本发明涉及酶联免疫检测技术，尤其是涉及一种检测啶虫脒的双抗夹心elisa试剂盒及其应用。
背景技术：
烟碱类农药是继有机磷、氨基甲酸酯和拟除虫菊酯类杀虫剂之后的一类重要杀虫剂，其主要通过选择性控制昆虫中枢神经系统烟碱型乙酰胆碱酯酶受体(nachrs)，从而阻断昆虫中枢神经系统的正常传导，导致害虫出现全身麻痹进而死亡。啶虫脒是新烟碱类杀虫剂的代表性药剂，在农业生产上被广泛用于种子、叶面和土壤中多种害虫的防治，对蚜虫、叶蝉、烟粉虱、潜叶蛾等害虫防治效果较为理想，在烟草上主要用于烟蚜的防治。农药残留控制是产品质量安全控制的重要内容，是政府机构、生产企业及消费者共同关注的重点。啶虫脒近年来使用广泛，检出率高，屡有超限情况发生。
传统的检测方法虽然能够准确测定啶虫脒的含量，但需要专门的仪器设备，步骤繁琐，检测成本高，耗时长，样品需要经过复杂的预处理，需要专门的技术人员来完成，难以满足对环境及市场产品现场快速检测的要求。免疫检测是一种新型的检测方法，与传统检测方法相比，具有省时、省力、费用低廉、便于携带、易于操作等优点。
技术实现要素：
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种检测啶虫脒的双抗夹心elisa试剂盒，能够快速检测农作物中啶虫脒的残留。
本发明还提出一种上述检测啶虫脒的双抗夹心elisa试剂盒的应用。
根据本发明第一方面实施方式的啶虫脒的双抗夹心elisa试剂盒，所述试剂盒包括以抗啶虫脒的特异性单抗和/或多抗组成的捕获剂、酶标二抗、样品稀释液、底物。
在本发明的一些实施方式中，所述捕获剂为小鼠抗啶虫脒抗体igg。
在本发明的一些实施方式中，小鼠抗啶虫脒抗体igg用样品稀释液进行稀释，其稀释后的溶液为捕获剂。
在本发明的一些实施方式中，所述二抗为标记的兔抗啶虫脒抗体。
在本发明的一些实施方式中，所述标记酶标二抗的为hrp。
在本发明的一些实施方式中，所述hrp标记的酶标二抗用样品稀释液进行稀释后作为酶标二抗。
在本发明的一些实施方式中，所述啶虫脒的双抗夹心elisa试剂盒，所述捕获剂附于固相支持物上。
在本发明的一些实施方式中，所述啶虫脒的双抗夹心elisa试剂盒，所述固相支持物为酶标板或生物芯片。
在本发明的一些实施方式中，所述稀释液的组分为含体积分数为8％～12％fbs(小牛血清)的磷酸盐缓冲液。
在本发明的一些实施方式中，所述稀释液的组分为含体积分数为10％fbs(小牛血清)的ph7.4的磷酸盐缓冲液。
在本发明的一些实施方式中，所述啶虫脒的双抗夹心elisa试剂盒，所述捕获剂与酶标二抗的用量比为1：(1～3)。
在本发明的一些实施方式中，所述啶虫脒的双抗夹心elisa试剂盒，所述捕获剂与酶标二抗的用量比为1：1。
在本发明的一些实施方式中，所述抗体的制备方法为：首次免疫采用抗原免疫，注射啶虫脒；首次免疫后进行加强免疫，共进行3～6次加强免疫，最后一次加强免疫后取血。
根据本发明的第二方面实施方式的上述检测啶虫脒的双抗夹心elisa试剂盒的应用，所述应用为检测啶虫脒含量中的应用。
在本发明的一些实施方式中，所述应用为上述试剂盒在检测食品中啶虫脒残留中的应用。
一种检测啶虫脒含量的方法，包括如下步骤：
s1、取出鼠抗啶虫脒抗体包被的酶标板，加入样品溶液，孵育完后弃去孔内液体，用洗液冲洗后拍干；
s2、加入hrp标记的兔抗啶虫脒抗体，孵育完成后弃去孔内液体，洗液清洗后拍干；
s3、加入显色液显色；
s4、加入终止液；
s5、测定反应液的吸光值，根据标准曲线得到所述待检样品中啶虫脒含量。
在本发明的一些实施方式中，所述显色液为3,3',5,5'-四甲基联苯胺(tmb)。
在本发明的一些实施方式中，所述终止液为硫酸。
在本发明的一些实施方式中，所述啶虫脒抗原标准品浓度为0ng/ml～80ng/ml。
在本发明的一些实施方式中，所述hrp标记的兔抗啶虫脒抗体浓度为0.5～1.5μg/ml。
本发明的有益效果在于：本发明提供了一种检测啶虫脒的双抗夹心elisa试剂盒及其方法与应用。通过包被特异性高的单克隆抗体，检测抗体用hrp标记的多克隆抗体，能够快速检测啶虫脒的浓度，检测程序简单方便，检测时间短，一次操作时间不超过2h，可同时检测多个样品，检测灵敏度高。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1啶虫脒免疫原的制备
啶虫脒半抗原的合成
取n-去甲啶虫脒0.50g，加甲醇50ml溶解，加氨基丁酸0.30g，搅拌，加37％甲醛水溶液0.37ml，搅拌，混匀，80℃反应4h；停止反应，旋蒸除去甲醇，加水50ml，加100ml乙酸乙酯萃取，萃取三次，合并有机相，旋蒸蒸干，上硅胶柱，二氯甲烷/甲醇(10/1)洗脱分离，得到半抗原产物。
啶虫脒半抗原与牛血清白蛋白(bsa)偶联得到免疫原。
取半抗原羧基啶虫脒11mg，加二甲基亚砜1ml溶解，加氯甲酸异丁酯0.18ml，三乙胺0.1ml，0～4℃反应1h，得到半抗原活化液a液；取bsa50mg，加0.8％盐水3ml溶解，得到b液；将a液滴加到b液中，继续搅拌反应5h，0.02mol/lpb透析纯化3天，每天换液3次，得到免疫原，分装，-20℃保存。
实施例2鼠抗啶虫脒抗体血清和兔抗啶虫脒抗体血清的制备
具体的免疫方法如下:
(1)抗原乳化：佐剂与抗原按1:1体积比例加入离心管，在冰浴中用微型搅拌器快速搅拌进行乳化，当乳液滴入水中不扩散即可。
(2)首次免疫：采用弗氏完全佐剂进行抗原乳化，豚鼠或家兔背部皮下多点免疫，前者注射啶虫脒免疫原0.2mg/只，后者注射啶虫脒免疫原0.5mg/只。
(3)加强免疫：首次免疫14天后进行加强免疫，采用弗氏不完全佐剂进行抗原乳化，其它步骤与首次免疫相同，每次加强免疫间隔时间为10天，共进行3次加强免疫。
(4)第三次加强免疫后的第5天进行心脏取血，固定好豚鼠或家兔，每只腹腔注射20％乌来糖麻醉剂进行麻醉。完全麻醉后，用剪刀剪开胸腔，暴露心脏位置，用一次性注射器从心尖处进针，针尖进入心室，缓慢回抽注射器，抽完血，拔掉针头，注射器贴着离心管壁缓慢推动，将注射器的血液沿着管壁流入离心管。
(5)采集的血液于4℃过夜，第二天于3000rpm，离心10min，取上层血清于-70℃保存。
实施例3间接elisa法测定抗体血清效价
具体操作如下：
(1)用包被液将鼠抗啶虫脒抗体以20μg/ml包被于96孔板，每孔加入100μl，置于4℃过夜，用洗液洗3遍，拍干。
(2)每孔加入200μl封闭液，于37℃孵育2小时，用洗液洗3遍，拍干。
(3)将兔抗啶虫脒抗体血清和鼠抗啶虫脒抗体血清按1：10000、1：50000、1：100000和1：200000比例稀释(阴性对照血清按相同倍比稀释)，每孔加入100μl，37℃孵育1小时，用洗液洗3遍，拍干。
(4)兔抗啶虫脒抗体血清组加入hrp标记的羊抗兔1：10000，鼠抗啶虫脒抗体血清组加入hrp标记的羊抗鼠1：10000，每孔加100μl，37℃孵育1h，用洗液洗6遍，拍干。
(5)每孔加入100μltmb显色液，室温显色反应10min。
(6)每孔加入50μl终止液终止反应。
(7)在酶标仪上测450nm下的od值。当样品吸光值/阴性吸光值>2.1时，即认为是阳性，同时计算效价。
抗体效价：elisa抗血清效价达到1：50000，说明免疫合格，小鼠的抗血清效价均在1：20000以上；家兔的抗血清效价均在1：100000以上。
抗体纯化采用购自赛默飞公司的抗体纯化试剂盒。
实施例4标准曲线的绘制
本实施例采用一种检测啶虫脒的双抗夹心法，用于检测出不同样品的od450值，具体操作方法如下：
(1)在酶标板上加入包被抗体，包被抗体加入量为100μl/孔，4℃过夜后，使包被抗体包被酶标板，洗板后洗去未与酶标板结合的包被抗体，该包被抗体为啶虫脒单克隆抗体；
(2)加入封闭液在37℃下封闭1～2h，使封闭液对酶标板上多余结合位点进行封闭，封闭液加入量为200μl/孔，洗板后洗去酶标板上多余封闭液；
(3)在酶标板上加入样品，孵育后洗板；本实施例中分别一共采用了9种样品进行检测，该9种样品分别为1种检测样品和8种浓度分别为5ng/ml、10ng/ml、25ng/ml、100ng/ml、150ng/ml、200ng/ml、250ng/ml、300ng/ml的啶虫脒标准品稀释液。该检测样品为pbs空白对照样品。
(4)以鼠抗啶虫脒抗体为一抗加入酶标板，一抗的加入量为100μl/孔，在37℃下反应1h后洗板；再以辣根过氧化物酶标记的兔抗啶虫脒抗体为酶标二抗，酶标二抗的加入量为100μl/孔，在37℃下反应30min后洗板；
(5)加入显色液使酶标板显色，加入量为100μl/孔，加入后在37℃避光显色10min；然后加入浓度为2mol/l的硫酸，进行终止反应，硫酸加入量为100μl/孔；用酶标仪检测od450。
上述步骤中洗板的具体操作过程为：倒去酶标板孔内液体，在吸水纸上拍干，用含0.05％tween-20的pbst加满孔，静置3min，反复洗涤3～5次。
根据检测出的8种标准品溶液的od450值，并根据9种样品中的啶虫脒浓度，即可对应绘制出啶虫脒的标准曲线，其标准曲线为y＝3.66x+0.136，r2＝0.994。啶虫脒浓度单位为μg/ml。
其次，采用上述相同的步骤，只需将样品替换成待检测物品，即可检测出待检测物品的od450值，并对应标准曲线计算出该待检测物品的啶虫脒含量。
测试例
1、灵敏度检测
按照常规方法测定试剂盒灵敏度，试剂盒标准曲线最低点为5ng/ml，标准曲线的范围为5～300ng/ml；对空白水样20份进行检测，从标准曲线上查出对应于各百分吸光度值的浓度，以20份样本浓度的平均值加上3倍标准差表示检测限，结果得该方法对空白水样的检测限为2.8ng/ml。
2、特异性实验
将本发明方案制备的试剂盒用于测定3种烟碱类农药(吡虫啉、噻虫啉、烯啶虫胺)。将上述样品按一定浓度梯度进行稀释，检测方法如实施例4所示，结果表明，吡虫啉、噻虫啉、烯啶虫胺均不能与本申请方案制备的抗体发生反应，本申请方案制备的抗体特异性高。
3、样品检测
啶虫脒人工污染食物的制备：用啶虫脒溶液分别直接加入生理盐水、果汁和牛奶混匀作为污染水、果汁和牛奶。对添加啶虫脒溶液后的水样、果汁和牛奶稀释10倍处理，消除基质影响。以本文建立的快速elisa法测od450值，检测样品中啶虫脒的含量并计算样品回收率和相对标准偏差。回收率＝测量浓度/实际浓度×100％。每个样本做三个平行，用三批不同的试剂盒进行测定，计算平均值，结果如表1所示。
表1
检测结果如表1所示，从表中可以看出，水样、果汁和牛奶中均具有较好的回收率，回收率早92.6％-102.3％范围内，批内、批间的相对标准偏差均小于10％。结果表明，本发明方案建立的双抗夹心elisa方法准确度和精密度都很高，适用于食品样品中啶虫脒的残留的快速检测。
上面对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。