一种多元分析的蛇毒混合物分析荧光传感器的制作方法

本发明属于生化领域中荧光检测分析方法，具体涉及对多种蛇毒蛋白与混合物复杂样品分析进行多元荧光分析技术。

背景技术：

蛇毒是从有毒蛇的有毒腺体分泌的液体。它的有毒成分主要是具有酶活性的有毒蛋白质，酶和毒素大约包含二十种。此外，它还包含一些小分子肽，氨基酸，碳水化合物，脂质，核苷，生物胺和金属离子。蛇毒的成分非常复杂，不同蛇毒的毒性，药理作用和毒理作用各有特点。蛇毒对生物的作用更为复杂，不同种类蛇毒所含的蛋白质和多肽不同，按其毒性成分的毒理作用可分为神经毒，血液毒和混合毒。按其性质不同，又可分为神经毒素，心脏毒素，溶血毒素，凝血毒素和抗凝血毒素。这提供了识别和区分不同类型的蛇毒中毒的可能性。

自然界中，人类的嗅觉与味觉系统可以对周围环境中的多种气味分子进行辨别，这得益于气味受体细胞的非特异性响应。anslyn等科学家通过对嗅觉与味觉识别过程的仿生发展了一种新的传感模式-传感阵列。传感阵列基于“多对多”模式，它由多种传感化合物分子进行有序的排列而组成的，通过对这些成系列的多个传感分子的差别性响应结果的分析，最终实现对多种检测底物的高通量“指纹识别”。

近年来，交叉响应传感阵列为食品检测、环境监测、药物筛选、临床诊断等与人们生活息息相关的方方面面提供了便捷、高效的手段和方法。在本文中，我们通过不同蛋白质荧光染料结合不同蛋白后所展现出的特异性响应信号，实现了对7种蛇毒蛋白的轻松鉴定，该蛋白选择性地结合到蛇毒蛋白上，从而改变了其荧光强度。这为我们提供了一种简单，快速且准确的新方法来区分蛇毒蛋白。

技术实现要素：

本发明的目的是为了提供一种操作简单、使用灵活，能有效辨别蛇毒蛋白的方法。本发明的目的是通过以下措施来实现的：

一、本发明提供一种荧光传感阵列，该荧光传感阵列包括基底以及在所述基底上的荧光染料和蛇毒蛋白溶液，荧光传感阵列制备用于对多种蛇毒蛋白与混合物复杂样品分析。

二、本发明根据所要检测的蛇毒蛋白，选择普适性结合的荧光染料，研究其荧光定量关系，为确定所选择的荧光染料与蛇毒蛋白结合后荧光强度能够产生具有特异性的变化，该方法包括以下步骤：

(1)代表性蛋白原液配置

6种代表性蛋白：磷脂酶a2、α-神经毒素、心脏毒素、透明质酸酶、凝血酶、血凝酶冻干粉配置于去离子水中。所有溶液避光置于4℃冰箱备用。

(2)染料的配置

4种染料：曙红y、异硫氰酸荧光素异构体i、磺酰罗丹明b、达旦黄配置于去离子水中。所有溶液避光置于4℃冰箱中备用。

(3)染料吸收、发射波长的测定

分别将配置好的染料溶液和空白（只含有去离子水）溶液放入紫外-可见分光光度计中测定并记录其吸收波长。之后分别将配置好的染料放入荧光分光光度计中，根据其吸收波长测得它们的发射波长及原始荧光强度。

(4)蛋白与染料结合所用时间与荧光强度的关系

设定在20分钟内，每2分钟测一次分别加入6种代表性蛋白后4种染料的荧光强度，观察其荧光强度的变化。

三、本发明提供一种辨别蛇毒蛋白的荧光传感阵列的制备方法，该方法包括以下步骤：

用16通道移液枪将40μl的4种染料按列加入384孔板中，保持一行是单一的染料，作为空白样（blank）。然后按列加入40μl的蛇毒蛋白溶液，保持一列是没有蛋白的染料，作为对照样（control）。

四、通过不同蛋白结合不同荧光染料后表现出的荧光信号的不同，本发明一种基于多元分析方法的蛇毒混合物分析技术可分析辨别出蛇毒中同一浓度的不同代表性蛋白，浓度不同的代表性蛋白以及不同浓度梯度的代表性蛋白。

五、通过不同蛋白对不同荧光染料的结合程度、结合方式不同，所表现出来的独特的荧光指纹信号，本发明一种基于多元分析方法的蛇毒混合物分析技术可分析辨别出蛇毒中多组分混合蛋白，以及七种不用种类的蛇毒蛋白。

四、五所述的多元分析方法具体步骤如下：

(1)代表性蛋白溶液的配置

6种代表性蛋白（磷脂酶a2、α-神经毒素、心脏毒素、透明质酸酶、凝血酶、血凝酶）以1mg/ml的浓度分别配置于去离子水中。所有溶液避光置于4℃冰箱备用。

(2)荧光染料溶液及空白对照溶液的配制

4种染料（曙红y、异硫氰酸荧光素异构体i、磺酰罗丹明b、达旦黄）分别以6.054×103mg/ml、194.690×103mg/ml、14.516×103mg/ml、17.393×103mg/ml的浓度配置于去离子水中。空白对照溶液为去离子水。所有溶液避光置于4℃冰箱中备用。

(3)不同的浓度代表性蛋白溶液的配置

用去离子水配置浓度不同的为血凝酶、心脏毒素、α-神经毒素、磷脂酶a2、透明质酸酶、凝血酶。所有溶液置于4℃冰箱中备用。

(4)多浓度梯度的代表性蛋白溶液的配置

分别将凝血酶、α-神经毒素、磷脂酶a2粉末以一定的浓度梯度配置于去离子水中。所有溶液置于4℃冰箱中备用。

(5)蛋白混合物溶液的配置

分别将磷脂酶a2、透明质酸酶、心脏毒素、α-神经毒素、凝血酶及血凝酶粉末溶于去离子水中后按相同比例混合，组合成以下7种组分：磷脂酶a2和α-神经毒素，α-神经毒素和血凝酶，α-神经毒素和凝血酶，凝血酶和血凝酶，透明质酸酶、心脏毒素和α-神经毒素，透明质酸酶、心脏毒素和血凝酶，磷脂酶a2、血凝酶和凝血酶。

(6)七种蛇毒蛋白溶液的配置

分别取长白山白眉蝮蛇蛇毒蛋白、银环蛇蛇毒蛋白、五步蛇蛇毒蛋白、蝰蛇蛇毒蛋白、眼镜蛇蛇毒蛋白、江浙蝮蛇蛇毒蛋白及眼镜王蛇蛇毒蛋白粉末配置于去离子水中。所有溶液避光置于4℃冰箱备用。

(7)多凝胶分析系统对荧光传感阵列进行分析检测。

制备荧光传感阵列，其中本发明所述蛋白溶液分别为措施一到五中所述代表性蛋白溶液、不同的浓度代表性蛋白溶液、多浓度梯度的代表性蛋白溶液，七种不同种类的蛇毒蛋白溶液，七种多组分混合蛋白溶液，应用多凝胶分析系统在激发波长302nm和365nm的条件下，对荧光传感阵列进行分析检测，记录6个通道（ch：450nm，ch：480nm，ch：505nm，ch：535nm，ch：570nm，ch：605nm）的荧光传感信息。

(8)lda和hca分析

采用线性判别分析（lda）和分层聚类分析（hca）的方法，对这蛇毒蛋白溶液进行判别分析。

本发明在措施二（1）、措施四（1）中所用代表性蛋白溶液浓度均为1mg/ml。

本发明在措施二（2）、措施四（2）中所用染料曙红y、异硫氰酸荧光素异构体i、磺酰罗丹明b、达旦黄分别以6.054×103mg/ml、194.690×103mg/ml、14.516×103mg/ml、17.393×103mg/ml的浓度。

本发明在措施四所述步骤（3）中所用的代表性蛋白溶液浓度分别为为0.01mg/ml血凝酶、0.05mg/ml心脏毒素、0.1mg/mlα-神经毒素、0.5mg/ml磷脂酶a2、1mg/ml透明质酸酶、5mg/ml凝血酶。

本发明在措施四中所述步骤(4)中凝血酶、α-神经毒素、磷脂酶a2溶液浓度梯度为0.01mg/ml、0.02mg/ml、0.05mg/ml、0.1mg/ml、0.2mg/ml、0.5mg/ml。

本发明在措施五中所述步骤(6)中用的七种蛇毒蛋白粉末均为0.001g，均配置为浓度为1mg/ml的蛇毒蛋白溶液。

本发明在措施五中所述步骤(5)中所述组合后蛋白粉末均为0.001g。配成蛋白溶液后，组合成的7种组分的混合复杂蛋白浓度均为1mg/ml。

有益效果在于：本发明利用荧光染料和蛇毒蛋白的络合作用，设计了荧光传感阵列，用于蛇毒中六种代表性蛋白及自然界7种蛇毒蛋白的交叉响应识别。我们所设计的荧光传感阵列还有助于识别毒性相似的蛇毒蛋白，对于不同浓度和不同组分的蛋白混合物，该荧光传感阵列也能进行正确识别。响应和信号处理单元的集成传感阵列促进了高效的多分析检测和复杂的系统分析，并将促进对快速临床诊断的临床追求以及用于对治疗癌症、肿瘤药物的研发。

附图说明

附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。

图1.本发明实施例1中，在20分钟内4种染料溶液对不同代表性蛋白响应的荧光强度随时间变化的荧光光谱。

图1(a)加入α-神经毒素（1×10-3mg/ml）。(b)加入血凝酶（1×10-3mg/ml）。(c)加入α-神经毒素（1×10-3mg/ml）。(d)加入凝血酶（1×10-3mg/ml）。

注：因图（a）中荧光数值变化过大，作图时采用log10的方式作出。

图2.本发明实施例2中，蛇毒中六种代表性蛋白的lda图与hca图。

(a)荧光传感阵列对6种代表性蛋白的识别lda结果。(b)荧光传感阵列对6种代表性蛋白的识别hca结果。

图3.本发明实施例3中，6种不同浓度代表性蛋白的lda图。

图4.本发明实施例4中，多浓度梯度蛋白lda图及jackknifed分类矩阵图。

(a)荧光传感阵列对多浓度梯度蛋白的识别lda结果。(b)荧光传感阵列辨别多浓度蛋白的jackknifed分类矩阵图。备注：t：凝血酶，c：α-神经毒素，p：磷脂酶a2，d：0.01mg/ml，e：0.02mg/ml，f：0.05mg/ml，x：0.1mg/ml，y：0.2mg/ml，z：0.5mg/ml.

图5.本发明实施例5中，7种蛇毒蛋白lda图与hca图。

(a)荧光传感阵列对7种蛇毒蛋白的识别lda结果。(b)荧光传感阵列对7种蛇毒蛋白的识别hca结果。

图6.本发明实施例6中，7种不同组分蛋白混合物lda图及jackknifed分类矩阵图。

（a）6种蛋白和它们二组分及三组分混合物的识别lda散点图。a-f分别为磷脂酶a2、透明质酸酶、心脏毒素、α-神经毒素、血凝酶、凝血酶。混合物的浓度均为为1×10-3mg/ml。(b)荧光传感阵列辨别多组分蛋白混合物的jackknifed分类矩阵图。

具体实施方式

以下结合附图，对本发明的技术方案作进一步阐释：

在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开

实施例1：20分钟内4种染料溶液对不同代表性蛋白响应的荧光强度随时间变化的荧光光谱

分别将6种蛋白（磷脂酶a2、α-神经毒素、心脏毒素、胰蛋白酶、凝血酶、血凝酶）以1mg/ml的浓度分别配置于去离子水中，另将4种染料（曙红y、异硫氰酸荧光素异构体i、磺酰罗丹明b、达旦黄）分别以6.054×103mg/ml、194.690×103mg/ml、14.516×103mg/ml、17.393×103mg/ml的浓度配置于去离子水中。将这6种蛋白分别加入这4种染料中，在20min内每隔2min测定其荧光强度，观察荧光变化。

实施例2：蛇毒中六种代表性蛋白的辨别分析

分别将6种蛋白（磷脂酶a2、α-神经毒素、心脏毒素、胰蛋白酶、凝血酶、血凝酶）以1mg/ml的浓度分别配置于去离子水中，另将4种染料（曙红y、异硫氰酸荧光素异构体i、磺酰罗丹明b、达旦黄）分别以6.054×103mg/ml、194.690×103mg/ml、14.516×103mg/ml、17.393×103mg/ml的浓度配置于去离子水中，用16通道移液枪将40μl的4种染料按列加入384孔板中，保持一行是单一的染料，作为空白样（blank）。然后按列加入40μl的6种代表性蛋白溶液，保持一列是没有蛋白的染料，作为对照样（control）。将制备好的传感阵列放入多通道凝胶分析系统中进行辨别分析，并采用线性判别分析（lda）进行识别和分层聚类分析（hca）对蛇毒中六种代表性蛋白之间的亲缘关系进行分析。

实施例3：蛇毒中六种分别在不同浓度代表性蛋白的辨别分析

分别将浓度为0.01mg/ml血凝酶、0.05mg/ml心脏毒素、0.1mg/mlα-神经毒素、0.5mg/ml磷脂酶a2、1mg/ml透明质酸酶、5mg/ml凝血酶配置于去离子水中，另将4种染料（曙红y、异硫氰酸荧光素异构体i、磺酰罗丹明b、达旦黄）分别以6.054×103mg/ml、194.690×103mg/ml、14.516×103mg/ml、17.393×103mg/ml的浓度配置于去离子水中，用16通道移液枪将40μl的4种染料按列加入384孔板中，保持一行是单一的染料，作为空白样（blank）。然后按列加入40μl的6种代表性蛋白溶液，保持一列是没有蛋白的染料，作为对照样（control）。将制备好的荧光传感阵列放入多通道凝胶分析系统中进行辨别分析，并采用线性判别分析（lda）进行识别。

实施例4:蛇毒中三种代表性蛋白在不同浓度梯度下的辨别分析

分别将凝血酶、α-神经毒素、磷脂酶a2粉末以0.01mg/ml、0.02mg/ml、0.05mg/ml、0.1mg/ml、0.2mg/ml、0.5mg/ml的浓度梯度配置于去离子水中，另将4种染料（曙红y、异硫氰酸荧光素异构体i、磺酰罗丹明b、达旦黄）分别以6.054×103mg/ml、194.690×103mg/ml、14.516×103mg/ml、17.393×103mg/ml的浓度配置于去离子水中，用16通道移液枪将40μl的4种染料按列加入384孔板中，保持一行是单一的染料，作为空白样（blank）。然后按列加入40μl的6种代表性蛋白溶液，保持一列是没有蛋白的染料，作为对照样（control）。将制备好的传感阵列放入多通道凝胶分析系统中进行辨别分析，并采用线性判别分析（lda）和jackknifed分类矩阵进行识别。

实施例5：7种多组分混合蛋白的辨别分析

分别取磷脂酶a2、透明质酸酶、心脏毒素、α-神经毒素、凝血酶及血凝酶粉末0.001g，加入1ml去离子水中，浓度均为1mg/ml。用磁力搅拌器搅拌，使其充分混匀、溶解。之后分别将它们按相同比例混合，组合成以下7种组分：磷脂酶a2和α-神经毒素，α-神经毒素和血凝酶，α-神经毒素和凝血酶，凝血酶和血凝酶，透明质酸酶、心脏毒素和α-神经毒素，透明质酸酶、心脏毒素和血凝酶，磷脂酶a2、血凝酶和凝血酶；另将4种染料（曙红y、异硫氰酸荧光素异构体i、磺酰罗丹明b、达旦黄）分别以6.054×103mg/ml、194.690×103mg/ml、14.516×103mg/ml、17.393×103mg/ml的浓度配置于去离子水中，用16通道移液枪将40μl的4种染料按列加入384孔板中，保持一行是单一的染料，作为空白样（blank）。然后按列加入40μl的七种组分混合蛋白溶液，保持一列是没有蛋白的染料，作为对照样（control）。将制备好的传感阵列放入多通道凝胶分析系统中进行辨别分析，并采用线性判别分析（lda）和jackknifed分类矩阵进行识别。

实施例6：7种蛇毒蛋白的辨别分析

分别取长白山白眉蝮蛇蛇毒蛋白、银环蛇蛇毒蛋白、五步蛇蛇毒蛋白、蝰蛇蛇毒蛋白、眼镜蛇蛇毒蛋白、江浙蝮蛇蛇毒蛋白及眼镜王蛇蛇毒蛋白粉末0.001g，加入1ml去离子水中，是浓度为1mg/ml，另将4种染料（曙红y、异硫氰酸荧光素异构体i、磺酰罗丹明b、达旦黄）分别以6.054×103mg/ml、194.690×103mg/ml、14.516×103mg/ml、17.393×103mg/ml的浓度配置于去离子水中，用16通道移液枪将40μl的4种染料按列加入384孔板中，保持一行是单一的染料，作为空白样（blank）。然后按列加入40μl的6种代表性蛋白溶液，保持一列是没有蛋白的染料，作为对照样（control）。将制备好的传感阵列放入多通道凝胶分析系统中进行辨别分析，并采用线性判别分析（lda）进行识别，和分层聚类分析（hca）对七种蛇毒蛋白之间的亲缘关系进行分析。。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。