一种评估新型冠状病毒肺炎患者肾脏受累风险的试剂盒

1.本发明涉及生物医药领域，尤其涉及一种评估新型冠状病毒肺炎患者肾脏受累风险的试剂盒。


背景技术：

2.由新型冠状病毒(sars-cov-2)感染所致的新型冠状病毒肺炎(covid-19)已出现全世界范围的大流行。该病常引起重症肺炎、急性呼吸窘迫综合征和多器官功能障碍。越来越多临床研究表明，肾脏是covid-19患者最常见的肺外受累脏器。相当高比例(30-70％)的患者出现不同程度的肾脏损伤。引起肾损伤的原因，除了炎症反应和缺血缺氧，还可能是病毒直接感染。已有covid-19患者尸检报告发现sars-cov-2感染肾脏细胞的证据。
3.已知sars-cov-2感染宿主细胞，病毒表面的棘突糖蛋白(spike protein)需要与宿主细胞膜表面的血管紧张素转化酶2(ace2)受体结合以及被宿主蛋白酶剪切。其中的蛋白酶主要涉及transmembrane protease,serine 2(tmprss2)。在tmprss2表达阴性的细胞中，剪切和活化棘突蛋白的作用主要由半胱氨酸蛋白酶cathepsin b/l介导。因此，同时表达病毒入侵所需要的受体和蛋白酶的细胞是sars-cov-2的潜在靶细胞。已发表的单细胞测序数据分析发现，肾脏中存在高水平的ace2 mrna，提示sars-cov-2具有较高的肾脏亲嗜性。ace2主要表达部位是近端肾小管上皮细胞(proximal tubular epithelial cells，ptecs)，后者很可能是病毒入侵肾脏的门户。ptecs根据解剖位置一般分为s1、s2和s3三段，各段的上皮细胞具有不同的超微结构和功能。人肾脏单细胞测序发现比经典的按照节段分布的ptecs亚类(s1、s2、s3)更多的细胞亚类。在这些不同ptecs亚类中，ace2受体和宿主蛋白酶分布不尽相同；其他与sars-cov-2病毒密切相互作用的宿主因子，包括限制因子、涉及病毒复制、组装、释放的细胞机器等在其中的表达部位和水平也不同。提示ptecs亚类对sars-cov-2病毒的易感性存在差异，并非都对病毒高度易感。
4.判断肾脏是否存在sars-cov-2病毒感染，最直接的支持证据就是在肾脏组织和细胞中发现病毒的存在。这首先需要进行肾穿刺活检获取肾组织，通过间接免疫荧光法(indirect immunofluorescence，iif)检测肾脏组织中病毒蛋白、聚合酶链反应(pcr)技术定量病毒rna、原位杂交技术可以揭示病毒rna在组织中的分布位置，或者通过透射电镜直接显示和观察病毒颗粒。还可以通过检测尿液中病毒rna水平间接推测是否存在包括肾脏在内的泌尿系统感染，主要方法是定量逆转录-聚合酶链反应(quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction，rt-qpcr)。
5.然而，肾穿刺活检术的侵入性，不可避免带来活检相关的损伤、出血等并发症；其次，sars-cov-2病毒具有高度传染性，来自新冠肺炎患者的各种组织和体液标本仅能特殊级别的实验室进行处理和检测，而无法在普通实验室进行。种种客观因素限制了我们早期、及时判断covid-19患者是否存在肾脏感染和受累，肾脏感染发生率目前尚不明确。而检测尿液中病毒rna，首先尿液中病毒rna检测阳性率较低，多出现在危重的sasr-cov-2感染患者中。由于尿液从生成到排出涉及整个泌尿系统，尿液中的脱落细胞是多种不同形态和功
能的细胞混杂，通过检测尿液中的病毒无法准确定位感染的部位和细胞来源。无法将病毒的靶细胞识别和量化，将对我们评估病毒是否感染以及感染何种肾脏细胞带来诸多困难。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种评估新型冠状病毒肺炎患者肾脏受累风险的试剂盒。本发明的试剂盒可筛选出covid-19患者中肾脏感染、损伤的高危人群，并且可以用于动态监测病情变化和治疗效果。
7.为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：提供一种评估新型冠状病毒肺炎患者肾脏受累风险的试剂盒，所述试剂盒包括检测肾脏易感细胞的标志蛋白水平的试剂。
8.本发明结合全球公共卫生事件sars-cov-2病毒的暴发流行，从单细胞水平分析病毒的易感细胞的分布和遗传特征。目前尚无针对sars-cov-2病毒感染导致肾损伤的早期监测方法，本发明将为研发一种评估sars-cov-2病毒引起的肾脏受累风险的方法提供有用信息。
9.作为本发明所述试剂盒的优选实施方式，所述肾脏易感细胞为pt-3细胞。
10.如何早期发现sars-cov-2病毒感染后肾脏细胞受累，需要首先明确sars-cov-2的肾脏易感细胞类型，其次是在covid-19患者中通过一种操作简单且无侵入的方法鉴定和定量这类细胞。本发明通过单细胞测序研究，发现pt-3细胞不仅富集sars-cov-2病毒受体、蛋白酶等病毒入侵所依赖宿主因子，还具有病毒感染和复制所需要的细胞机器。提示这种细胞亚类是对sars-cov-2高度易感的细胞类型。
11.作为本发明所述试剂盒的优选实施方式，其特征在于，所述标志蛋白包括pepd或slc36a2。
12.为了区分不同ptecs细胞的亚类，分析了其特异性标志基因。表明对sars-cov-2高度易感的细胞pt-3细胞的代表性标志基因包括peptidase d(pepd)和slc36a2等。
13.作为本发明所述试剂盒的优选实施方式，所述pepd的ncbi登录号为geneid:5184。
14.作为本发明所述试剂盒的优选实施方式，所述slc36a2的ncbi登录号为geneid:153201。
15.作为本发明所述试剂盒的优选实施方式，所述试剂盒中还含有从尿液中分离蛋白的试剂。
16.本发明通过研发一种无创伤、可动态监测、操作简单的方法，通过检测covid-19患者尿液中肾脏易感细胞的标志蛋白水平，评估患者肾脏受累风险和严重程度。
17.本发明还提供一种肾脏易感细胞的标志蛋白作为标志物在制备评估新型冠状病毒肺炎患者肾脏受累风险的试剂盒中的用途。
18.作为本发明所述用途的优选实施方式，所述肾脏易感细胞为pt-3细胞。
19.作为本发明所述用途的优选实施方式，所述标志蛋白包括pepd或slc36a2。
20.本发明的有益效果：
21.(1)本发明结合全球公共卫生事件sars-cov-2病毒的暴发流行，从单细胞水平分析病毒的易感细胞的分布和遗传特征。目前尚无针对sars-cov-2病毒感染导致肾损伤的早期监测方法，本发明将为研发一种评估sars-cov-2病毒引起的肾脏受累风险的方法提供有用信息。
22.(2)本发明鉴定了sars-cov-2病毒易感细胞：近端肾小管上皮细胞的pt-3亚类，可以用于诊断和筛选具有肾脏感染高风险的covid-19患者。pt-3细胞亚类的代表性标志物包括pepd、slc36a2等。尿液中这些蛋白的鉴定和量化可以作为早期诊断sars-cov-2感染引起肾损伤的生物标志物标签。
23.(3)本发明的检测方法仅需要收集患者尿液，不需要进行有创操作获取肾组织，避免肾穿刺带来的出血、损伤等风险，而且可以动态重复检测，观察变化。其次，通过检测特定细胞的标识蛋白可以精准定位感染部位和细胞。
附图说明
24.图1：本发明实验流程图。
25.图2：病毒受体ace2在不同肾脏细胞中的表达情况。
26.图3：ptecs进行无监督聚类分析生成的降维图(tsne)。
27.图4：宿主因子在pt-3和其他ptecs亚类中的表达。
28.图5：pt-3marker的尿蛋白组学结果图，其中*：p＜0.05；***：p＜0.001。
具体实施方式
29.为更清楚地表述本发明的技术方案，下面结合具体实施例进一步说明，但不能用于限制本发明，此仅是本发明的部分实施例。
30.单细胞测序研究可以解读混杂细胞群体的差异性，可用于单个细胞的功能状态研究，以无偏差的方式对细胞进行分类，发现新的细胞类型，可以对少见或特殊类型的细胞的遗传信息进行刻画，对我们研究这些特殊细胞群体在sars-cov-2感染和损伤肾脏的发病机制中的作用有重要意义。
31.单细胞测序能够检出混杂的细胞群中单个细胞的遗传信息，发现不同细胞之间在遗传物质和功能上的差异。通过挖掘已发表的正常人肾脏单细胞rna测序数据集调查sars-cov-2病毒感染相关的关键宿主因子(包括病毒受体ace2、宿主蛋白酶tmprss2、ctsb/l、限制因子、涉及病毒复制、组装和释放的宿主因子)在不同肾脏细胞中的表达特征，以发现sars-cov-2的肾脏易感细胞类型。本发明的数据分析是基于正常人肾脏单细胞rna测序数据集(gse140989)。本发明的具体操作步骤如下：
32.(1)首先我们下载了细胞基因的表达值计算矩阵，分析前的数据预处理包括质量控制去除低质量细胞；
33.(2)然后进行数据的标准化；
34.(3)使用主成分分析和生成降维图像(tsne)进行细胞的可视化。
35.(4)进一步对这些细胞进行聚类分析，获得不同的细胞群。
36.实施例1病毒受体ace2在不同肾脏细胞中的表达情况
37.为了对分离出的不同细胞群进行标记，我们分析了每一群细胞的差异表达基因，并对差异基因进行了下游的功能分析。分析共纳入19个肾组织样本的17578个肾脏细胞。
38.评估病毒受体ace2在不同肾脏细胞中的表达情况，结果如图2所示，显示ace2主要集中分布在ptecs(近端肾小管上皮细胞)，而在其他肾小管细胞和肾小球细胞(包括内皮细胞、足细胞、系膜细胞)中无明显表达。
39.实施例2 ptecs的无监督聚类分析
40.进一步提取出优势表达ace2的ptecs进行无监督聚类分析，结果如图3所示，得到了7种ptecs的亚类(pt-1至pt-7)。
41.从图3中可以看出，不同近端肾小管上皮细胞亚类中包括病毒受体ace2在内多种宿主因子的表达水平存在显著差异。其中，pt-3细胞存在ace2mrna的显著富集，其mrna水平远高于其他ptecs亚类。
42.实施例3对pt-3细胞的差异表达基因进行分析
43.对pt-3细胞的差异表达基因进行分析，结果如图4所示，从图中可以看出：
44.(1)pt-3细胞还表达病毒入侵细胞所需要的多种宿主蛋白酶，并且具有与病毒复制(top3b、zcrb1)、组装和释放(chmp2a、ap2m1、tapt1、rab14、rab10)相关的宿主因子。
45.(2)pt-3细胞表达的蛋白酶主要是ctsb，且tmprss2和ctsl表达阳性细胞的百分比均较ctsb低。
46.(3)此外，在pt-3细胞中几乎无法检测出病毒限制因子ifitm2、ifitm3和ly6e的mrna。
47.上述结果表明，pt-3细胞不仅富集sars-cov-2病毒受体、蛋白酶等病毒入侵所依赖宿主因子，还具有病毒感染和复制所需要的细胞机器。提示这种细胞亚类是对sars-cov-2高度易感的细胞类型。pt-3细胞和其他ptecs亚类的差异表达基因主要富集在内吞、自噬以及多个与病毒感染相关的信号通路中，提示pt-3细胞的功能与病毒感染密切相关。
48.为了区分不同ptecs细胞的亚类，分析了其特异性标志基因。结果显示对sars-cov-2高度易感的细胞pt-3细胞的代表性标志基因包括peptidase d(pepd)和slc36a2等。
49.其中，peptidase d(pepd)基因的ncbi上的登录号为geneid:5184，slc36a2基因的ncbi上的登录号为geneid:153201。
50.实施例4
51.为了对上述单细胞测序数据分析的发现进行验证，我们应用尿蛋白组学技术对covid-19患者(97例)和性别、年龄匹配的健康志愿者(350例)的尿液中差异表达蛋白进行分析和比较。具体操作步骤如下：
52.(1)收集患者或健康志愿者中段晨尿，56℃水浴30分钟，取样后-80℃冰箱保存。
53.(2)检测前尿液标本复温混匀取1ml尿液，超速离心70分钟，离心后沉淀加入40ul重悬浮缓冲液，65℃加热30分钟，还原去除尿调制素(umod)。然后加入洗涤缓冲液160ul并进行第二次超速离心30分钟。离心后的沉淀中加入30ul 50mm nh4hco3溶液，95℃加热3分钟，待冷却至室温后加入1ug胰酶混匀，37℃消化4小时，蛋白质样本被胰酶消化切割成肽链，获得小分子肽和胰蛋白酶的混合物。
54.(3)消化后的样品在装有c18颗粒的自制毛细管柱上分离胰蛋白酶肽，并通过与在线easy-nlc 1000纳米-hplc系统(thermo fisher scientific)联用的thermo fisher orbitrap质谱仪进行分析。
55.结果如图5所示，covid-19患者pt-3细胞的标志蛋白pepd和slc36a2的丰度显著高于健康人，提示covid-19患者的pt-3细胞受损。
56.因此，通过尿液中对相应pt-3细胞的标志物测定，可以从混杂的细胞群体中准确鉴别出这种细胞亚类。这一方法不仅定位准确，而且无创伤性、操作便捷简单。通过检测尿
液中这些易感细胞，可以评估covid-19患者肾脏受累的风险。
57.最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。