一种胶体金麦角甾醇检测卡及其应用的制作方法

1.本发明涉及胶体金检测卡的技术领域，具体涉及一种胶体金麦角甾醇检测卡及其应用。


背景技术：

2.麦角固醇的定量检测方法目前已得到广泛研究，多见于高效液相色谱(high performance liquidchromatography，hplc)、气相色谱法以及各种联用技术等精确定量方法。但是上述的检测方法均需要配备昂贵的大型仪器和大量辅助实验设备外，前处理方法过于繁杂耗时，使用成本高昂，对于市场即时得到结果的要求无法满足。


技术实现要素：

3.为了克服现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种胶体金麦角甾醇检测卡，能用于对样品麦角甾醇中的定性分析，实验时间短，适用于现场检测；本发明的目的之二在于提供一种胶体金麦角甾醇检测卡的应用，该检测卡能用于检测茶叶样品中是否含有麦角甾醇，从而验证茶叶的品质。
4.本发明的目的之一采用如下技术方案实现：
5.一种胶体金麦角甾醇检测卡，包括底板、样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫；样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫依次设置在底板表面；胶体金结合垫含有胶体金标记的麦角甾醇抗体；硝酸纤维素膜上包被有麦角甾醇抗原-载体蛋白复合物的检测线以及包被有羊抗兔igg的质控线。
6.进一步，所述胶体金结合垫中填充有胶体金溶液，胶体金溶液为分散相粒子直径为1～150nm的金颗粒悬浮液。
7.具体地，所述胶体金结合垫的制备方法包括以下步骤：
8.1)调节胶体金溶液的ph值为7，再加入麦角甾醇抗体，混匀后，静置后进行离心，得到沉淀，即为胶体金标记的麦角甾醇抗体；
9.2)将玻璃纤维纸浸泡在金标垫处理液中，取出并烘干；
10.3)往步骤1)的胶体金标记的麦角甾醇抗体中加入溶剂稀释，得到溶液；再放入经过步骤2)处理的玻璃纤维纸，浸泡后取出晾干备用，得到胶体金结合垫。
11.进一步，所述金标垫处理液包括以下按重量百分比计的原料：0.5～1％山羊血清、0.5～1％小牛血清白蛋白、1～2％吐温20和1～2％海藻糖，余量为磷酸盐缓冲液。
12.再进一步，所述胶体金溶液的制备方法，包括以下步骤：
13.1)加入300ml水置于锥形瓶中，加入5～10ml质量浓度为1～2％氯金酸溶液，加热至沸腾，在持续高温和搅拌下加入8～10ml质量浓度为1～2％柠檬酸三钠溶液，继续匀速搅拌加热至溶液呈透亮的红色时停止，冷却至室温后再加入水恢复到原体积，得到胶体金溶液。
14.具体地，所述样品垫的制备方法，包括以下步骤：将底膜浸泡在样品垫处理液中，
取出后烘干，得到样品垫。
15.再进一步，所述样品垫处理液包括以下按重量百分比计的原料：1～2％蔗糖、1～2％吐温20、0.5～1％聚乙烯吡咯烷酮和1～2％聚乙二醇，余量为磷酸盐缓冲液。
16.进一步，所述麦角甾醇抗原的浓度为5.3mg/ml；所述羊抗兔igg的浓度为7.5mg/ml。
17.本发明的目的之二采用如下技术方案实现：
18.上述的胶体金麦角甾醇检测卡的应用，所述胶体金麦角甾醇检测卡用于检测茶叶样品中的麦角甾醇。
19.进一步，所述茶叶样品经过样本提取液处理后，将样本提取液滴入所述检测卡的样品垫；其中，样本提取液包括0.01m磷酸盐缓冲液和2～3％乙醇。
20.相比现有技术，本发明的有益效果在于：
21.(1)本发明的检测卡采用竞争免疫层析法来定性分析样品中是否存在麦角甾醇残留，检出限是0.1mg/kg。不需要贵重或大型的检测分析仪器，本发明的检测卡分析成本较低，检测结果正确率高、适用于现场快速检测。
22.(2)本发明的检测卡的具体工作原理为：检测时，待测样品滴加到加样孔中，在毛细管力作用下向前流动，与结合垫处的金标抗体相结合形成麦角甾醇抗原-金标抗体免疫复合物继续向前流动，当到达t线时，未反应完全的标记抗体与t线处的包被抗原进行结合形成标记物抗体-抗原复合物而显色，当样品中待检抗原浓度越高时，其结合的标记抗体越多，t线处捕获的标记抗体越少进而显色强度越弱，反之，当待测样品中的麦角甾醇药物减少时，标记抗体被t线处的抗原所捕获，t线显色强度增强。当待检液继续前移，标记物抗体-抗原复合物或未结合游离的标记抗体，与质控线(即c线)上的抗体结合，质控线显色。
附图说明
23.图1为检测卡的结构示意图；
24.图中：1、底板；2、吸水垫；3、硝酸纤维素膜；4、质控线；5、检测线；6、胶体金结合垫；7、样品垫。
具体实施方式
25.下面，结合附图以及具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。
26.实施例1
27.如图1所示，本实施例提供一种胶体金麦角甾醇检测卡，包括底板1、样品垫7、胶体金结合垫6、硝酸纤维素膜3和吸水垫2；样品垫7、胶体金结合垫6、硝酸纤维素膜3和吸水垫2依次设置在底板1表面；胶体金结合垫6含有胶体金标记的麦角甾醇抗体；硝酸纤维素膜3上包被有麦角甾醇抗原-载体蛋白复合物的检测线5以及包被有羊抗兔igg的质控线4。其中，麦角甾醇抗原浓度是5.3mg/ml；麦角甾醇抗体浓度是8.1mg/ml，羊抗兔igg浓度为7.5mg/ml，均购自江南大学。
28.检测结果判定：
29.若检测线5和质控线4均显色，检测结果判定为阴性，表明样本中不含有麦角甾醇或麦角甾醇含量低于检测限(0.1mg/kg)；
30.若检测线5不显色而质控线4显色，检测结果判定为阳性，表明样本中麦角甾醇含量等于或高于检测限(0.1mg/kg)；
31.若质控线4不显色，则表示检测结果无效，表明不正确的操作或检测卡已过期失效，需要重新检测。
32.具体地，所述胶体金结合垫6的制备方法包括以下步骤：
33.1)调节胶体金溶液的ph值为7，再加入麦角甾醇抗体，混匀后，静置后进行离心，得到沉淀，即为胶体金标记的麦角甾醇抗体；
34.2)将玻璃纤维8965浸泡在金标垫处理液中，取出并烘干；
35.3)往步骤1)的胶体金标记的麦角甾醇抗体中加入溶剂稀释，得到溶液；再放入经过步骤2)处理的玻璃纤维8965，浸泡5min后取出晾干备用，得到胶体金结合垫6。
36.其中，所述金标垫处理液包括以下按重量百分比计的原料：0.5％山羊血清、0.5％小牛血清白蛋白、1％吐温20和1.5％海藻糖，余量为0.02m磷酸盐缓冲液。所述磷酸盐缓冲液包括以下按质量浓度计的原料：磷酸氢二钠2.58g/l、磷酸二氢钠0.44g/l和氯化钠8.5g/l，余量为水。
37.所述胶体金溶液的制备方法，包括以下步骤：
38.加入300ml水置于锥形瓶中，加入6ml质量浓度为1％氯金酸溶液，用恒温电磁搅拌器加热至沸腾，在持续高温和搅拌下加入9.6ml质量浓度为1％柠檬酸三钠溶液，继续匀速搅拌加热至溶液呈透亮的红色时停止，冷却至室温后再加入水恢复到原体积，得到胶体金溶液。其中，胶体金溶液是指分散相粒子直径在l～150nm之间的金溶胶，颜色呈桔红色到紫红色，是金盐被还原成金单质后形成的稳定、均匀、呈单一分散状态悬浮在液体中的金颗粒悬浮液。
39.具体地，所述样品垫7的制备方法，包括以下步骤：将底膜浸泡在样品垫7处理液中5min，取出后烘干，得到样品垫7。所述样品垫7处理液包括以下按重量百分比计的原料：1％蔗糖、1％吐温20、0.7％聚乙烯吡咯烷酮和1.5％聚乙二醇，余量为0.1m磷酸盐缓冲液。底膜为玻璃纤维。
40.上述胶体金麦角甾醇检测卡用于检测茶叶样品中的麦角甾醇。所述茶叶样品经过样本提取液处理后，将样本提取液滴入所述检测卡的样品垫7；其中，样本提取液包括0.01m磷酸盐缓冲液和3％乙醇。
41.实施例2
42.如图1所示，本实施例提供一种胶体金麦角甾醇检测卡，包括底板1、样品垫7、胶体金结合垫6、硝酸纤维素膜3和吸水垫2；样品垫7、胶体金结合垫6、硝酸纤维素膜3和吸水垫2依次设置在底板1表面；胶体金结合垫6含有胶体金标记的麦角甾醇抗体；硝酸纤维素膜3上包被有麦角甾醇抗原-载体蛋白复合物的检测线5以及包被有羊抗兔igg的质控线4。其中，麦角甾醇抗原浓度是5.3mg/ml；麦角甾醇抗体浓度是8.1mg/ml，羊抗兔igg浓度为7.5mg/ml，均购自江南大学。
43.检测结果判定：
44.若检测线5和质控线4均显色，检测结果判定为阴性，表明样本中不含有麦角甾醇
或麦角甾醇含量低于检测限(0.1mg/kg)；
45.若检测线5不显色而质控线4显色，检测结果判定为阳性，表明样本中麦角甾醇含量等于或高于检测限(0.1mg/kg)；
46.若质控线4不显色，则表示检测结果无效，表明不正确的操作或检测卡已过期失效，需要重新检测。
47.具体地，所述胶体金结合垫6的制备方法包括以下步骤：
48.1)调节胶体金溶液的ph值为7，再加入麦角甾醇抗体，混匀后，静置后进行离心，得到沉淀，即为胶体金标记的麦角甾醇抗体；
49.2)将玻璃纤维8965浸泡在金标垫处理液中5min，取出并烘干；
50.3)往步骤1)的胶体金标记的麦角甾醇抗体中加入溶剂稀释，得到溶液；再放入经过步骤2)处理的玻璃纤维8965，浸泡5min后取出晾干备用，得到胶体金结合垫6。
51.其中，所述金标垫处理液包括以下按重量百分比计的原料：0.5％山羊血清、0.5％小牛血清白蛋白、1％吐温20和1％海藻糖，余量为0.02m磷酸盐缓冲液。所述磷酸盐缓冲液包括以下按质量浓度计的原料：2g/l磷酸氢二钾、0.4g/l磷酸二氢钠和8g/l的氢氧化钠，余量为水。
52.所述胶体金溶液的制备方法，包括以下步骤：
53.加入300ml水置于锥形瓶中，加入5～10ml质量浓度为1～2％氯金酸溶液，加热至沸腾，在持续高温和搅拌下加入8～10ml质量浓度为1～2％柠檬酸三钠溶液，继续匀速搅拌加热至溶液呈透亮的红色时停止，冷却至室温后再加入水恢复到原体积，得到胶体金溶液。其中，胶体金溶液是指分散相粒子直径在l—150nm之间的金溶胶，颜色呈桔红色到紫红色，是金盐被还原成金单质后形成的稳定、均匀、呈单一分散状态悬浮在液体中的金颗粒悬浮液。
54.具体地，所述样品垫7的制备方法，包括以下步骤：将底膜浸泡在样品垫7处理液中，取出后烘干，得到样品垫7。所述样品垫7处理液包括以下按重量百分比计的原料：1％蔗糖、1％吐温20、0.5％聚乙烯吡咯烷酮和1％聚乙二醇，余量为0.1m磷酸盐缓冲液。底膜为聚酯膜。
55.上述胶体金麦角甾醇检测卡用于检测茶叶样品中的麦角甾醇。所述茶叶样品经过样本提取液处理后，将样本提取液滴入所述检测卡的样品垫7；其中，样本提取液包括0.01m磷酸盐缓冲液和2.5％乙醇。
56.实施例3
57.如图1所示，本实施例提供一种胶体金麦角甾醇检测卡，包括底板1、样品垫7、胶体金结合垫6、硝酸纤维素膜3和吸水垫2；样品垫7、胶体金结合垫6、硝酸纤维素膜3和吸水垫2依次设置在底板1表面；胶体金结合垫6含有胶体金标记的麦角甾醇抗体；硝酸纤维素膜3上包被有麦角甾醇抗原-载体蛋白复合物的检测线5以及包被有羊抗兔igg的质控线4。其中，麦角甾醇抗原浓度是5.3mg/ml；麦角甾醇抗体浓度是8.1mg/ml，均购自江南大学。羊抗兔igg浓度为7mg/ml。
58.检测结果判定：
59.若检测线5和质控线4均显色，检测结果判定为阴性，表明样本中不含有麦角甾醇或麦角甾醇含量低于检测限(0.1mg/kg)；
60.若检测线5不显色而质控线4显色，检测结果判定为阳性，表明样本中麦角甾醇含量等于或高于检测限(0.1mg/kg)；
61.若质控线4不显色，则表示检测结果无效，表明不正确的操作或检测卡已过期失效，需要重新检测。
62.具体地，所述胶体金结合垫6的制备方法包括以下步骤：
63.1)调节胶体金溶液的ph值为7，再加入麦角甾醇抗体，混匀后，静置后进行离心，得到沉淀，即为胶体金标记的麦角甾醇抗体；
64.2)将玻璃纤维8965浸泡在金标垫处理液中，取出并烘干；
65.3)往步骤1)的胶体金标记的麦角甾醇抗体中加入溶剂稀释，得到溶液；再放入经过步骤2)处理的玻璃纤维8965，浸泡5min后取出晾干备用，得到胶体金结合垫6。
66.其中，所述金标垫处理液包括以下按重量百分比计的原料：1％山羊血清、1％小牛血清白蛋白、2％吐温20和2％海藻糖，余量为0.02m磷酸盐缓冲液。所述磷酸盐缓冲液包括以下按质量浓度计的原料：3g/l磷酸氢二钾、0.5g/l磷酸二氢钠和9g/l的氢氧化钠，余量为水。
67.所述胶体金溶液的制备方法，包括以下步骤：
68.加入300ml水置于锥形瓶中，加入10ml质量浓度为2％氯金酸溶液，加热至沸腾，在持续高温和搅拌下加入10ml质量浓度为2％柠檬酸三钠溶液，继续匀速搅拌加热至溶液呈透亮的红色时停止，冷却至室温后再加入水恢复到原体积，得到胶体金溶液。其中，胶体金溶液是指分散相粒子直径在l～150nm之间的金溶胶，颜色呈桔红色到紫红色，是金盐被还原成金单质后形成的稳定、均匀、呈单一分散状态悬浮在液体中的金颗粒悬浮液。
69.具体地，所述样品垫7的制备方法，包括以下步骤：将底膜浸泡在样品垫7处理液中5min，取出后烘干，得到样品垫7。所述样品垫7处理液包括以下按重量百分比计的原料：2％蔗糖、2％吐温20、1％聚乙烯吡咯烷酮和2％聚乙二醇，余量为0.1m磷酸盐缓冲液。底膜为聚酯膜。
70.上述胶体金麦角甾醇检测卡用于检测茶叶样品中的麦角甾醇。所述茶叶样品经过样本提取液处理后，将样本提取液滴入所述检测卡的样品垫7；其中，样本提取液包括0.01m磷酸盐缓冲液和3％乙醇。
71.上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。