本发明涉及黄曲霉素b1检测方法
技术领域：
，具体涉及一种胶体金溶液的制备方法及检测黄曲霉素b1的胶体金方法与试剂盒。
背景技术：
：黄曲霉毒素b1(aflatoxinb1称afb1)是真菌的次级代谢产物，主要是由黄曲霉(aspergillusflavus)、寄生曲霉(aspergillusparasiticus)和特曲霉(aspergillusnomius)产生。它易天然存在于花生、棉籽、玉米、小麦和稻米等农作物中，具有强烈的毒性和致癌性。黄曲霉毒素b1的分子式为c17h12o6，化学结构如下：其结构中含有一个双呋喃环和一个香豆素，前者为基本毒性结构，后者与其致癌性有关。黄曲霉毒素b1对雏鸭的半致死量仅为0.3mg/kg体重，其毒性为氰化钾的10倍，砒霜的68倍。当食品、饲料及其相关制品保存不当极易受到黄曲霉毒素b1的污染，黄曲霉毒素b1进入人体后，其主要靶器官为肝脏，急性中毒症状为恶心、呕吐、胃肠大出血而死亡。慢性中毒主要会引起肝癌，还可以诱发骨癌、肾癌、直肠癌等。目前，我国规定各种食物或饲料中黄曲霉毒素b1的最高允许量根据来源不同为0.5～20.0μg/kg。国际上aft最大允许含量不断降低，2004年欧盟再次修订对婴儿和儿童食品中aft的限量标准，包括谷类食品在内的婴幼儿食品以及具有特殊医疗目的的婴儿食品，afb1的最大允许限量均为0.10ug/kg。现在黄曲霉毒素b1检测方法要求也在不断提高。目前黄曲霉素b1的检测方法主要有：薄层色谱法(tlc)、高效液相色谱法(hplc)、酶联免疫吸附法(elisa)，这类方法虽然检测精度较高，但所需的仪器昂贵，检测成本高，且操作负责。技术实现要素：针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种检测黄曲霉素b1抗体胶体金溶液的制备方法及该胶体金方法，该方法通过c线及t线进行显色检测，只需要使用微量移液器或者其它移液装置吸取检测液即可，在室温下8min可检测黄曲霉素b1；并提供采用该胶体金方法进行检测的试剂盒。为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：(1)将包被黄曲霉毒素b1抗原注入到balb/c小鼠体内，取其脾细胞与sp2/0骨髓瘤细胞融合，采用间接竞争elisa测定细胞上清液，筛选阳性孔；利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，直到得到分泌黄曲霉毒素b1单克隆抗体的杂交瘤细胞株；注射细胞进小鼠体内诱生腹水；将采集的腹水用辛酸-饱和硫酸铵法进行腹水纯化，-20℃保存；(2)以步骤(1)得到的黄曲霉毒素b1单克隆抗体为免疫原对无病原体免疫动物进行免疫，得到黄曲霉毒素b1抗抗体；(3)将步骤(1)得到的黄曲霉毒素b1抗抗体与胶体金溶液混合，得到标记的抗体胶体金溶液。在本发明中，优选的，所述免疫动物为山羊。在本发明中，所述包被黄曲霉毒素b1抗原的制备方法，包括以下步骤：1)将黄曲霉素b1和羧甲基羟半盐酸盐溶于吡啶甲醇混合溶液中，搅拌，旋干，加入双蒸水溶解，随即用碳酸氢钠调节ph至8.0，苯酚萃取，再用硫酸调节液相ph至4.0，在氮气保护下浓缩，得到黄色油状液体即为afb1肟化物黄曲霉毒素b1抗原；2)将得到的afb1肟化物黄曲霉毒素b1抗原溶于dmf中，加入碳二亚胺盐酸盐，搅拌，取bsa溶解于lpbs缓冲液中，将此溶液加入反应液中，相同条件继续反应，离心后用pbs透析，得到免疫黄曲霉毒素b1抗原；3)将免疫黄曲霉毒素b1抗原、n羟基琥珀亚胺和二环己基碳二亚胺溶解于无水四氢呋喃中震荡反应，离心，取上清吹干，加入dmf；取ova溶解于pbs缓冲液中，加入到反应物中反应，离心后用pbs透析，得到包被黄曲霉毒素b1抗原。在本发明中，优选的，所述胶体金溶液的制备方法，包括以下步骤：取haucl4溶液置于圆底烧瓶中，轻轻搅拌并加热至沸腾，快速加柠檬酸三钠，溶液颜色先变为深蓝色，再变为葡萄酒红色，继续沸腾10min；停止加热，室温冷却至常温用去离子水恢复到原体积，即得。在本发明中，优选的，在进行步骤(2)前需要对所用试管进行洁净；优选的，该清洁方法为采用胶体金溶液进行清洗，直至胶体金溶液不变色为止。在本发明中，优选的，在步骤(2)中抗体与胶体金溶液混合前，所述胶体金溶液用0.1mol碳酸钾调ph值至8.2。在本发明中，优选的，在步骤(2)中抗体与胶体金溶液混合后，静止，加封闭液，混匀后再静止，离心除去上层清液，加入重选液摇匀，得到标记的抗体胶体金溶液。在本发明中，优选的，所述重选液为在ph8.0的硼酸盐缓冲液加入海藻糖和bsa。一种检测黄曲霉素b1的胶体金方法，包括以下步骤：s1将上述抗体胶体金溶液均匀喷涂到金标垫上，烘干备用；s2将硝酸纤维素膜粘贴在pvc背板上，将检测抗原(t线抗原)和质控线抗抗体(c线抗抗体)用缓冲液分别稀释，喷涂在硝酸纤维素膜上，烘干备用；s3在步骤(4)得到的硝酸纤维素膜c线上端粘贴吸水纸，吸水纸下端压硝酸纤维素膜1-2mm；在硝酸纤维素膜t线下端粘贴步骤(3)得到的金标垫和样品垫，金标垫上端压硝酸纤维素膜2mm，样品垫上端压金标垫1-2mm，切条，安装卡壳进行包装。使用时，取出试纸条用微量移液器或者其它移液装置吸取准备好的样本100μl至加孔中然后室温计时8min；当试纸条的c线显色，t线颜色深于c线时，样本检测结果为阴性；当试纸条的c线显色，t线颜色等于或浅于c线时，样本检测结果为阳性，c线颜色越深，阳性越强；当试纸条的c线不显色，样本检测结果为无效，应更换试纸条重新检测。一种检测黄曲霉素b1的胶体金试剂盒，采用上述检测黄曲霉素b1的胶体金方法。与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明胶体金方法通过c线及t线进行显色检测，在室温下8min可检测黄曲霉素b1；其检测样本中黄曲霉毒素b1的检测线为2μg/l，符合黄曲霉毒素b1残留检测；同时，其检测黄曲霉毒素b1时与黄曲霉毒素b2/g1/g2均无交叉。本发明的试剂盒使用方法简单，只需要使用微量移液器或者其它移液装置吸取检测液即可，且试剂盒可以在2～8℃至少保存12个月以上，37℃加速老化保存21天内各项指标完全正常。具体实施方式下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。1、黄曲霉毒素b1抗原制备1)人工抗原制备：2mg黄曲霉素b1(以下简称为afb1)和4mg羧甲基羟半盐酸盐溶于2ml吡啶甲醇混合溶液(0.5ml吡啶:1.5ml甲醇)中，于25℃搅拌24h，用旋转蒸发仪蒸干，加入2ml双蒸水溶解，随即用0.2mol/l碳酸氢钠调节ph至8.0，用苯酚萃取3次，每次2ml萃取未肟化的afb1，再用0.2mol/l的硫酸调节液相ph至4.0，用乙酸乙酯分3次，每次1ml，在氮气保护下浓缩，得到黄色油状液体即为afb1肟化物黄曲霉毒素b1抗原(以下简称为afb1-o)；2)免疫抗原的制备：将0.5mgafb1-o溶于0.2mldmf中，加入1mg碳二亚胺盐酸盐，于25℃搅拌4h，取10mgbsa溶解于2ml0.01mol/lpbs缓冲液中，将此溶液加入反应液中，相同条件继续反应24h，将反应物离心后用0.01mol/lpbs透析3d每12h换液一次，得到免疫黄曲霉毒素b1抗原(以下简称为免疫afb1-o)；3)包被抗原的制备：将1mg免疫afb1-o、0.4mgn羟基琥珀亚胺和0.6mg二环己基碳二亚胺溶解于无水四氢呋喃中30℃震荡反应1h，将反应物4000r/min离心15min，取上清吹干，加入0.2mldmf；取10mgova溶解于2ml0.01mol/lpbs缓冲液中，加入到反应物中于25℃反应24h，将反应物离心后用0.01mol/lpbs透析3d每12h换液一次，得到包被黄曲霉毒素b1抗原，-20℃保存备用。2、黄曲霉毒素b1单克隆抗体制备1)动物免疫：将上述步骤得到的免疫包被黄曲霉毒素b1抗原注入到balb/c(8周)小鼠体内，免疫剂量为100μg/只，使其产生抗血清；2)细胞融合和克隆化：小鼠血清测定结果较高后，取其脾细胞，按10:1(数量配比)比例与sp2/0骨髓瘤细胞融合，采用间接竞争elisa测定细胞上清液，筛选阳性孔；利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，直到得到分泌黄曲霉毒素b1单克隆抗体的杂交瘤细胞株；3)细胞冻存和复苏：将单克隆杂交瘤细胞株用冻存液制成1×86个/ml的细胞悬液，在液氮中长期保存；复苏时取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养；4)单克隆抗体的生产与纯化：采用动物体内诱生单克隆抗体方法，7天后采集腹水；用辛酸-饱和硫酸铵法进行腹水纯化，-20℃保存。3、二抗的制备以山羊作为免疫动物，以黄曲霉毒素b1单克隆抗体为免疫原对无病原体山羊进行免疫，得到黄曲霉毒素b1抗抗体。4、胶体金标记黄曲霉毒素b1金标抗体的制备1)金的制备：取200ml浓度为0.01％的haucl4溶液置于500ml圆底烧瓶中，轻轻搅拌并加热至沸腾，快速加入2ml浓度为1％的柠檬酸三钠，溶液颜色先变为深蓝色，再变为葡萄酒红色，继续沸腾10min；停止加热，室温冷却至常温用去离子水恢复到原体积，2～8℃保存；2)保证所用试管洁净，可先用金清洗，金不变色则可以使用；向4ml聚苯乙烯离心管中加入2ml烧制好的金溶液，用0.1mol碳酸钾调ph值至8.2，加抗体0.2μg/ml，混匀静止10-15min，加封闭液20μl/m(bsa浓度10％)，混匀静止15min。10000g室温(4℃)离心5min，除去上层清液，加入200μl重选液(0.05mol硼酸盐缓冲液ph8.0加入4％海藻糖和1％bsa)轻轻摇匀，此即标记好的抗体胶体金溶液；3)处理液：0.1molpb加入4％海藻糖、1％吐温20、0.5％bsa和0.01％叠氮钠；4)将玻璃纤维放到处理液中浸泡10min，37℃恒温干燥箱烘干，待用；5)将处理好的玻璃纤维裁切成7mm为金标垫；6)将处理好的玻璃纤维裁切成17mm为样品垫；7)将制备好的金标抗体使用喷金仪均匀喷涂到金标垫上，放到37℃恒温干燥箱干燥4h，备用。5、划膜硝酸纤维素膜粘贴在pvc300mm×6cm背板上，将检测抗原(t线抗原)和质控线抗抗体(c线抗抗体)用0.01mpbs(ph7.2)缓冲液分别稀释至0.1mg/ml和0.3mg/ml，用划膜仪喷涂在硝酸纤维素膜上，喷涂量1μl/cm；放置到37℃恒温干燥箱干燥16h。6、组装在硝酸纤维素膜c线上端粘贴吸水纸，吸水纸裁切17mm，吸水纸下端压硝酸纤维素膜2mm，在硝酸纤维素膜t线下端粘贴金标垫和样品垫，金标垫上端压硝酸纤维素膜2mm，样品垫上端压金标垫2mm，使用切条机切成4mm宽度，安装卡壳，将其放入铝箔袋中塑封并加入一袋干燥剂。7、结果判定取出试纸条用微量移液器或者其它移液装置吸取准备好的样本100μl至加孔中然后室温计时8min。判定结果：当试纸条的c线显色，t线颜色深于c线时，样本检测结果为阴性。当试纸条的c线显色，t线颜色等于或浅于c线时，样本检测结果为阳性，c线颜色越深，阳性越强。当试纸条的c线不显色，样本检测结果为无效，应更换试纸条重新检测。一、制备采用该胶体金方法进行检测的试剂盒，并利用黄曲霉毒素b1胶体金检测试剂盒检测样本将不含黄曲霉毒素b1的玉米粉分别添加2μg/l黄曲霉毒素b1、5μg/l黄曲霉毒素b1、10μg/l黄曲霉毒素b1、20μg/l黄曲霉毒素b1、30μg/l黄曲霉毒素b1并重复5次检测，检测结果如表1所示：表1胶体金试纸条批次1批次2批次3批次4批次50μg/l-----2μg/l-----5μg/l+++++10μg/l+++++20μg/l+++++30μg/l+++++从表1可知，上述检测结果显示试剂盒对玉米样本中黄曲霉毒素b1的检测线为2μg/l，符合黄曲霉毒素b1残留检测。二、特异性测试分别添加黄曲霉毒素b2、黄曲霉毒素g1和黄曲霉毒素g2各200mg/l，显示均为阴性，由此可得黄曲霉毒素b2/g1/g2与黄曲霉毒素b1试纸条均无交叉。三、稳定性测试将试纸条放置于37℃加速老化保存，检测结果如表2所示：表237℃第1天第3天第9天第12天第15天第18天第21天t/c1.511.481.391.471.441.361.32表2的测定结果也表明试剂盒各项指标完全正常。从以上结果可得出试剂盒可以在2～8℃至少保存12个月以上。上述说明是针对本发明较佳可行实施例的详细说明，但实施例并非用以限定本发明的专利申请范围，凡本发明所提示的技术精神下所完成的同等变化或修饰变更，均应属于本发明所涵盖专利范围。当前第1页12