LTB4在胰腺癌诊断和治疗组合物中的应用的制作方法

本发明涉及分子生物学特别是肿瘤诊断领域，尤其是ltb4在胰腺癌诊断和治疗组合物中的应用。

背景技术：

既有的癌症研究较多注重于肿瘤细胞内发生的分子事件和生物过程在肿瘤发生发展中的作用，研究模式多为孤立的对某个点及周围有限环境进行独立、片面的研究，缺乏着眼于宏观、全局看待肿瘤的发生发展，开展整合、系统性研究[thebody-widetranscriptomelandscapeofdiseasemodels.iscience2018，2：238-268.]。我们在研究疾病时，通常仅在一个或几个选定器官中观察发生的变化和反应。例如，在研究心脏病时，心脏是重点。同样，在研究肿瘤时，大都是探索肿瘤在发生器官的改变，只有少数特定的器官比如转移灶器官才会被列为研究对象。随着对人体认知的不断深入，我们发现机体作为有机的统一体，器官间可以通过循环激素或者系统性因子与其他器官相互作用[lipidmetabo1itesasmetabolicmessengersininter-organcommunication.trendsinendocrinologyandmetabolism：tem2014，25(7)：356-363.]。最为典型的是，肿瘤发生后会对多个机体代谢器官产生广泛的影响，最终导致恶病质的产生，引起全身系统性疾病[modelinghumancancer-inducedcachexia.cellreports2019，28(6)：1612-1622e1614.；naturereviewsdiseaseprimers2018，4：17105.；mechanismsofmetabolicdysfunctionincancer-associatedcachexia.genes&development2016，30(5)：489-501.]。然而，关于肿瘤对人体各组织器官的影响、程度及其分子机制，我们都了解甚少。

目前，gtex数据库和人类蛋白质图谱数据库，分别发布了健康受试者的多个器官完整转录组和蛋白质组数据集。尽管这样正常的组织器官数据集在不断完善，但是缺乏全面综合的多器官和多疾病数据集，尤其是肿瘤患者。基于疾病状态下组织器官的数据集，我们可以：1)评估每种疾病模型中不同器官中发生的分子变化；2)各种疾病模型之间进行器官间比较，以及在特定模型内进行器官间比较；3)发现和推断整个人体的器官组织间的通信和交流网络；4)鉴定疾病特异性和/或器官特异性的分子标记，用作疾病的生物标记物和/或治疗的分子靶标。

胰腺癌号称“癌中之王”，过去30年针对胰腺癌的治疗都没有显著的进展。患者中位生存期只有半年，5年生存率不足8％。胰腺癌早期诊断非常困难。早期发现是获得最佳治疗效果的关键，早期胰腺癌手术切除率为90％-100％，5年生存率可达70％-100％，与进展期胰腺癌相比，其治疗效果存在着巨大的反差。但由于胰腺癌早期无明显和特异的症状和体征，以及缺乏简单、可靠的诊断方法，使早期诊断非常困难；最后，胰腺癌综合治疗效果不理想[siegelrl，millerkd，jemala.cancerstatistics，2018.ca：acancerjournalforclinicians2018，68(1)：7-30.]。

高通量多组学技术的出现极大地促进了胰腺癌发生发展的细胞分子机制的阐明[pancreaticcancergenomesrevealaberrationsinaxonguidancepathwaygenes.nature2012，491(7424)：399-405.；integratedgenomiccharacterizationofpancreaticductaladenocarcinoma.cancercell2017，32(2)：185-203e113.；wholegenomesredefinethemutationallandscapeofpancreaticcancer.nature2015，518(7540)：495-501.]。尽管如此，这些研究大多数集中在原发肿瘤或少数转移器官(肝和肺)发生的变化，缺乏胰腺癌引起的多器官或全身组学研究。鉴于胰腺癌早期诊断的困难，发明人推测早期胰腺癌引起的全身变化可能为胰腺癌的预防和治疗提供了有效的机会。

肿瘤生物标志物不仅限于在肿瘤发生和发展过程中由肿瘤本身合成和释放的物质，同时也包括机体对肿瘤做出反应产生的物质。因此，阐明胰腺癌发生发展过程中机体组织器官的变化可能为pdac的早期诊断提供有效的机会。ltb4是趋化性中性粒细胞分泌、花生四烯酸5-脂氧合酶(alox5)合成的脂质副产物。在支气管哮喘和过敏性鼻炎患者的血清中，ltb4浓度高于健康受试者。在癌症中，中性粒细胞来源的ltb4在肿瘤起始和转移过程中的关键作用。但是，并没有相关研究将血清ltb4用于肿瘤的早期诊断标志物，尤其是胰腺癌。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供ltb4蛋白在胰腺癌诊断中的应用。本发明首次提出利用血清ltb4蛋白的检测来达到早期检测胰腺癌的效果。ltb4具有成为良好的生物标记的潜在应用前景。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

第一方面，本发明涉及ltb4蛋白作为在样品中检测胰腺癌的试剂中的应用。

进一步的，前述试剂是用于识别ltb4蛋白抗原表位的抗体。

进一步的，所述试剂为检测早期胰腺癌的试剂。

第二方面，本发明涉及ltb4蛋白作为在制备预防或治疗胰腺癌的药物中的应用。

进一步的，前述药物是用于识别ltb4蛋白抗原表位的抗体。其能够在蛋白水平下调ltb4蛋白的表达或活性。

进一步的，前述药物是用于识别ltb4蛋白抗原表位的小分子抑制剂。其能够在蛋白水平下调ltb4蛋白的表达或活性。

进一步的，所述药物为预防或治疗早期胰腺癌的药物。

第三方面，本发明涉及ltb蛋白作为体外筛选和制备胰腺癌药物的药靶的应用。

进一步的，所述药物为早期胰腺癌药物。

第四方面，本发明涉及用于诊断胰腺癌的试剂盒，试剂盒中包括一容器，容器中含有ltb4抗体，即蛋白抗原表位的抗体。

进一步的，容器中含有ltb4抗体作为一抗。

第五方面，本发明涉及用于诊断胰腺癌的试剂盒，试剂盒中包括一容器，容器中含有ltb4特异性探针。

其中，ltb4蛋白可以采用各种常规的制备方法制备。如基因工程方法或者人工合成方法等。例如，可将ltb4核酸序列表达为蛋白而得。一旦获得了含有ltb4基因序列的重组表达质粒，就可将其转化到相应宿主中进行蛋白表达。本发明所述“ltb4蛋白”也包括如ltb4天然或诱导的遗传变异体。所述诱导变异体可以通过各种技术得到，如辐射或诱变剂等产生的随机突变，也可以通过如定点突变法或其他己知分子生物学的技术获得。所述“ltb4蛋白”还包括具有天然l型氨基酸的残基的类似物(如d型氨基酸)，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如氨基酸、y-氨基酸等)的类似物。

其中，ltb4的抗原表位(epitope)，又称为抗原决定簇，是抗原分子上的一个免疫活性区，负责与抗体分子或免疫细胞表面的抗原受体结合。本发明中所述的ltb4的抗原表位的抗体，是指任何现有技术中已知的ltb4抗体，也包括任何通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备得到的抗体。ltb4抗体可用于免疫组织化学技术中，检测活检标本中的ltb4蛋白，还可以作为用于预防胰腺癌的特异性治疗剂。抗体可以通过elisa、western印迹分析或者与检测基团偶联，通过化学发光、同位素示踪等方法来检测。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明通过实验发现，与正常小鼠对比，ltb4的水平在胰腺癌前病变和胰腺癌小鼠血清中均上调；进一步通过临床样本分析发现，与健康对照相比，慢性胰腺炎和导管内乳头状黏液性肿瘤患者的血清ltb4浓度略有增加，在胰腺癌患者中上升最为明显；iii-iv期胰腺癌患者的ltb4浓度明显高于i-ii期胰腺癌患者；同时，ltb4能够将胰腺癌患者与非恶性胰腺疾病(慢性胰腺炎和导管内乳头状黏液性肿瘤)和健康对照患者区分开来。这些结果说明ltb4是一个很有潜力的胰腺癌早期诊断标志物。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1为ltb4在胰腺癌小鼠和正常对照小鼠血清中表达水平的统计图；

图2为ltb4在胰腺癌前病变小鼠和正常对照小鼠血清中表达水平的统计图；

图3为ltb4在胰腺癌患者、慢性胰腺炎患者、导管内乳头状黏液性肿瘤患者和正常志愿者血清中表达水平的统计图；

图4为ltb4在不同分期胰腺癌患者血清中表达水平的统计图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干调整和改进。这些都属于本发明的保护范围。

下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料或生物制剂，均为可从市场上购得的常规试剂。以下实施例中的定量实验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例

1、胰腺癌小鼠血清ltb4的检测

1.1实验材料

ltb4的检测试剂盒购自美国r&dsystem公司，产品编号：kge006b。小鼠血清样本有两个队列。第一个队列包含20只胰腺癌小鼠血清样本和20只正常对照小鼠血清样本。第二个队列包含12只低负荷胰腺癌前病变小鼠血清样本、16只高负荷胰腺癌前病变小鼠血清样本和16只正常对照小鼠血清样本。

1.2实验步骤

1.2.1ltb4标准品的稀释和使用：在使用前半小时左右，取1ml样品稀释液加入标准品管内，盖好盖后静置10min以上，然后反复颠倒/搓揉以助其溶解，获得1000pg/ml的标准品液；配制500pg/ml～15.6pg/ml标准品：准备6只ep管，每管加入0.3ml样品稀释液，分别标记为：500pg/ml、250pg/ml、125pg/ml、62.5pg/ml、31.3pg/ml、15.6pg/ml，取0.3m11000pg/ml的标准品溶液加入标记500pg/ml的管中，混匀后梯度取出0.3ml，加入下一只ep管中，混匀，以此类推；

1.2.2ltb4生物素抗体工作液的准备：根据每孔需要50ul计算总的用量(实际配制时应多配制50-100ul)。按ltb4生物素抗体(100x)1ul加入抗体稀释液99ul配制工作液混匀。

1.2.3sa-hrp工作液的准备：根据每孔需要100ul计算总的用量(实际配制时应多配制100-200ul)。按sa-hrp(100x)1ul加sa-hrp稀释液99ul配制工作液混匀。

1.2。4具体实验步骤

1)根据待检测样品数量，计算好所需使用的板孔数量，增加1孔为tmb显色空白对照孔。总数＝样本数+7(标准品)+1(零值孔)。做复孔检测的数量x2.其余板条及时包装好放回冰箱密封干燥保存；

2)ltb4标准品，利用样品稀释液稀释出浓度梯度为：1000pg/ml、500pg/ml、125npg/ml、62.5pg/ml、31.3pg/ml、15.6pg/ml；

3)在第一排中依次加入标准品浓度梯度以及待检测样品，第一孔为零孔(样品稀释液)，50ul/孔(若样本浓度过高可利用样品稀释液稀释，计算时检测结果乘以稀释倍数)；

4)立即每孔加入配好的ltb4生物素化抗体工作液50ul(整个加样时间尽量控制在10min以内)；

5)利用封板膜封好，37℃反应45min；

6)甩去酶标板中的液体，每孔加洗涤液300ul，浸泡1-2分钟，吸去或甩掉酶标板内的液体，重复3次，最后一次利用吸水纸拍干；

7)每孔加入sa-hrp工作液100ul，加上封板膜，37℃温育30分钟；

8)甩去酶标板中的液体，重复步骤6，洗涤5次，最后一次利用吸水纸拍干；

9)按90ul/孔加入tmb显色液，37℃避光反应7-30min(根据实验室具体环境确认最佳显色时间，可初步根据标准品梯度颜色(蓝色)呈现线性梯度来判断)

10)按50ul/孔加入tmb终止液，孔内液体颜色由蓝色变为黄色；

11)用酶标仪在450nm光波处检测od值；

12)计算时，以标准品浓度梯度作为x轴，od值(减去空白孔值)作为y轴，制作标准曲线，计算出样品值(减去空白孔值)对应的浓度值。检测的方法参照制造商提供的标准方法。当ltb4的浓度小于15.6pg/ml(标准曲线的最低限值)时，该值设置为零。血清ltb4的测定由两名对每个受试者不知情的研究人员完成。

1.3结果验证

实验结果表明小鼠胰腺癌样品中的ltb4水平比正常对照小鼠高2倍(图1)。同时两个胰腺癌前病变队列中ltb4的水平值也高于正常对照中观察到的值(图2)。

2、胰腺癌患者血清ltb4的检测

2.1实验材料

ltb4的检测试剂盒购自美国r&dsystem公司，产品编号：kge006b。血清样本包含80例胰腺癌、36例慢性胰腺炎、31例导管内乳头状黏液性肿瘤和100位正常志愿者。

2.2实验步骤

2.2.1ltb4标准品的稀释和使用：在使用前半小时左右，取1ml样品稀释液加入标准品管内，盖好盖后静置10min以上，然后反复颠倒/搓揉以助其溶解，获得1000pg/ml的标准品液；配制500pg/ml～15.6pg/ml标准品：准备6只ep管，每管加入0.3ml样品稀释液，分别标记为：500pg/ml、250pg/ml、125pg/ml、62.5pg/ml、31.3pg/ml、15.6pg/ml，取0.3ml1000pg/ml的标准品溶液加入标记500pg/ml的管中，混匀后梯度取出0.3ml，加入下一只ep管中，混匀，以此类推；

2.2.2ltb4生物素抗体工作液的准备：根据每孔需要50ul计算总的用量(实际配制时应多配制50-100u1)。按ltb4生物素抗体(100x)1ul加入抗体稀释液99ul配制工作液混匀。

2.2.3sa-hrp工作液的准备：根据每孔需要100ul计算总的用量(实际配制时应多配制100-200u1)。按sa-hrp(100x)1ul加sa-hrp稀释液99ul配制工作液混匀。

2.2.4具体实验步骤

1)根据待检测样品数量，计算好所需使用的板孔数量，增加1孔为tmb显色空白对照孔。总数＝样本数+7(标准品)+1(零值孔)。做复孔检测的数量x2.其余板条及时包装好放回冰箱密封干燥保存；

2)ltb4标准品，利用样品稀释液稀释出浓度梯度为：1000pg/ml、500pg/ml、125npg/ml、62.5pg/ml、31.3pg/ml、15.6pg/ml；

3)在第一排中依次加入标准品浓度梯度以及待检测样品，第一孔为零孔(样品稀释液)，50ul/孔(若样本浓度过高可利用样品稀释液稀释，计算时检测结果乘以稀释倍数)；

4)立即每孔加入配好的ltb4生物素化抗体工作液50ul(整个加样时间尽量控制在10min以内)；

5)利用封板膜封好，37℃反应45min；

6)甩去酶标板中的液体，每孔加洗涤液300ul，浸泡1-2分钟，吸去或甩掉酶标板内的液体，重复3次，最后一次利用吸水纸拍干；

7)每孔加入sa-hrp工作液100ul，加上封板膜，37℃温育30分钟；

8)甩去酶标板中的液体，重复步骤6，洗涤5次，最后一次利用吸水纸拍干；

9)按90ul/孔加入tmb显色液，37℃避光反应7-30min(根据实验室具体环境确认最佳显色时间，可初步根据标准品梯度颜色(蓝色)呈现线性梯度来判断)

10)按50ul/孔加入tmb终止液，孔内液体颜色由蓝色变为黄色；

11)用酶标仪在450nm光波处检测od值；

12)计算时，以标准品浓度梯度作为x轴，od值(减去空白孔值)作为y轴，制作标准曲线，计算出样品值(减去空白孔值)对应的浓度值。检测的方法参照制造商提供的标准方法。当ltb4的浓度小于15.6pg/ml(标准曲线的最低限值)时，该值设置为零。血清ltb4的测定由两名对每个受试者不知情的研究人员完成。

2.3结果验证

实验结果表明胰腺癌患者ltb4的血清水平显着高于其他三组；与健康对照相比，慢性胰腺炎和导管内乳头状黏液性肿瘤患者的血清ltb4浓度也略有增加(图3)。iii-iv期胰腺癌患者的ltb4浓度明显高于i-ii期胰腺癌患者(图4)。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。