结合傅里叶变换红外光谱和化学计量学分析鉴别生前死后骨折的方法与流程

本发明涉及刑事科学技术和法医领域的骨折时间判断，具体涉及结合傅里叶变换红外光谱(ftir)技术和化学计量学分析鉴别生前死后骨折的方法。

背景技术：

法医领域通常将骨折时间分为生前骨折、濒死期骨折和死后骨折。生前骨折是指确定死亡前发生的骨折。濒死期骨折是死亡前后发生的损伤。死后骨折是指死后发生的骨折。骨折时间的精确估计对于明确骨折的机制、死亡原因、案件性质、侦查方向有着重大的意义。目前对于生前骨折、濒死期骨折和死后骨折之间的鉴别主要采用观察宏观骨折形态、微观骨折形态、骨折周围颜色变化和影像形态的改变等方法，但是这些传统方法存在主观、耗时、准确性低的问题。

傅里叶变换红外光谱(fouriertransforminfraredspectrometry，ftirspectrometry)技术是兴起于20世纪中后期的第三代红外光谱技术，不同于色散型红外分光的原理，其将收集到的经过干涉的原始红外光谱进行傅里叶变换后再输出谱图，具有信息量大、信噪比高的优点。分子在红外光谱上的强度与其振动跃迁的概率相关，而跃迁概率与振动时偶极矩的变化大小有关，偶极矩变化愈大，谱带强度愈大。偶极矩的变化与基团本身固有的偶极矩有关，故基团极性越强，振动时偶极矩变化越大，吸收谱带越强；分子的对称性越高，振动时偶极矩变化越小，吸收谱带越弱。因此，红外光谱技术非常适合对由大量碳氢键、碳氧键等非对称化学键构成的有机化合物的检测。几乎所有的有机化合物在红外光谱上都有吸收峰，根据吸收峰的位置、强度、形态等信息即可推知样本的分子构成。

化学计量学(chemometrics)又称化学统计学，由瑞典学者wold在1971年提出，是一门通过统计学或数学方法将对化学体系的测量值与体系的状态之间建立联系的学科。近年来，随着分析化学的发展，各种现代化测量仪器层出不穷，获得了大量关于物质化学组成的数据，应用化学计量学的方法可以从中挖掘出有价值的信息。

yang等人以弥漫性轴索损伤(diffuseaxonalinjury，dai)大鼠模型为样本，将ftir显微光谱(ftirmicrospectroscopy，ftirm)分析结果与he染色、β淀粉样前体蛋白(β-amyloidprecursorprotein，βaapp)免疫组织化学染色和银染色相对比确证，发现大鼠脑组织dai区域的酰胺ⅱ带的吸收峰明显增强。lin等人同样利用ftirm技术将过敏性休克致死者的肺水肿液与机械性窒息、脑损伤和心源性猝死的死者进行对比分析，发现过敏性休克组含有更多的α螺旋蛋白结构，而富含酪氨酸的蛋白较少，并开发了用于鉴定过敏性休克死亡的判别模型。但相对于病理样本，生前死后骨折样本难以获取，且骨折部分的组织随着腐败降解不断发生变化(例如，生前骨折尽管具有周围组织出血、血肿形成和愈伤组织的形成等明显地骨折愈合迹象，但是这些骨折愈合迹象信息会随着腐败降解时间的延长而消失)，影响了生前死后骨折的鉴别模型的建立，这是导致难以将生前骨折与死后骨折鉴别区分的原因之一。目前尚未见到将傅里叶变换红外光谱和化学计量学结合，并应用于分析鉴别生前死后骨折的报道。

技术实现要素：

针对目前难以快速、客观、准确地鉴别生前死后骨折的问题，本发明提供了一种结合傅里叶变换红外光谱和化学计量学分析鉴别生前死后骨折的方法。

为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：

1)提取待分析鉴别生前死后骨折的骨组织样本(一般取自案发现场尸体的骨折部分，例如，颅骨骨折等)，采集该样本的傅里叶变换红外光谱数据；

2)对采集的傅里叶变换红外光谱数据，选取该红外光谱数据中的骨组织指纹区(2000-400cm^-1)数据进行校准；

3)将经过校准的骨组织指纹区数据(具体指指纹区内选定的各个波长点对应的吸收值，波长点在指纹区内间隔分布，波长点数为800～850)，输入生前死后骨折鉴别模型，由该模型输出鉴别结果(即鉴别所述骨组织处发生的骨折属于生前骨折还是死后骨折)；其中，所述生前死后骨折鉴别模型是利用生前及死后不同骨折时间的动物模型在死后降解过程中多个时间点处相应的骨组织样本傅里叶变换红外光谱数据(参照步骤1、2获取)，并采用偏最小二乘法判别分析建立的。

优选的，所述骨组织样本提取自骨折断面至断面以下3mm的区域内。

优选的，所述傅里叶变换红外光谱数据的采集方法包括以下步骤：将骨折断面磨为粉状后制成多个压片，对每个压片平行进行多次傅里叶变换红外光谱分析，然后将多次分析的结果平均，得到对应骨组织样本的傅里叶变换红外光谱数据。

优选的，所述骨组织指纹区包括蛋白质成分酰胺ⅰ和酰胺ⅱ的吸收峰。

优选的，所述校准包括以下步骤：对选取的红外光谱数据进行均值中心变换和标准正态变量变换。

优选的，所述生前及死后不同骨折时间选自死前7天以内以及死后60天以内；所述死后降解过程对应的时间长度为死后60天以内。

优选的，所述动物模型建立于家兔的胫骨。

本发明的有益效果体现在：

本发明利用提取自骨折动物模型(例如，兔子胫骨骨折)样品，建立可用于有效推断人体骨折时间(生前死后骨折鉴别)的pls-da模型，有效克服了人体生前死后骨折样品难以获得的问题，通过建立生前死后骨折鉴别模型，仅需要采集骨组织样品的傅里叶变换红外光谱数据，经自动校准后即可应用鉴别模型，从而鉴别生前死后骨折。相较于传统的鉴别方法，本发明具有样品需求量小、过程简便快速，以及结果客观、准确的优点。

进一步的，本发明可以在不同生前骨折时间(7天以内)、死后骨折时间(0-120天)和死后降解时间(0-120天)条件下鉴别生前死后骨折，预测能力强。

进一步的，本发明选取的指纹区，可以更有效的利用骨组织红外光谱图像的信息(剔除了无效数据)，缩短了数据分析时间。

进一步的，本发明利用采集的平行光谱数据的平均光谱代表一个样品的红外光谱采样数据，增强了样品的代表性。

进一步的，本发明选取骨折断面至断面以下3mm深度的骨组织进行提取，保留了更多的骨折信息，同时有效减少了样品提取量。

附图说明

图1为制作骨折检测样品流程图。

图2为检测样品平均光谱图及对应吸收峰的官能团图。

图3为生前死后骨折pls-da鉴别模型图。

图4为家兔预测集随机样品鉴别情况图。

图5为人骨随机样品鉴别情况图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明。所述的实施例仅用于解释本发明，而非对本发明保护范围的限制。

(一)建立生前死后骨折鉴别模型的依据

人类的离体生前骨折和死后骨折样本是很难获得的，针对目前难以鉴别生前死后骨折的问题，关键是建立生前死后骨折鉴别模型。采用同为哺乳动物的兔子的胫骨骨折样本进行建模，兔子骨折修复物质变化过程与人骨折修复物质变化过程几乎完全相同，所以利用兔骨所建模型推断人的骨折时间是可行的。针对骨折断面获得原始骨粉，以求保留最大化骨折信息，通过化学计量学发现对于鉴别生前死后骨折贡献最大的是代表蛋白质成分的酰胺ⅰ和酰胺ⅱ带吸收峰。这更能说明生前骨折和死后骨折的主要区别在于生前骨折具有修复阶段，期间有大量炎症因子、趋化因子、生长因子和胶原蛋白产生，而这些变化在死后120天内仍然可以被傅里叶变换红外光谱所发现，从而区别于死后骨折。根据以上发现，本发明提出了一种结合傅里叶变换红外光谱和化学计量学分析鉴别生前死后骨折的方法，适合各种不同型号和厂家的ftir红外光谱仪。

(二)鉴别生前死后骨折的实例

步骤1：建立训练样品集和预测样品集

1.1建立动物实验模型

用102只家兔的双侧胫骨(共204个样本)建立实验模型，其中72只兔子的双侧胫骨，一侧为生前骨折模型，一侧为死后骨折模型，用于建立训练模型，具体分组参见表1。剩余的30只兔子的双侧胫骨建立预测集。此外，收集了4个人类颅骨骨折样品，将遭遇车祸死亡的2例人颅骨骨折样品定性为生前骨折，死后人为造骨折的2例定性为死后骨折。

表1.样品训练集分组

针对表1，在实践中，死亡近期的生前骨折(4天、7天)和濒死期骨折(生前2小时)对案件的性质起着决定性作用，所以将这两个时间段的骨折统一归为生前骨折，与死后骨折进行鉴别。对照组是指在死后降解一段时间时(2小时、15天、60天)进行骨折处理。降解条件：置于恒温箱中，温度25±1℃，湿度50％±5％。

1.2取样和样品傅里叶变换红外光谱采集

参见图1，将骨折断面的骨组织(骨组织选自骨折断面至断面以下3mm)磨成骨粉，将骨粉过200目筛，得原粉，将原粉置于60℃的烘干箱内干燥6小时，将0.9～1.1mg的干燥后的原粉与100mg的溴化钾粉末混合均匀后压片，得到检测样品，用赛默飞nicolet-5700傅里叶红外光谱仪进行检测(放入红外漫反射附件中，同时收集背景进行基线校正)，扫描次数为32次，分辨率为4cm^-1，收集4000-400cm^-1范围的红外光谱，每个样品制成3个压片，每个压片平行测定3次(测试温度：常温)，最终9个光谱数据的平均光谱代表样品光谱，截取2000-400cm^-1范围内的光谱数据，作为指纹区(参见图2)。

1.3光谱数据预处理

用均值中心化(meancentering)的方法，即通过光谱均值中心变换对选取的指纹图谱进行预处理，预处理中先计算出样品训练集的平均光谱，再用各样品的原始光谱(即1.2得到的样品光谱)减去样品训练集的平均光谱，得到均值中心化光谱数据。用标准正态变量变换(standardnormalvariatetransformation，snv)对选取的指纹区(均值中心化光谱数据)进行预处理，得到标准正态光谱数据。最终总共得到家兔训练集(144个数据)，家兔预测集(60个数据)，人体待测光谱数据4个。

步骤2：建立训练模型

应用化学计量学软件，将经过预处理的训练集样品的光谱数据(具体指指纹区内等间隔分布的829个波长点对应的吸收值)导入matlab中，运用plstoolbox8.6(eigenvectorresearch,wa,usa)工具中主成分分析(principalcomponentanalysis，pca)，发现贡献最大区域位于酰胺ⅰ和酰胺ⅱ带吸收峰。

将生前骨折时间跨度为2小时-7天，死后骨折时间跨度为0-60天，死后降解时间跨度为0-60天的72只家兔的双侧胫骨(共144个样本)作为训练集用于建立模型，每个分类模型都分别独立进行优化，优化主要受潜变量数(latentvariables，lvs)的影响，为最优化各分类模型，针对每个分类模型，利用20折交叉验证(20-foldcross-validations，cv)选取最佳潜变量数为3(lvs从1到20中选取)，然后用偏最小二乘法判别分析(partialleastsquaresdiscriminationanalysis,pls-da)建立最优生前死后骨折鉴别pls-da模型(图3)。

步骤3：预测样品集验证pls-da模型稳健性和准确性

将兔子预测集的60个数据导入pls-da模型进行生前死后骨折预测，将预测结果与样本实际骨折时间进行比较，发现成功识别为生前骨折的准确率为83.3％，成功识别为死后骨折的准确率为90％(见图4)，确定pls-da模型具有稳健性和准确性。

步骤4：人体骨折时间判定

对本实例中的4个人颅骨样品进行骨折时间判定，预测结果见图5。由图5可以看出，4个样品中有3个被正确识别，有一个生前骨折被识别为死后骨折，但是几乎在分界线边缘，由于人体样本数量有限，识别死后骨折的准确率为100％，识别生前骨折的准确率为50％。以上鉴别人体生前死后骨折的判定结果在准确性远远高于传统方法。

总之，本发明所建立的结合傅里叶变换红外光谱和化学计量学分析鉴别生前死后骨折的pls-da模型，具有样品需求量少、样品制备和数据处理简便、鉴别速度快，并且准确性高的优点。