ml顶空瓶中，精密加入0.5ml对照储备液，再精密加入甲醇9.5ml，密塞，60℃加热振摇使溶解，放冷至晶体不再析出，取上清液即得。平行制备3份。160％线性加标溶液(线性加标溶液d)：精密称取甲硝唑1.0g，置20ml顶空瓶中，精密加入0.8ml对照储备液，再精密加入甲醇9.2ml，密塞，60℃加热振摇使溶解，放冷至晶体不再析出，取上清液即得。平行制备3份。200％线性加标溶液(线性加标溶液e)：精密称取甲硝唑1.0g，置20ml顶空瓶中，精密加入1.0ml对照储备液，再精密加入甲醇9.0ml，密塞，60℃加热振摇使溶解，放冷至晶体不再析出，取上清液即得。平行制备3份。照既定方法进行测定其含量，再与加入量进行比较，计算回收率。结论：相对于基准线性加标溶液a中对照储备液的浓度的不同百分比(60％-160％)的供试品溶液中乙二醇与二甘醇的平均回收率分别为97.78％、97.60％，均在90％-108％之间，rsd值分别为1.49％、2.88％均小于6％，表明该方法准确度良好。结果见表4乙二醇与二甘醇准确度试验结果。表4乙二醇与二甘醇准确度试验结果重复性试验100％线性加标溶液(基准线性加标溶液a)：取本品1.0g，精密称定，置20ml顶空瓶中，精密加入0.5ml对照品储备液，再精密加入甲醇9.5ml，密塞，60℃加热振摇使溶解，放冷至晶体不再析出，取上清液即得。平行制备6份。结论：100％线性加标溶液6份样品中，乙二醇与二甘醇平均回收率分别为98.07％、98.01％，rsd％分别为1.22％、2.78％均小于5％，重复性良好，结果见表5。表5重复性试验结果乙二醇回收率％二甘醇回收率％重复性198.8498.26重复性296.5997.53重复性396.7194.48重复性498.92102.85重复性597.9197.03重复性699.4297.91平均值98.0798.01rsd％1.222.78耐用性试验取色谱柱db-wax0.25mm*30m*0.25μm；按照既定方法同步检测100％线性加标溶液(基准线性加标溶液a)。结论：不同色谱柱间相对偏差较低，色谱柱均符合系统适用性要求，方法耐用性良好，结果见表6耐用性结果。表6耐用性结果乙二醇回收率％二甘醇回收率％hp-innowax98.8498.26db-wax99.8699.77相对偏差％0.510.76以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页12