红豆杉中紫杉烷类化合物提取工艺优化方法与流程

本发明属于天然提取物技术领域，涉及红豆杉中紫杉烷类化合物提取工艺优化方法。

背景技术：

红豆杉(taxuswallichianavar.chinensis(pilg.)florin)，是天然抗癌植物，它被熟知是因为20世纪60年代，美国化学家从中提取出了具有良好生物活性的抗癌药物紫杉醇。红豆杉中有大量的紫杉烷类、黄酮类、多糖类等物质，可以运用到医药、化妆品、保健品、食品等多个方面，在这些方面起到良好的抗肿瘤、抗炎、清除自由基等作用。紫杉烷类是以抗癌药物紫杉醇为首的一类二萜化合物。目前已鉴定分离了400多种紫杉烷类的化合物，有些紫杉烷类例如巴卡亭ⅲ和10-脱乙酰基巴卡亭ⅲ，有和紫杉醇相同的6/8/6母核结构，因此可以用作半合成紫杉醇的原料，有的紫杉烷类像紫杉醇、多西紫杉醇等，本身就具有较好的生物活性。

目前，国内外应用较多的是正交设计和均匀设计，这两种方法不能全面考察各因素的相互作用，并且也很难反映多个响应值与因素之间的交互作用关系。

综上可知，研究开发一种高效、简单、易行的红豆杉紫杉烷类化合物的提取工艺具有十分重要的意义。

技术实现要素：

为克服现有技术中红豆杉紫杉烷类化合物提取所存在的问题，本发明提出一种基于响应面法优化红豆杉紫杉烷类化合物提取工艺参数的方法，该方法以红豆杉为材料，以提高紫杉烷类化合物提取率为目的，采用甲醇溶液水浴提取，在单因素试验的基础上，利用响应面优化提取工艺，为红豆杉中紫杉烷类化合物的提取提供技术支持，为红豆杉资源的综合利用以及提高附加值提供理论依据。

本发明提供了一种基于响应面法优化红豆杉紫杉烷类化合物提取工艺参数的方法，包括以下步骤：

s1、取红豆杉样品，洗净、干燥后粉碎，过筛得红豆杉粉末备用；

s2、取红豆杉粉末置于甲醇溶液中水浴提取，分别考察料液比、超声时间、水浴时间、水浴温度对提取液中紫杉烷类化合物含量的影响；

s3、以料液比、超声时间、水浴时间、水浴温度为自变量，以紫杉烷类化合物提取率为响应值，建立多元二次方程；

s4、对多元二次方程进行响应面分析，取紫杉烷类化合物提取率为最大值，对红豆杉中紫杉烷类化合物的提取条件进行优化，得到提取工艺参数。

在上述方案的步骤s3中，建立多元二次方程时，根据实验数据进行多元回归拟合，获得红豆杉中紫杉烷类化合物的提取率对自变量料液比、超声时间、水浴时间、水浴温度的二次多项回归，根据实验结果建立红豆杉中紫杉烷类化合物提取的数学模型并对该模型进行显著性检验。

进一步地，在上述方案的步骤s2中，测定提取液中紫杉烷类化合物的含量，通过优化的液相色谱-串联质谱-多反应监测(lc-ms/ms-mrm)方法进行定量分析，根据标准曲线快速有效的检测样品中紫杉烷类的含量。

在上述方案中，液相色谱-串联质谱-多反应监测(lc-ms/ms-mrm)方法的色谱条件具体为，phenomenexaqua5uc18色谱柱(50mm×2.0mm,5μm)，以a(0.4％甲酸，10mm乙酸铵水溶液)-b(乙腈)为流动相进行梯度洗脱(0.01-0.5min，20％b；0.5-3min，20％-85％b；3-5min，85％b；5-5.1min，85％-20％b；5.1-7min，20％b)；检测波长227nm；进样量5μl；体积流量：3ml/min；柱温：40℃；液相色谱-串联质谱-多反应监测(lc-ms/ms-mrm)方法的质谱条件具体为，esi正离子模式和esi负离子模式共同扫描；最大压力：20mpa；离子化源：电喷雾离子化源(esi源)；气帘气(cur)：10psi；碰撞活化参数(cad)：5；离子源电压：-4500.0v；离子源温度(tem)：400℃；雾化气(gs1)：65psi；辅助气(gs2)：60psi。

进一步地，在上述方案中，将紫杉醇、巴卡亭ⅲ、10-脱乙酰基巴卡亭ⅲ、三尖杉宁碱和10-脱乙酰基紫杉醇分别配制浓度梯度为50μg/l、100μg/l、200μg/l、500μg/l、1mg/l、2mg/l、5mg/l、10mg/l的混标，然后用lc-ms对混标进行标准曲线的绘制。

还进一步地，在上述方案的步骤s4中选取最佳工艺参数时，在选取的4个因素范围内，紫杉烷类化合物提取率选最大，据回归模型通过design-expert8.0.6软件分析得出，红豆杉中紫杉烷类化合物最佳提取工艺参数。

优选地，在上述技术方案中，所述的红豆杉中紫杉烷类化合物的提取工艺优化方法还包括，利用s4得到的提取工艺参数，再进行红豆杉中紫杉烷类化合物最佳提取参数的确定和实验验证。

与现有技术相比，本发明具有以下积极有益效果：

本发明以紫杉烷类化合物的提取率为响应值，在单因素的基础上选取对紫杉烷类化合物影响较大的料液比、超声时间、水浴时间、水浴温度进行考察，通过响应面法建立了总评分与四个因素之间的二次多项式方程模型，并绘制出三维曲面图，对其进行综合分析，得出最佳工艺条件为：料液比为1:20，超声的时间为45min，水浴时间6h，水浴温度60℃，本发明为红豆杉的质量评价提供参考和依据，为红豆杉的综合利用奠定基础。

附图说明

图1为料液比对紫杉烷化合物含量的影响；

图2是超声时间对紫杉烷化合物含量的影响；

图3是水浴时间对紫杉烷化合物含量的影响；

图4是水浴温度对紫杉烷化合物含量的影响；

图5是料液比与超声时间对紫杉烷类化合物含量的等高线图；

图6是料液比与超声时间对紫杉烷类化合物含量的响应面图；

图7是料液比与水浴时间对紫杉烷类化合物含量的等高线图；

图8是料液比与水浴时间对紫杉烷类化合物含量的响应面图；

图9是料液比与水浴温度对紫杉烷类化合物含量的等高线图；

图10是料液比与水浴温度对紫杉烷类化合物含量的响应面图；

图11是水浴时间与超声时间对紫杉烷类化合物含量的等高线图；

图12是水浴时间与超声时间对紫杉烷类化合物含量的响应面图；

图13是超声时间和水浴温度对紫杉烷类化合物含量的等高线图；

图14是超声时间和水浴温度对紫杉烷类化合物含量的响应面图；

图15是水浴时间和水浴温度对紫杉烷类化合物含量的等高线图；

图16是水浴时间和水浴温度对紫杉烷类化合物含量的响应面图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明，但不限于此。

同时下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例：

一种基于响应面法优化红豆杉紫杉烷类化合物提取工艺参数的方法，包括以下步骤：

(1)用烘箱将采集的红豆杉样本烘干，烘箱温度设置为60℃，烘干后用中药粉碎机将样品粉碎，过40目筛得红豆杉粉末备用。

(2)液相色谱-串联质谱-多反应监测(lc-ms/ms-mrm)方法中含量标准曲线的绘制：色谱条件为，phenomenexaqua5uc18色谱柱(50mm×2.0mm，5μm)，以a(0.4％甲酸，10mm乙酸铵水溶液)-b(乙腈)为流动相进行梯度洗脱(0.01-0.5min，20％b；0.5-3min，20％-85％b；3-5min，85％b；5-5.1min，85％-20％b；5.1-7min，20％b)；检测波长227nm；进样量5μl；体积流量：3ml/min；柱温：40℃；质谱条件为，esi正离子模式和esi负离子模式共同扫描；最大压力：20mpa；离子化源：电喷雾离子化源(esi源)；气帘气(cur)：10psi；碰撞活化参数(cad)：5；离子源电压：-4500.0v；离子源温度(tem)：400℃；雾化气(gs1)：65psi；辅助气(gs2)：60psi。首先在该质谱条件下进行质谱检测mrm参数优化，通过流动注射5种紫杉烷类标准品，进行优化响应。

将紫杉醇、巴卡亭iii、10-脱乙酰基巴卡亭iii、三尖杉宁碱和10-脱乙酰基紫杉醇分别配制浓度梯度为50μg/l、100μg/l、200μg/l、500μg/l、1mg/l、2mg/l、5mg/l、10mg/l的混标，然后用lc-ms对混标进行标准曲线的绘制。5种标准品的线性回归方程如表一所示。

表一5种标准品线性回归方程

^alod，检出限(s/n＝3)；^aloq，定量限(s/n＝10)

(3)红豆杉中紫杉烷类化合物提取单因素实验

3.1、料液比对紫杉烷类化合物提取率的影响

准确称取红豆杉样本0.5g，采用甲醇提取，超声30min，在40℃的水浴锅中提取4h，设置料液比分别为1:10、1:15、1:20、1:25和1:30，取100μl于离心管中，稀释10倍，提取液过0.45μm的滤膜，装入液相小瓶中，从中取一定量检测其中的紫杉烷类化合物的含量。

图1为料液比对紫杉烷类化合物含量的影响：由图1可知，随着料液比的增长，紫杉烷类的总量出现先增长后减小的现象。在料液比为1:15时，出现最大值。

3.2超声时间对紫杉烷类化合物提取率的影响

准确称取红豆杉样本0.5g，取10ml甲醇提取，40℃下进行提取，提取时间为4h，每个试管超声时间分别为15、30、45、60、75、90min。提取结束后，取100μl于离心管中，稀释10倍，提取液过0.45μm的滤膜，装入液相小瓶中，从中取一定量检测其中的紫杉烷类化合物的含量。

图2为超声时间对紫杉烷类化合物含量的影响：由图2可知，随着超声时间的增多，紫杉烷类总量出现先增大后减少的情况。超声时间为45min时，此时提取效果最好。

3.3、水浴时间对紫杉烷类化合物提取率的影响

准确称取红豆杉样本0.5g，采用10ml甲醇提取，超声30min，40℃下进行提取，分别水浴2、4、6、8、10、12h。实验结束后，取100μl粗提液于离心管中，稀释10倍，用0.45μm的滤膜过滤，装入液相小瓶中，从中取一定量检测其中的紫杉烷类化合物的含量。

图3为水浴时间对紫杉烷类化合物含量的影响：由图3可知，随着水浴时间的增多，紫杉烷类总量出现先增大后减少的情况。当水浴时间为6h时，提取效果最好。

3.4、水浴温度对紫杉烷类化合物提取率的影响

准确称取红豆杉样本0.5g，取10ml的甲醇进行提取，超声30min，分别在温度为30、40、50、60、70℃的水浴锅中水浴，水浴时间均为4h。待所有样品冷却至室温后，取粗提液稀释10倍，过0.45μm的滤膜，装入液相小瓶中，从中取一定量检测其中的紫杉烷类化合物的含量。

图4为水浴温度对紫杉烷类化合物含量的影响：由图4可知，随着水浴温度的升高，紫杉烷类总量出现先增大后减少的情况。当水浴温度达到50℃时，提取效果最好。

(5)响应面试验设计

在单因素试验的基础上，选取料液比、超声时间、水浴时间、水浴温度为试验因素，所得的紫杉烷类化合物含量为响应值，应用box-behnken响应面法试验设计原理，设计四因素三水平的响应面实验，根据试验结果，确定红豆杉的最佳提取条件，实验因素与水平设计见表二。

表二实验因素与水平设计

响应面法设计与结果见表三。

表三响应面法设计与结果

(6)响应面法分析与优化

实验数据采用统计软件design-expert8.0.6进行多元回归分析，得到实验因素对响应值影响的回归方程：

数据的方差分析结果见表四。

表四数据的方差分析结果

注：*.p＜0.05差异性显著；**.p＜0.01差异性极显著。

分析结果可知，该响应面实验回归方程模型极显著(p＜0.01)，这意味着该实验是成功且有意义的。失拟项p值为0.2324＞0.05，失拟性差异不显著，无失拟因素存在。x1、x12、x32、x42对紫杉烷类化合物提取总量的影响极显著(p＜0.01)，x3、x22对紫杉烷类化合物提取总量的影响显著(p＜0.05)，其余的因素及组合对紫杉烷类化合物总提取量的影响不显著(p＞0.05)，各因素对紫杉烷类化合物提取总量的影响依次是x1＞x3＞x2＞x4，即料液比＞水浴时间＞超声时间＞水浴温度。校正决定系数r2为370.869＞0.80，变异系数为7.94％，这也意味着该试验结果，数据较为可靠，本试验模型拟合程度较高，可以用于提取紫杉烷类化合物总量的理论预测。

图5-图16为根据回归方程所绘制的响应面图和等高线图，能直观的描述两个因素之间对响应值的交互作用。等高线图中，图11、13中等高线排布较为均匀，响应面都较为平缓，说明超声时间与水浴时间和水浴温度的交互都不明显。且图5、图7、图9和图15中的等高线图，可看到每个等高线图中，等高线排布均匀，但外圈可以明显看到蓝色，说明交互作用更强一些，由响应面图可看出响应面从外到内逐渐有蓝色过度到了橙黄色，且有较为明显的响应度，说明这4个组合具有一定的交互作用。

根据响应面法的优化结果，紫杉烷类化合物的最佳提取工艺为料液比为1:15.94、超声时间46.99min、水浴时间6.31h、水浴温度50.43℃。考虑到现实情况，本发明将优化工艺调整为料液比为1:16、超声时间为47min、水浴时间为6.3h、水浴温度为51℃，在该条件下对红豆杉进行了3次提取试验，来验证响应面法预测的提取工艺的可靠性。实验结果表明，每0.5g的红豆杉样本中，紫杉烷类的提取量为296.99±2.1462μg。同理论得率298.477μg相比，误差为1.05％。由此可说明响应面法优化的工艺可行。