不同处理方法对葛染色体数目影响的研究方法

1.本发明涉及葛诱变技术领域，尤其涉及不同处理方法对葛染色体数目影响的研究方法。


背景技术：

2.葛[purearia thunbergiana benth.(p.hirsuta.schneid)]为豆科(leguminosae)葛属(puerariadc.)多年生落叶藤本植物，是重要的药食同源植物，在国内外种植广泛。“赣葛5号”(purearia thunbergiana benth cv.gan ge wu hao)为赣饲5号葛属，为周泽敏研究员利用葛的有利芽变，进行系统选育和定向培育，历时18年所育成。但由于其生长周期长、管理粗放等原因，大多数葛属资源的开发及利用尚处在较原始的状态，得不到有效的利用，其产量与品质远远不能满足社会发展的需求。目前，对葛的研究主要集中在对其有效成分及药用价值的分析上，而在诱变育种方面的研究较少，更不清楚不同诱变剂对葛染色体数目的影响。


技术实现要素：

[0003]
针对上述存在的问题，本发明旨在提供不同处理方法对葛染色体数目影响的研究方法，通过研究葛在不同浓度ems诱变剂及秋水仙素的处理下，对葛根染色体数目的影响，为葛的诱变育种和优良选育及开发利用奠定理论基础。
[0004]
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：
[0005]
不同处理方法对葛染色体数目影响的研究方法，其特征在于，包括以下步骤，
[0006]
s1：分别使用ems诱变剂、秋水仙素和ems诱变剂+秋水仙素对葛芽进行诱变处理；
[0007]
s2：田间种植不同诱变处理后的葛芽；
[0008]
s3：分别取不同诱变处理后的葛芽所长出的葛根尖，进行制片，确定染色体数目；
[0009]
s4：对不同诱变处理后的葛芽所长出的葛中的染色体数目进行对比分析。
[0010]
进一步的，步骤s1中分别使用浓度为0.6％、1.2％和1.8％的ems诱变剂对葛芽进行诱变处理。
[0011]
进一步的，步骤s1中分别使用浓度为100mg/l、200mg/l和400mg/l的秋水仙素对葛芽进行诱变处理。
[0012]
进一步的，步骤s1中ems诱变剂+秋水仙素对葛芽进行诱变处理的具体操作为：先用浓度为1.2％的ems诱变剂浸泡葛芽8h，取出后用清水冲洗干净，再用400mg/l秋水仙素溶液浸泡3小时。
[0013]
进一步的，步骤s3中制片的具体操作包括以下步骤，
[0014]
s301：使用预处理液对葛根尖进行预处理；
[0015]
s302：用蒸馏水漂洗预处理后的葛根尖，然后将葛根尖置于卡诺固定液中进行固定；
[0016]
s303：将固定后的葛根尖用蒸馏水进行漂洗，置于60℃的水浴恒温锅内，用1n盐酸
进行解离；
[0017]
s304：将解离后的葛根尖用蒸馏水洗净，放入45％的冰醋酸中软化；软化后的葛根尖再用蒸馏水冲洗干净，切取根尖生长点部分，置于载玻片中央，滤纸吸去多余液体，用改良苯酚品红染色液染色；
[0018]
s305：采用常规压片法进行制片。
[0019]
进一步的，步骤s3中确定染色体数目的具体操作包括以下步骤，
[0020]
s306：将步骤s305中制好的切片放于显微镜上进行观察，拍照；
[0021]
s307：观察切片中具有代表性的分散良好的细胞中期染色体，统计30个细胞的染色体数目，取其平均数，以确定染色体的数目。
[0022]
进一步的，步骤s301中所述的预处理液为0.1％秋水仙素和0.005mol/l8-羟基喹啉溶液等体积混合溶液。
[0023]
进一步的，步骤s303中解离的时间为4min。
[0024]
本发明的有益效果是：
[0025]
1、本发明通过研究葛在不同浓度ems诱变剂及秋水仙素的处理下，对葛根染色体数目的影响，为葛的诱变育种和优良选育及开发利用奠定理论基础。
[0026]
2、本发明通过不同诱变剂对葛染色体数目影响的研究，能够得出以下结论：葛芽经秋水仙素或者ems诱导后，染色体数目发生了变化，变化范围为35.33～39.00，但完全加倍的未见，出现了二倍体与四倍体的混倍体；而采用秋水仙素及ems诱变剂对葛芽进行处理，葛芽染色体数目的变化结果与单独施用其中一种诱变剂的结果相一致，但是混合处理效果反而没单独施用好。
[0027]
3、通过本发明中的研究可以得出，用0.1％秋水仙素0.005mol/l8-羟基喹啉溶液等体积混合溶液作预处理液处理葛芽，细胞分裂中期相最多，效果最好。
附图说明
[0028]
图1为本发明实施例一中葛根染色体图片。
具体实施方式
[0029]
为了使本领域的普通技术人员能更好的理解本发明的技术方案，下面结合附图和实施例对本发明的技术方案做进一步的描述。
[0030]
实施例一：
[0031]
不同处理方法对葛染色体数目影响的研究方法，包括以下步骤，
[0032]
s1：分别使用ems诱变剂、秋水仙素和ems诱变剂+秋水仙素对葛芽进行诱变处理；
[0033]
具体的，本实施例中采用江西农业大学育成的赣葛5号(pueraria thomsoniibenth)为试验材料，采自江西省南昌市黄马乡蚕茶研究所江西农业大学教学科研基地。
[0034]
对葛芽进行诱变处理的具体操作包括：分别使用浓度为0.6％、1.2％和1.8％的ems诱变剂对葛芽进行诱变处理；
[0035]
分别使用浓度为100mg/l、200mg/l和400mg/l的秋水仙素对葛芽进行诱变处理8h；
[0036]
以及先用浓度为1.2％的ems诱变剂浸泡葛芽8h，取出后用清水冲洗干净，再用
400mg/l秋水仙素溶液浸泡3小时。
[0037]
s2：田间种植不同诱变处理后的葛芽；
[0038]
具体的，田间种植试验地位于江西省南昌市黄马乡蚕茶研究所，属于亚热带季风湿润气候，平均年气温为17℃，夏季高温多雨，冬季低温少雨，平均年降水量为700mm～1500mm，霜少无雪。土壤为红壤，肥力中等。
[0039]
采用单因素随机区组试验设计方法，于2016年5月4日进行。田间种植行宽为1.5米，列宽2米，共9列。其中第1、2、3列为用1.2％ems+400mg/l秋水仙素处理后的葛芽所长出的葛；第4列为用100mg/l秋水仙素进行处理的；第5列为用200mg/l秋水仙素进行处理的；第6列为用400mg/l秋水仙素进行处理的；第7列为用0.6％ems进行处理的；第8列为用1.2％ems进行处理的；第9列为用1.8％ems进行处理的。
[0040]
s3：分别取不同诱变处理后的葛芽所长出的葛根尖，进行制片，确定染色体数目；
[0041]
具体的，s301：使用预处理液对葛根尖进行预处理；所述预处理液为0.1％秋水仙素和0.005mol/l8-羟基喹啉溶液等体积混合溶液；
[0042]
s302：用蒸馏水漂洗2-3次预处理后的葛根尖，然后将葛根尖置于卡诺固定液中进行固定30分钟；
[0043]
s303：将固定后的葛根尖用蒸馏水进行漂洗2-3次，置于60℃的水浴恒温锅内，用1n盐酸进行解离4min；
[0044]
s304：将解离后的葛根尖用蒸馏水洗净，放入45％的冰醋酸中软化15min；软化后的葛根尖再用蒸馏水冲洗3-4次，切取根尖生长点部分，置于载玻片中央，滤纸吸去多余液体，用改良苯酚品红染色液染色30min；
[0045]
s305：采用常规压片法进行制片；用刀片将材料切碎，盖上盖玻片，用铅笔轻轻敲打盖玻片，以使细胞分散，在制片过程中，不能让盖玻片移动。后用大拇指进行压片。
[0046]
s306：将步骤s305中制好的切片放于显微镜上进行观察，拍照；
[0047]
s307：观察切片中具有代表性的分散良好的细胞中期染色体，统计30个细胞的染色体数目，取其平均数，以确定染色体的数目。
[0048]
s4：对不同诱变处理后的葛芽所长出的葛中的染色体数目进行对比分析。不同诱变处理后的葛芽所长出的葛中的染色体数目统计结果如下表1所示，葛根染色体图片如附图1所示。
[0049]
表1不同处理对葛根染色体数目的影响
[0050][0051]
范淑英等对江西野葛进行核型分析发现野葛染色体数目为2n＝22。从表1可以看出，本技术中不同处理对葛根染色体数目没有显著性影响(p》0.05)，各处理间均不同程度地增加了葛根染色体数目。但完全加倍的未见。不同浓度的秋水仙素对其葛芽进行处理，染色体数目变化范围为35.33～39.00；不同浓度的ems诱变剂对其葛芽进行处理，染色体数目变化范围为35.33～39.00；混合处理的染色体数目为37.33。表明用秋水仙素及ems诱变剂对葛芽进行处理，对其染色体数目的变化结果相一致，混合处理效果反而没单独施用好。
[0052]
对比例一：
[0053]
对比例一的步骤s301中采用0.1％秋水仙素作为预处理液对葛根尖进行预处理，对比分析不同预处理液对葛根尖进行预处理后的制片效果。
[0054]
对比例二：
[0055]
对比例二的步骤s301中采用0.005mol/l8-羟基喹啉溶液作为预处理液对葛根尖进行预处理，对比分析不同预处理液对葛根尖进行预处理后的制片效果。
[0056]
对比分析实施例一与对比例一、对比例二中葛根尖预处理后制得的切片，结果如下表2所示。从表2中可以看出，用不同预处理液处理葛根尖，细胞分裂效果不同。用0.1％秋水仙素作为预处理液，观察发现中期细胞较少，且分散效果呈团状，分辨较模糊。用0.005mol/l8-羟基喹啉作为预处理液与0.1％秋水仙素的效果一样，不太理想。用0.1％秋水仙素和0.005mol/l8-羟基喹啉溶液等体积混合溶液处理葛芽，中期细胞较多，且分较好，分辨程度高。表明用0.1％秋水仙素和0.005mol/l8-羟基喹啉溶液等体积混合溶液处理葛芽，效果最好。
[0057]
表2不同预处理液的效果比较结果
[0058]
[0059]
对比例三：
[0060]
对比例三中对步骤s303中解离时间进行优化对比，将固定后的葛根尖用蒸馏水进行漂洗2-3次，置于60℃的水浴恒温锅内，用1n盐酸分别进行解离2min、3min、4min、5min、6min、7min、8min、9min、10min，对比分析不同解离时间后的切片效果，结果如表3所示。
[0061]
表3不同解离时间的效果比较
[0062][0063]
从表3中可以看出，将葛根根尖置于1n盐酸中进行水浴解离，解离时间不同效果不同。当解离时间为3min，4min，5min的时候，中期细胞较多，其他时间中期细胞少。当解离时间为3min，5min的时候，分散效果较好，解离时间为4min的时候，分散效果好，其他时间分散呈团状甚至过于分散。当解离时间为4min的时候，分辨程度高，其他时间分辨模糊。表明，当水浴解离时间为4min，中期细胞较多，分散效果好，分辨程度高，效果最好。
[0064]
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。