基于特征香气物质指纹图谱的葡萄采后贮藏期评价方法与流程

本发明涉及葡萄保鲜
技术领域：
，具体涉及一种基于特征香气物质指纹图谱的葡萄采后贮藏期评价方法。
背景技术：
：随着市场对高品质葡萄需求的不断扩大及葡萄保鲜技术的迅速发展，针对葡萄果实品质、贮藏期等的快速、无损检测已成为果蔬保鲜领域的重要研究方向。葡萄属浆果类，贮藏运输过程中易发生落粒、机械伤、霉变等品质裂变的现象。由于产期及销售市场等因素，常利用现代果蔬贮藏保鲜技术对葡萄进行中长期保鲜处理，以达到错季增值销售的目的，提高果品经济效益。针对葡萄贮藏期内的品质劣变的评价判断标准，目前研究与应用中大多通过好果率、落粒、褐变、糖酸变化、维生素c、硬度、果皮颜色、质构特性等商品性及物理化学指标进行评价葡萄贮藏期的品质，以此为基础进行粗略分级定价销售，评价指标繁多，标准不一致，测试过程复杂，难以得到广泛推广应用。香气特征变化是判定葡萄果实品质劣变的重要因素，现有技术多利用气相色谱或气相色谱-质谱联用对总挥发性成分进行定性，通过种类和相对含量的变化表示其香气的变化。有学者应用电子鼻检测，建立贮藏期的判别模型，应用判别函数对葡萄贮藏期进行判别。gc-ims(气相色谱-离子迁移谱)分析技术广发应用于食品风味研究领域，具有灵敏度高、稳定性好、响应速度快、数据处理简单等优点。目前研究中，基于香味指纹图谱应用于产地判别、快速检测、掺假检验、快速分类、加工工艺评价等
技术领域：
。目前未见在葡萄香味研究领域的报道，也未见在果蔬采后贮藏期评价判别的应用实例。因此，基于特征香气物质组成可以作为评价葡萄采后贮藏期。建立一种高效评价葡萄采后贮藏期的方法具有重要的应用参考价值和产业意义。其中，阳光玫瑰葡萄自2007年由日本引入中国，因愉快香气、清爽口感，公认为是极具发展潜力的鲜食品种。近年来，由于该品种葡萄市场销售价格较高，种植面积不断扩大。有学者预计，经过10年的发展，全国种植面积将超过100万亩，极有可能成为继巨峰、红地球之后的第3个时代性品种。有研究表明，阳光玫瑰葡萄经过低温冷藏保鲜，香气损失严重，特征香气物质里那醇含量锐减，从而很大程度上降低了保鲜葡萄果品品质。阳光玫瑰葡萄是典型玫瑰香型葡萄，香气特征以花香、果香、青香为主体，香气变化是反映葡萄贮藏期的重要因素。葡萄香气物质属次生代谢产物，在采后贮藏期内次生代谢产物的变化更能反映葡萄生理代谢及衰老状态，其变化趋势一定程度上同样伴随着初生代谢产物的变化以及外观、质地等指标的变化，基于特征香气物质组成可以作为评价阳光玫瑰葡萄采后贮藏期，有很高的实际应用前景。技术实现要素：本发明的发明目的是，针对上述问题，提供一种基于特征香气物质指纹图谱的葡萄采后贮藏期评价方法，操作简单、样品检测时间短以及不需要复杂的样品前处理，具有较高的应用价值。为达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：一种基于特征香气物质指纹图谱的葡萄采后贮藏期评价方法，包括以下步骤，s1.标准样品处理：s11.标准样品选择：样品选择单独处理组或交互处理组，处理组数量n为1-3个，每个处理组包含≥100个包装单元；s12.取样：将选择的样品进行混合取样，然后用刀片切开，取出葡萄籽，果肉粉碎成粉末，得到标准样品装入进样瓶，封口膜封口，-80℃冷冻存样备用.s2.待测样品处理：将待检测的葡萄按照步骤s1的方法进行处理得到待测样品；s3.气相-离子迁移谱分析：通过气相色谱-离子迁移谱联用仪对标准样品进行挥发性物质的检测，得到指纹谱图.s4.数据处理与分析：采用比较法提取步骤s3获得的指纹图谱上的特征值区域，所述比较法为根据特征物质在指纹信息谱图中颜色的差异变化和峰面积；选择不同保鲜处理的标准样品挥发物质谱图物质点颜色变化深或峰面积差异大的谱图特征区域。s5选取及评价方法构建：根据物质峰强度信号差异和物质对应的保留时间和迁移时间，从特征区域中选取能显著区分不同贮藏期葡萄的2-5类特征香气物质，作为判别采后贮藏期品质的标准；或者依据步骤s4中的数据分析结果，建立n×m×p个点阵样本的主成分分析，绘制数据模型图，将所有的样本数据点依据欧氏距离法分成3个区域，对应判别为高保真保鲜期、优质保鲜期和品质劣变期。其中与贮藏保鲜原始样本即0周的样品簇集较近的样品点为第一区域，距离相对较远的群体划分为第二区域，距离最远的样本群体划分为第三区域。s6.待测样品判定：采用步骤s3同样的仪器条件对待测样品进行检测，获得指纹图谱，参照步骤s5的评价标准进行判定。优选的，样品选择单独处理或交互处理组，处理方法选择不同贮藏保鲜温度：0℃、4℃、10℃，或不同保鲜剂处理：无保鲜剂、保鲜剂，或不同减菌化处理：含氯类、dmdc、乙醇、纳他霉素。优选的，步骤s1中，具体取样步骤为：将步骤s11的每个样品，5个包装单元为1个重复，可设置2-6个重复；每个重复试验中，单个包装单元取3穗果穗，单穗葡萄上、中、下部位分别取样1果粒，混合样品为一个重复的样品；取样周期为0-20周，每2周取样一次，贮藏期取样次数p为5-10次。优选的，步骤s1中，取出葡萄籽，果肉加液氮粉碎成粉末，冷冻状态下取样1-10g样品装入顶空进样瓶。优选的，步骤s2中，采用气相-离子迁移谱对样品进行分析，色谱柱类型fs-se-54-cb-1，柱温60℃，载气/漂移气n2，ims温度45℃；顶空进样单元条件：进样体积500ul，孵育时间30min，孵育温度45℃，进样针温度85℃，孵化转速500rpm；漂移气流速度150ml/min，气相载气流速2-150ml/min。优选的，步骤s5中，当葡萄品种为阳光玫瑰葡萄时，具体的评价标准如下：(1)筛选出第一类物质，包含芳樟醇linalool和36号、37号、38号4种物质，linalool气相保留时间为12.97min，离子漂移时间为1.2216ms，36号、37号、38号3种物质的气相保留时间分别为3.98min、6.93min、6.92min，离子漂移时间分别为1.12198ms、1.45745ms、1.48968ms；当linalool、36号、37号、38号物质出峰面积低于500au、300au、150au、500au，判别为从高保真保鲜期转入优质保鲜期；当linalool、36号、37号、38号物质出峰面积分别低于200au、200au、100au、200au，判别为从优质保鲜期进入劣变保鲜期。(2)筛选出第二类物质，包含50号、51号2种物质；50号、51号、2种物质气相保留时间分别为1.83min、1.87min，离子漂移时间分别为1.07193ms、1.22922ms；当这2种物质的响应出峰面积骤升高，峰面积值高于1000au时，可判定为香气劣变程度大，失去了贮藏保鲜的商品性。优选的，步骤s6中，待测样品判定时，步骤s5中的两个评别标准可以单独使用，也可以综合使用。由于采用上述技术方案，本发明具有以下有益效果：1.本发明的基于特征香气物质指纹图谱的葡萄采后贮藏期评价方法，基于特征香气物质的指纹图谱，快速评价判别贮藏期内阳光玫瑰葡萄果实品质的劣变程度，并可对未知采后保鲜/货架周期的阳光玫瑰葡萄进行鉴定，同时可对贮藏葡萄的品质变化和最佳贮藏周期进行预测预警，在技术理论和实际推广上有重要的应用价值。2.本发明的基于特征香气物质指纹图谱的葡萄采后贮藏期评价方法，依据阳光玫瑰葡萄品种的香气特性，开发和提供一种应用气相色谱-离子迁移谱的快速检测方法，基于特征香气物质指纹图谱的模型构建，建立关键指标物质和判别标准，能够快捷、稳定、科学的判别贮藏期阳光玫瑰葡萄果实品质的劣变程度，以判别和预测葡萄最佳贮藏周期。同时为其他葡萄品种以及其他果蔬采后货架期/贮藏期的评价判别提供一种高效的新方法。3.本发明的基于特征香气物质指纹图谱的葡萄采后贮藏期评价方法，大大缩短和简化了果树砧木选择的过程，在其他果树的研究与生产上均可借鉴应用，有很高的实际应用前景。附图说明图1为0℃下贮藏0、1、2、4、6、8、12、16、20w葡萄中的挥发性有机物差异；图2为0℃下贮藏0、1、2、4、6、8、12、16、20w葡萄中挥发性有机物的gc-ims谱图；图3为0℃下贮藏0-20周葡萄中挥发性有机物的指纹图谱对比；图4为10℃下贮藏0、1、2、4、6、8、12、16、20w葡萄中的挥发性有机物差异；图5为0℃下贮藏0、1、2、4、6、8、12、16、20w葡萄中挥发性有机物的gc-ims谱图图6为10℃下贮藏0-20周葡萄中挥发性有机物的指纹图谱对比；图7为葡萄在0℃和10℃下贮藏0-20周的挥发性有机物的指纹图谱对比；图8为0℃下贮藏0、1、2、4、6、8、12、16、20w葡萄样品的pca(主成分分析)；图9为10℃下贮藏0、1、2、4、6、8、12、16、20w葡萄样品的pca(主成分分析)。具体实施方式为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。实施例1一种基于特征香气物质指纹图谱的葡萄采后贮藏期评价方法，包括以下步骤，s11.标准样品选择：样品选择单独处理组或交互处理组，处理方法选择不同贮藏保鲜温度：0℃、4℃、10℃，或不同保鲜剂处理：无保鲜剂、保鲜剂，或不同减菌化处理：含氯类、dmdc、乙醇、纳他霉素。处理组数量n为1-3个，每个处理组包含≥100个包装单元。s12.取样：将选择的样品进行混合取样，将步骤s11的每个样品，5个包装单元为1个重复，可设置2-6个重复；每个重复试验中，单个包装单元取3穗果穗，单穗葡萄上、中、下部位分别取样1果粒，混合样品为一个重复的样品；取样周期为0-20周，每2周取样一次，贮藏期取样次数p为5-10次。然后用刀片切开，取出葡萄籽，将果肉加液氮粉碎成粉末，得到标准样品，冷冻状态下取样1-10g样品装入顶空进样瓶，封口膜封口，-80℃冷冻存样备用。s3.待测样品处理：将待检测的葡萄按照步骤s1的方法进行处理得到待测样品。s3.气相-离子迁移谱分析：通过气相色谱-离子迁移谱联用仪对样品进行挥发性物质的检测，得到三维指纹谱图。采用气相-离子迁移谱对样品进行分析，色谱柱类型fs-se-54-cb-1，柱温60℃，载气/漂移气n2，ims温度45℃；顶空进样单元条件：进样体积500ul，孵育时间30min，孵育温度45℃，进样针温度85℃，孵化转速500rpm；漂移气流速度150ml/min，气相载气流速2-150ml/mins4.数据处理与分析。采用比较法提取步骤s3获得的指纹图谱上的特征值区域，所述比较法为根据特征物质在指纹信息谱图中颜色的差异变化和峰面积；选择不同砧木和自根苗葡萄果实样品挥发物质谱图物质点颜色变化深或峰面积差异大的谱图特征区域；对全部特征区域的物质出峰数据进行正交变换和降维，实现对n×m个葡萄果实样品进行快速聚类。s5.选取及评价方法构建：根据物质峰强度信号差异和物质对应的保留时间和迁移时间，从特征区域中选取能显著区分不同贮藏期葡萄的2-5类特征香气物质，并基于此对贮藏期品质进行判别。s6.待测样品判定：采用步骤s3同样的仪器条件对待测样品进行检测，获得指纹图谱，参照步骤s5的评价标准进行判定。实施例2一种基于特征香气物质指纹图谱的葡萄采后贮藏期评价方法，包括以下步骤，s11.样品选择：样品选择单独处理组或交互处理组，处理方法选择不同贮藏保鲜温度：0℃、4℃、10℃，或不同保鲜剂处理：无保鲜剂、保鲜剂，或不同减菌化处理：含氯类、dmdc、乙醇、纳他霉素。处理组数量n为1-3个，每个处理组包含≥100个包装单元。s12.取样：将选择的样品进行混合取样，将步骤s11的每个样品，5个包装单元为1个重复，可设置2-6个重复；每个重复试验中，单个包装单元取3穗果穗，单穗葡萄上、中、下部位分别取样1果粒，混合样品为一个重复的样品；取样周期为0-20周，每2周取样一次，贮藏期取样次数p为5-10次。然后用刀片切开，取出葡萄籽，将果肉加液氮粉碎成粉末，冷冻状态下取样1-10g样品装入顶空进样瓶，封口膜封口，-80℃冷冻存样备用。s2.待测样品处理：将待检测的葡萄按照步骤s1的方法进行处理得到待测样品；s3.气相-离子迁移谱分析：通过气相色谱-离子迁移谱联用仪对样品进行挥发性物质的检测，得到三维指纹谱图。采用气相-离子迁移谱对样品进行分析，色谱柱类型fs-se-54-cb-1，柱温60℃，载气/漂移气n2，ims温度45℃；顶空进样单元条件：进样体积500ul，孵育时间30min，孵育温度45℃，进样针温度85℃，孵化转速500rpm；漂移气流速度150ml/min，气相载气流速2-150ml/mins4.数据处理与分析。采用比较法提取步骤s3获得的指纹信息图谱上的特征值区域，所述比较法为根据特征物质在指纹信息谱图中颜色的差异变化和峰面积；选择不同砧木和自根苗葡萄果实样品挥发物质谱图物质点颜色变化深或峰面积差异大的谱图特征区域；对全部特征区域的物质出峰数据进行正交变换和降维，实现对n×m个葡萄果实样品进行快速聚类。s5.基于欧式距离法的贮藏期判别方法构建依据步骤s4中的数据分析结果，建立n×m×p个点阵样本的主成分分析，绘制数据模型图，将所有的样本数据点依据欧氏距离法分成3个区域，对应判别为高保真保鲜期、优质保鲜期和品质劣变期。其中与贮藏保鲜原始样本即0周的样品簇集较近的样品点为第一区域，距离相对较远的群体划分为第二区域，距离最远的样本群体划分为第三区域。s6.待测样品判定：采用步骤s3同样的仪器条件对待测样品进行检测，获得指纹图谱，参照步骤s5的评价标准进行判定。实施例3一种基于特征香气物质指纹图谱的葡萄采后贮藏期评价方法，葡萄品种为阳光玫瑰葡萄品种，包括以下步骤，阳光玫瑰葡萄采取冰温贮藏保鲜方式，保鲜环境可选择标准果蔬冷藏库或小型恒温冷藏箱；采取小型保鲜袋密封方式，保鲜袋可选择普通低密度聚乙烯保鲜袋、具有气调功能的保鲜袋、具有乙烯抑制作用的透湿保鲜袋等，包装单元为2.5kg；预冷方式：采后挑拣后装入保鲜袋，敞口预冷24-36h，放入或不放入保鲜剂进行封口处理。s11.样品选择：选择处理组为：葡萄在0℃和10℃下贮藏保鲜，每个处理组处理100个包装单元以上。s12.取样：将选择的样品进行混合取样，将步骤s11的每个样品，5个包装单元为1个重复，可设置2-6个重复；每个重复试验中，单个包装单元取3穗果穗，单穗葡萄上、中、下部位分别取样1果粒，混合样品为一个重复的样品；分别在0、1、2、4、6、8、12、16、20w(周)随机取样，贮藏期取样次数p为5-10次。然后用刀片切开，取出葡萄籽，将果肉加液氮粉碎成粉末，得到标准样品，冷冻状态下取样1-10g样品装入顶空进样瓶，封口膜封口，-80℃冷冻存样备用。样品信息如表1。表1样品信息表序号样品编号说明10w原始样，未处理前，11.7611g20-1w0℃处理1周取样，9.7247g30-2w10.5863g40-4w10.0396g50-6w11.6044g60-8w10.9624g70-12w11.2623g80-16w12.1021g90-20w13.3722g1010-1w10℃处理1周取样，下同9.7757g1110-2w10℃处理2周取样，10.6035g1210-4w10.1185g1310-6w9.8263g1410-8w12.1082g1510-12w10.9601g1610-16w11.9408g1710-20w11.5055gs2.待测样品处理：将待检测的葡萄按照步骤s1的方法进行处理得到待测样品。s3.气相-离子迁移谱分析：通过气相色谱-离子迁移谱联用仪对样品进行挥发性物质的检测，得到三维指纹谱图。采用气相-离子迁移谱对样品进行分析，色谱柱类型fs-se-54-cb-1，柱温60℃，载气/漂移气n2，见下表2，ims温度45℃；顶空进样单元条件：进样体积500ul，孵育时间30min，孵育温度45℃，进样针温度85℃，孵化转速500rpm；漂移气流速度150ml/min，气相载气流速2-150ml/min表2气相色谱条件timee1e2r00:00,000150ml/min2ml/minrec02:00,000150ml/min2ml/min-10:00,000150ml/min10ml/min-20:00,000150ml/min100ml/min-30:00,000150ml/min150ml/minstops4.数据处理与分析。采用比较法提取步骤s3获得的指纹信息图谱上的特征值区域，所述比较法为根据特征物质在指纹信息谱图中颜色的差异变化和峰面积；选择不同砧木和自根苗葡萄果实样品挥发物质谱图物质点颜色变化深或峰面积差异大的谱图特征区域；对全部特征区域的物质出峰数据进行正交变换和降维，实现对n×m个葡萄果实样品进行快速聚类。s5.选取及评价方法构建：分析图1-图9，根据物质峰强度信号差异和物质对应的保留时间和迁移时间，从特征区域中选取能显著区分不同贮藏期葡萄的两类特征香气物质，并基于此对贮藏期品质进行判别。判别标准如下：第一种方法：筛选出两种物质：(1)筛选出第一类物质，包含芳樟醇(linalool)和36号、37号、38号4种物质，从类别上属于萜烯及其衍生物。第一类物质在贮藏期内呈现递减规律，且存在骤减的转折时间点，表征阳光玫瑰葡萄香气典型性和浓郁度的显著衰减。linalool气相保留时间为12.97min，离子漂移时间为1.2216ms，36号、37号、38号3种物质的气相保留时间分别为3.98min、6.93min、6.92min，离子漂移时间分别为1.12198ms、1.45745ms、1.48968ms。根据第一类物质的检测峰面积可将贮藏期判别为：高保真保鲜期、优质保鲜期和劣变保鲜期。当linalool、36号、37号、38号物质出峰面积低于500au、300au、150au、500au，判别为从高保真保鲜期转入优质保鲜期；当linalool、36号、37号、38号物质出峰面积低于200au、200au、100au、200au，判别为从优质保鲜期进入劣变保鲜期。(2)筛选出第二类物质，包含50号、51号2种物质。第二类物质在贮藏后期出现，反映出葡萄果实劣变程度，出现一定程度异味或不属于该品种典型的香气物质。50号、51号、2种物质气相保留时间分别为1.83min、1.87min，离子漂移时间分别为1.07193ms、1.22922ms。当这2种物质的响应出峰面积骤升高，峰面积值高于1000au时，可判定为香气劣变程度大，失去了贮藏保鲜的商品性。依据以上选取的2类物质，通过gc-ims对贮藏期的阳光玫瑰葡萄快速分析，即可基于特征香气物质贮藏期阳光玫瑰葡萄的香气品质劣变程度进行评价，从而达到对高保真和优质贮藏周期的判别。第二种方法：依据步骤s4中的数据分析结果，建立n×m×p个点阵样本的主成分分析(pca)，绘制数据模型图，将所有的样本数据点依据欧氏距离法分成3个区域，其中与贮藏保鲜原始样本(即0周的样品)簇集较近的样品点为第一区域，距离相对较远的群体划分为第二区域，距离最远的样本群体划分为第三区域。如图8和图9。贮藏不同周期的阳光玫瑰葡萄依据分析结果，落入第一区域判别为高保真保鲜期，落入第二区域判别为优质保鲜期，落入第三区域范围的判别为品质劣变期。以上两种评价判别模型可以分开单独使用，也可综合进行判别。s6.待测样品判定：采用步骤s3同样的仪器条件对待测样品进行检测，获得指纹图谱，参照步骤s5的评价标准进行判定。上述说明是针对本发明较佳可行实施例的详细说明，但实施例并非用以限定本发明的专利申请范围，凡本发明所提示的技术精神下所完成的同等变化或修饰变更，均应属于本发明所涵盖专利范围。当前第1页12