蛋白C和活化蛋白C的测量方法与流程

本发明涉及医学领域，具体涉及利用基于质谱的方法测量生物标志物的领域。更具体地，本发明涉及使用与蛋白c、优选活化蛋白c相关的特定肽来测量/定量这些蛋白的基于质谱的方法。

背景技术：

1、在脓毒症和脓毒性休克的第三次国际共识定义(sepsis-3)中，脓毒症被定义为当身体对感染的反应损害其自身组织时出现的危及生命的器官功能障碍(总sofa评分≥2分，假设在不知道先前已患有器官功能障碍的患者中基线sofa为零)。脓毒性休克被定义为脓毒症的一个亚型，脓毒性休克中影响深刻的循环、细胞和代谢异常与相比于单纯脓毒症的死亡风险增加相关。然而，尽管在疫苗、抗生素和重症监护病房(icu)的急性护理方面取得了进步，脓毒症影响着多达4900万人，仍然是因感染而死亡的主要原因，全世界每年有超过1100万人死亡，并且也是icu中最常见的死亡原因。

2、弥散性血管内凝血(dic)是一种获得性临床生物综合征，其特征是凝血广泛激活，导致血管系统中纤维蛋白沉积、器官功能障碍、凝血因子和血小板消耗以及危及生命的出血。

3、蛋白c缺乏症(proc缺乏症)是一种罕见的遗传性疾病，其特征是缺乏蛋白c，因此受这种罕见疾病影响的对象有形成血块的风险，特别是一类称为深静脉血栓形成的血块。虽然非常罕见，但有一种重症形式在出生时就存在(先天性)，其可能会导致体内广泛出现小血块，并在婴儿期出现危及生命的并发症。蛋白c水平检测不到的患者通常在出生后数小时至数天内表现出疾病，伴有暴发性紫癜或大量静脉血栓形成。

4、蛋白c(proc)具有抗血栓形成、抗炎和纤维蛋白原溶解(profibrinolytic)特性，可在限制对败血症的严重全身反应的有害影响方面发挥作用。已在脓毒症诱发的dic实验模型和脓毒症患者中对proc抗凝途径在dic发病机制中的作用进行了研究。脓毒症患者经常出现蛋白c缺乏，这主要是由于消耗增加、肝脏合成受损和血管渗漏所致。

5、活化蛋白c(activated protein c，apc)是一种56kda的血液维生素k-丝氨酸蛋白酶，是蛋白c(proc)上arg169-leu170肽键裂解，从重链中释放出十二肽(残基158-169)而产生的。apc具有抗凝、细胞保护、抗炎和细胞信号传导活性。在最近指定的apc的作用中，众所周知的是，apc作为凝血酶生成的主要调节剂的作用，以及它通过蛋白水解降解纤维蛋白凝块形成所必需的促凝活化辅因子来控制血液凝固的作用。此外，apc在多种自身免疫性疾病临床前模型中已被证明有助于适应性免疫反应。

6、多项研究证明了apc的治疗用途，因此市场上出现了使用重组人apc(rhapc)的治疗。脓毒症引起的dic中后天性apc缺乏与脓毒症患者的高凝状态和死亡率增加有关。已证明，apc治疗降低了重症脓毒症患者的28天死亡率，包括回顾性分配至脓毒症相关dic亚组的患者。然而，apc治疗对其他患者组没有任何积极作用，这表明只有患有dic的脓毒症患者才会受益于使用apc治疗(即xigris或其他重组apc)。还发现，apc治疗增加了脓毒症患者的出血风险，这凸显了在治疗前和治疗期间测量患者proc和/或apc水平的重要性。

7、因此，rhapc(drotrecogin alpha，drotaa)，特别是(礼来公司(eli lillyinc.))被制造商从市场上撤出，并努力提高apc治疗多种疾病的治疗潜力和安全性。为了降低出血风险，天然apc结构被突变：3个赖氨酸被丙氨酸(k191a、k192a、k193a)取代，消除了＞90％的抗凝活性，同时保留了多种细胞信号传导活性。这种apc形式被命名为3k3a-apc。因此，zz biotech的3k3a-apc(http://zzbiotech.com/the-company/3k3a-activated-protein-c)是自然存在的apc的基因工程变体，在调节血液凝固和炎症中发挥作用。apc具有细胞保护、抗炎和抗凝特性；3k3a-apc具有降低的抗凝能力，从而使未经修饰的apc引起的出血风险最小化。在中风、肌萎缩侧索硬化症(als)、神经外伤和脓毒症的动物模型中，3k3a-apc疗法在增强疗效和降低出血风险方面优于重组apc。3k3a-apc对大脑血管内壁的保护作用进一步有助于防止组织纤溶酶原激活剂(tpa)有时引起的出血，tpa是目前唯一被指明用于治疗急性缺血性中风的药物，并且最近被提议用于2019冠状病毒病的严重疾病患者。

8、先前对重组天然或突变人apc的治疗应用的研究强化了需要用于测量内源性和外源性人proc或/和apc以及诊断和治疗环境的检测和监测方法的想法。本发明描述了测量从人对象获得的血液中的循环proc和apc的方法，血液包括在三级医院的重症监护病房收治的患者(包括患有脓毒症和脓毒性休克以及脑血管意外如中风的严重受影响的患者)的血浆。本文描述的方法基于多反应监测靶向质谱(mrm-ms)和特异性(加标标记的)蛋白特征性肽的使用，从而获得了高度灵敏且特异性的方法。

技术实现思路

1、在第一方面，本发明涉及一种用于筛查或分类有患脓毒症或脓毒性休克的风险的对象的基于质谱的方法，该方法包括以下步骤：

2、i)通过执行包括以下步骤的方法来测量蛋白c(proc)的水平：对从对象分离的一个或多个生物样本进行酶促消化的步骤；和通过使用质谱仪测量seq id no：1(lgeydlr)的肽的水平的步骤，其中seq id no：1(lgeydlr)的水平对应于所述一个或多个生物样本中存在的proc的水平，以及

3、ii)将步骤i)中获得的水平与参考值进行比较，

4、其中参考值为1431.57ng/ml，并且其中至少40％的降低表明有患脓毒症或脓毒性休克的风险。优选地，该方法进一步包括临床确认患者患有脓毒症或脓毒性休克的步骤。

5、在其他方面，本发明涉及一种用于筛查或分类有患弥散性血管内凝血(dic)的风险的对象的基于质谱的方法，其中，该对象已被诊断患有脓毒症或脓毒性休克，该方法包括以下步骤：

6、i)通过执行包括以下步骤的方法来测量蛋白c(proc)的水平：对从对象分离的一个或多个生物样本进行酶促消化的步骤；和通过使用质谱仪测量seq id no：1(lgeydlr)的肽的水平的步骤，其中seq id no：1(lgeydlr)的水平对应于所述一个或多个生物样本中存在的proc的水平，以及

7、ii)将步骤i)中获得的水平与参考值进行比较，

8、其中所述参考值为600ng/ml，并且其中至少20％的降低表明所述对象有患dic的风险。优选地，该方法进一步包括临床确认患者患有弥散性血管内凝血的步骤。

9、优选地，用于酶促消化的酶是胰蛋白酶和/或argc，或在消化后产生seq id no：1的lgeydlr肽的蛋白酶的任何组合。优选地，通过加标带标记的seq id no：1(lgeydlr)的蛋白特征性肽(proteotypic peptide)来进行seq id no：1(lgeydlr)的肽的测量。优选地，加标的带标记的seq id no：1(lgeydlr)的蛋白特征性肽是用至少一个或多个重氨基酸合成的，并且其中优选在c端氨基酸残基中用标签对所述肽进行标记。优选地，该方法还包括用还原剂还原一个或多个生物样本的步骤，以及用烷化剂将一个或多个生物样本烷基化的步骤，其中还原步骤和烷基化步骤都在酶促消化步骤之前进行。

10、优选地，一个或多个生物样本选自由血液、血清、血浆、唾液、尿液或脑脊液组成的组。

11、另一方面，本发明涉及一种用于预后有需要的对象对重组蛋白c(proc)、优选重组活化蛋白c(apc)治疗的反应的基于质谱的方法，该方法包括以下步骤：

12、i)通过执行根据前述方面中任一项所述的方法的每个步骤来筛查对象是否有患弥散性血管内凝血(dic)的风险；

13、ii)如果该对象被鉴定为有患dic的风险或被诊断患有dic，则将该对象分类为对所述治疗的有反应者，如果该对象没有被鉴定为有患dic的风险或没有被诊断为患有dic，则将该对象分类为对所述治疗的无反应者。

14、优选地，预后在用重组蛋白c(rproc)、优选重组活化蛋白c治疗对象之前进行。

15、在进一步的方面，本发明涉及一种包含重组蛋白c(rproc)、优选重组活化蛋白c(rapc)的组合物，用于治疗脓毒症、脓毒性休克或中风，其中该用途包括向根据前述方面中的被分类为有反应者的对象施用所述组合物的步骤。

16、在进一步的方面，本发明涉及seq id no：1(lgeydlr)的肽在从有需要的对象分离的一个或多个生物样本中的水平作为用于筛查有患脓毒症或脓毒性休克的风险的对象的生物标志物或作为用于筛查有患弥散性血管内凝血的风险的对象的生物标志物的体外用途。

17、在进一步的方面，本发明涉及seq id no：1(lgeydlr)的肽在从有需要的对象分离的一个或多个生物样本中的水平作为用于预后患有脓毒症或脓毒性休克和弥散性血管内凝血(dic)的对象对重组proc、优选重组apc治疗的反应的生物标志物的体外用途。