本发明涉及免疫学
技术领域：
，更具体地说是涉及一种封闭液用牛血清的制备方法。
背景技术：
：酶联免疫技术是检测抗原或抗体常用的方法，其基本原理是使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在测定时，把受检标本(测定其中的抗体或抗原)和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应，然后用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅来进行定性或定量分析。由于酶的催化频率很高，故可极大地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。由于试剂盒中的固相载体可与检测抗原或抗体结合，所以为了避免固相载体与待检测的抗原或抗体结合，需要使用封闭液与固相载体的结合。目前，封闭液主要由成牛血清构成，但是成牛血清中含有大量的免疫球蛋白，免疫球蛋白具有类似免疫功能的抗体，若其大量存在于封闭液中会影响对待测抗原或抗体的定量和定性检测结果，因此，降低成牛血清中免疫球蛋白的量很必要。因此，如何提供一种封闭液用牛血清是本领域技术人员亟需解决的技术问题。技术实现要素：有鉴于此，本发明采用澄清、亲和柱层析、过滤等方式去除了胎牛血清中的免疫球蛋白，降低了酶联免疫试剂盒检测时的背景值，提高了检测限度。为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：1)预处理：取成牛血清，并对其进行预处理，得预处理后的成牛血清；2)澄清：对预处理后的成牛血清依次进行深层过滤、沉淀，得澄清后的成牛血清；3)离心：对澄清后的成牛血清离心，取上清；4)亲和柱层析：对所得上清进行亲和柱层析，得层析液；5)过滤：对所得层析液用0.01-0.05μm滤膜进行过滤，灭菌，得封闭液用牛血清。以上技术方案达到的技术效果是：成牛血清中含有bsa蛋白、免疫球蛋白、血细胞、激素类物质、离子等，以深层过滤器对其进行深层过滤可除去大分子物质；离心后，可去除部分大分子蛋白质；亲和柱层析法可使部分免疫球蛋白留在柱中，由于免疫球蛋白主要包括igg、igm和iga，其分子量分别为150kd、1000kd和400kd，而bsa蛋白的分子量在60-75kd之间，因此采用0.01-0.05μm滤膜进行过滤，可将绝大多数免疫球蛋白截留在膜上，以此达到去除免疫球蛋白的目的，从而，防止了免疫球蛋白与待测抗原或抗体的吸附反应，提高了试剂盒的检测限度。作为本发明优选的技术方案，步骤1)中，所述预处理为：对成牛血清经连续流离心机在8000rpm下离心10-15min，去掉血细胞。以上技术方案达到的技术效果是：连续流离心机处理量大，时间短，人工成本低，可以大规模处理，成牛血清中的血细胞在离心后，会沉淀，达到了去除血细胞的目的。作为本发明优选的技术方案，步骤2)中，所述沉淀为将滤液调至ph值为6.0，采用聚丙烯酰胺进行沉淀。以上技术方案达到的技术效果是：聚丙烯酰胺作为阴离子型絮凝剂，可以沉淀带正电荷的粒子，免疫球蛋白的等电点为8.6，bsa蛋白的等电点为4.7，因此，当溶液的ph值为6.0时，bsa蛋白带负电，免疫球蛋白带正电，此时，在酸性溶液中，聚丙烯酰胺带负电，会与带正电的免疫球蛋白结合，形成沉淀，达到初步沉淀免疫球蛋白的目的；除此之外，聚丙烯酰胺还可以沉淀血清中其他带电粒子，达到澄清血清的目的，提高了血清的澄清度。作为本发明优选的技术方案，步骤3)中，所述离心为采用连续流离心机在10000rpm下离心5-10min。作为本发明优选的技术方案，步骤4)中，所述亲和柱为sepharosecl4b柱。以上技术方案达到的技术效果是：葡萄球菌a蛋白(spa)具有与多种哺乳动物igg分子fc段结合的能力，因此，柱中包裹有spa，可除去免疫球蛋白中的lgg蛋白。作为本发明优选的技术方案，步骤5)中，所述滤膜为陶瓷复合膜。作为本发明优选的技术方案，步骤5)中，所述灭菌为在121℃下灭菌21min。综上所示，本发明公开了一种封闭液用牛血清的制备方法，与现有技术中的牛血清相比，更大程度地去除了其中的免疫球蛋白，免疫球蛋白含量降低至0.01mg/ml，有效地防止了免疫球蛋白与固相载体、待检测抗原或抗体间的免疫吸附显色反应，降低了背景值，提高了检测限度；而且，成牛血清经深层过滤澄清后，澄清度由现有技术中的30-200ntu降低至5-8ntu，显著提高了封闭液的澄清度。具体实施方式下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例1一种封闭液用牛血清的制备方法，包括下述步骤：1)预处理：取成牛血清，对成牛血清经连续流离心机在8000rpm下离心10min，去掉血细胞；2)澄清：对预处理后的成牛血清依次进行深层过滤，然后将滤液调至ph值为6.0，采用聚丙烯酰胺絮凝剂进行沉淀，得澄清后的成牛血清；3)离心：对澄清后的成牛血清采用连续流离心机在10000rpm下离心5min，取上清；4)亲和柱层析：对所得上清采用sepharosecl4b柱进行亲和柱层析，得层析液；5)过滤：对所得层析液用0.05μm陶瓷复合滤膜进行过滤，在121℃下灭菌21min，得封闭液用牛血清。实施例2一种封闭液用牛血清的制备方法，包括下述步骤：1)预处理：取成牛血清，对成牛血清经连续流离心机在8000rpm下离心15min，去掉血细胞；2)澄清：对预处理后的成牛血清依次进行深层过滤，然后将滤液调至ph值为6.0，采用聚丙烯酰胺絮凝剂进行沉淀，得澄清后的成牛血清；3)离心：对澄清后的成牛血清采用连续流离心机在10000rpm下离心10min，取上清；4)亲和柱层析：对所得上清采用sepharosecl4b柱进行亲和柱层析，得层析液；5)过滤：对所得层析液用0.01μm陶瓷复合滤膜进行过滤，在121℃下灭菌21min，得封闭液用牛血清。实施例3一种封闭液用牛血清的制备方法，包括下述步骤：1)预处理：取成牛血清，对成牛血清经连续流离心机在8000rpm下离心12min，去掉血细胞；2)澄清：对预处理后的成牛血清依次进行深层过滤，然后将滤液调至ph值为6.0，采用聚丙烯酰胺絮凝剂进行沉淀，得澄清后的成牛血清；3)离心：对澄清后的成牛血清采用连续流离心机在10000rpm下离心8min，取上清；4)亲和柱层析：对所得上清采用sepharosecl4b柱进行亲和柱层析，得层析液；5)过滤：对所得层析液用0.03μm陶瓷复合滤膜进行过滤，在121℃下灭菌21min，得封闭液用牛血清。对实施例1-3中的胎牛血清进行免疫球蛋白含量测定，测定方法如下：每个实施例下的牛血清抽取3份样品，使用南京建成生物工程研究所提供的血清总蛋白质含量检测试剂盒(双缩脲法)和血清白蛋白含量检测试剂盒(溴甲酚绿法)，分别检测牛血清总蛋白质含量和牛血清白蛋白含量，结果见表1。表1实施例1-3中的胎牛血清总蛋白质含量检测结果检测项目实施例1实施例2实施例3免疫球蛋白含量(mg/ml)0.0160.0150.01其中，血清免疫球蛋白含量＝血清总蛋白质含量-血清白蛋白含量。由表1可知，以实施例1-3的方法制备封闭液用牛血清，其中免疫球蛋白含量较低。利用浊度检测法对实施例1-3中制备得到的封闭液用牛血清的澄清度进行检测，结果如表2所示。表2实施例1-3中的澄清度检测结果检测项目实施例1实施例2实施例3澄清度(ntu)685由表2可知，以本发明的方法制备的封闭液用血清澄清度较高。实施例4elisa实验以实施例3制备的牛血清进一步制备封闭液，分别称取蔗糖12.0g、脱脂奶粉7.2g、na2hpo4·12h2o4.64g、nah2po4·2h2o0.48g、aep-hbc2.4g置于1l玻璃容器中，加入500ml纯水用磁力搅拌器室温下搅拌30min溶解，再加入甘油8ml和450ml纯水继续用磁力搅拌器搅拌12h，再加入牛血清32ml和proclin300240μl，定容至1l用磁力搅拌器搅拌30min，制得封闭溶液。在以hao(羟胺氧化酶)抗体检测hao的elisa试验为例，在过程的封闭步骤中，酶标板中加入150μl/孔的封闭液，37℃封闭2h，拍干备用。酶标板中加入150μl/孔的磷酸盐缓冲溶液，37℃封闭2h，拍干作为空白对照酶标板备用；分别设置hao的浓度为1mg/ml、10-1mg/ml、10-2mg/ml、10-3mg/ml、10-4mg/ml、10-5mg/ml、10-6mg/ml、10-7mg/ml、10-8mg/ml，以上述封闭液对固相载体进行封闭后，分别对不同浓度的hao溶液进行检测，结果显示，当hao的浓度为1mg/ml、10-1mg/ml、10-2mg/ml、10-3mg/ml、10-4mg/ml、10-5mg/ml、10-6mg/ml、10-7mg/ml时均能出现显色反应，而当浓度为10-8mg/ml时不出现显色反应，说明，以本发明的封闭液对试剂盒进行封闭后，检测限度可达0.1ng/ml。对比例：对比1：去除实施例3中的步骤5)，按照步骤1)-4)的方法制备牛血清；对比2：去除实施例3中的步骤4)，按照步骤1)-3)和5)的方法制备牛血清；对比3：去除实施例3中的步骤4)和步骤5)，按照步骤1)-3)的方法制备牛血清；以上述的试剂盒对hao检测，每个对比例设置hao的浓度为1mg/ml、10-1mg/ml、10-2mg/ml、10-3mg/ml、10-4mg/ml、10-5mg/ml、10-6mg/ml、10-7mg/ml、10-8mg/ml，结果表明，对比例1检测的最低限度为10-6mg/ml，对比例2检测的最低限度为10-7mg/ml，对比例3的检测的最低限度为10-5mg/ml，说明，亲和柱层析和过滤均可以有效去除成牛血清中的免疫球蛋白含量，提高了检测限度。本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。当前第1页12