一种清热健胃散中12种活性成分和2种非法添加物同时测定方法与流程

本发明涉及属于兽药中有效成分检测领域，具体涉及一种清热健胃散中12种活性成分和2种非法添加物的同时测定方法。

背景技术：

1、公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

2、清热健胃散为中兽药成方制剂，收载于2020版中华人民共和国兽药典二部：清热健胃散质量标准。在清热健胃散质量标准中，对山楂、黄柏、大黄、麦芽、陈皮、厚朴、知母进行显微鉴别；对大黄进行薄层鉴别，无含量测定项；对大黄的薄层鉴别，前处理操作起来非常繁琐。此国家标准对非法添加物的检测方法暂时没有。

3、进一步的，清热健胃散质量标准中，对大黄采用的薄层色谱检测方法中，薄层色谱检测前期准备复杂，需要展开晾干、检视查看结果等多个步骤，费时费力；检测结果的荧光斑点受环境温湿度、人为操作、边缘效应等因素的干扰比较大，斑点常常不清晰，结果不易判定，重现性差；而且整个检测过程费时、费试剂，操作繁琐。且在实际检验工作中前处理溶媒以及层析用的展开剂等毒性大，例如：乙醚，石油醚，甲酸乙酯，甲酸等，对实验人员的伤害比较大。因此，迫切需要一种新的清热健胃散检测方法以克服上述问题。

技术实现思路

1、鉴于中国兽药典中对清热健胃散中活性成分的鉴别测定过程中存在的费时、费试剂，结果重现性差，影响检测人员的安全等问题，本发明提出了一种清热健胃散中12种活性成分和2种非法添加物同时测定方法。

2、清热健胃散为中兽药成方制剂，收载于《中国兽药典》2020年版清热健胃散质量标准。国家标准内容如下：

3、清热健胃散：

4、【处方】龙胆30g黄柏30g知母20g陈皮25g厚朴20g大黄20g山楂20g六神曲20g麦芽30g碳酸氢钠50g；【制法】以上10味，除碳酸氢钠外，其余龙胆等9味共粉碎成粉末，加碳酸氢钠，过筛，混匀，即得。【性状】本品为淡黄色的粉末；气香，味苦。

5、显微鉴别：

6、1、山楂：果皮石细胞淡紫红色、红色或黄棕色，类圆形或多角形，胞腔中含红棕色物，直径约至125μm。

7、2、黄柏：纤维束鲜黄色，周围细胞含草酸钙方晶，形成晶纤维，含晶细胞的壁木化增厚。

8、3、大黄：草酸钙簇晶大，直径60～140μm。

9、4、麦芽：果皮细胞纵列，常有1个长细胞与2个短细胞相间连接，长细胞壁厚，波状弯曲，木化。

10、5、陈皮：草酸钙方晶成片存在于薄壁组织中。

11、6、厚朴：石细胞分枝状，壁厚，层纹明显。

12、7、知母：草酸钙针晶成束或散在，长26～110μm。

13、薄层色谱法鉴别：

14、取本品2g，加甲醇20ml，浸渍过夜，滤过，取滤液5ml，蒸干，残渣加水10ml使溶解，再加盐酸1ml，置水浴上加热10分钟，立即冷却，用乙醚分2次提取，每次20ml，合并乙醚液，蒸干，残渣加三氯甲烷1ml使溶解，作为供试品溶液。另取大黄对照药材0.1g，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各5μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶h薄层板上，以石油醚(30～60℃)－甲酸乙酯－甲酸(15：5：1)的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，相同的五个橙黄色荧光斑点置氨蒸汽中熏后，日光灯下检视，斑点变为红色。

15、【功能】清热，燥湿，消食。【主治】胃热不食，宿食不化。

16、本发明的技术方案如下：

17、一种清热健胃散中12种活性成分和2种非法添加物同时测定方法，包括如下步骤：

18、(1)分别称取各种活性成分的标准品并用有机溶剂配置成同时含有各标准品的混合对照储备溶液；另外单独配制喹乙醇和乙酰甲喹的混合对照品储备溶液；

19、优选的，所述有机溶剂为甲醇、乙醇或三氯甲烷中的任意一种。

20、所述12种活性成分为：绿原酸，龙胆苦苷，橙皮苷，盐酸小檗碱，盐酸巴马汀，芦荟大黄素，大黄酸，大黄素，大黄酚，大黄素甲醚，和厚朴酚，厚朴酚；

21、所述2种非法添加物为喹乙醇和乙酰甲喹；

22、(2)采用萃取剂对清热健胃散进行超声萃取，离心、过滤后得待测液；

23、优选的，所述萃取剂为选自甲醇、无水乙醇、体积分数为50％的甲醇、体积分数为50％的乙醇或者体积分数为70％的乙醇中的任意一种；更优选的萃取剂为为体积分数为70％的乙醇。

24、优选的，所述清热健胃散与萃取剂的体积比为1:25-100；所述萃取条件为超声萃取，萃取时间为15-25min。采用超声萃取的方式可以有效提高萃取效率和萃取效果。

25、优选的，离心条件为：转速10000-15000rpm/min，离心时间为15-25min；更优选的，离心的转速为12000rpm/min，离心时间为20min。

26、(3)采用超高效液相色谱仪分别对混合对照储备溶液和待测液进行检测，通过色谱图、保留时间对待测液中的12种活性成分进行定性分析，通过色谱峰面积计算出待测液中12种活性成分的含量；

27、色谱条件为：流动相a为乙腈+0.2％磷酸，流动相b为0.2％磷酸水溶液，柱温为39-41℃；流动相的流速：0.35ml/min；进样量：0.5-5μl；色谱柱为waters uplc hss t3色谱柱；

28、检测条件：pda检测器，3d扫描波长范围190-400nm；检测波长为225nm、228nm、251nm、240nm、264nm，289nm，292nm，327nm，346nm等多通道。

29、优选的，检测波长为228nm、264nm、243nm。

30、优选的，所述柱温为40℃；进样量为1-2μl。

31、进一步，所述梯度洗脱程序为0-4min，流动相a的体积分数维持在5％；4-8min，流动相a的体积分数由5％变为10％；8-12min，流动相a的体积分数维持在10％；12-16min，流动相a的体积分数由10％变为15％；16-20min，流动相a的体积分数维持在15％；20-25min，流动相a的体积由15％变为20％；25-30min，流动相a的体积分数维持在20％；30-32min，流动相a的体积分数由20％变为40％；32-36min，流动相a的体积分数由40％变为60％；36-40min，流动相a的体积分数维持在60％；40-43min，流动相a的体积分数由60％变为85％；43-45min，流动相a的体积分数维持在85％；45-47min，流动相a的体积分数由85％变为5％；47-50min，流动相a的体积分数维持在5％。

32、本发明与现有技术相比具有以下优点：

33、本发明通过超高效液相色谱法同时把清热健胃散中山楂(绿原酸)，龙胆(龙胆苦苷)，黄柏(盐酸小檗碱)，陈皮(橙皮苷)，大黄(大黄素、大黄酸、芦荟大黄素、大黄酚、大黄素甲醚)，厚朴(和厚朴酚，厚朴酚)等6种中药组分中的多种主要成分一次测定出来，方法简便快速、分离效果好，测定精度高，结果重现性好，易于观察，专属性强，色谱峰峰形良好，既达到中国兽药典的要求，又节省时间、试剂。另外在对抽检样品的检测过程中通过梯度洗脱的优化和多通道检测波长的筛选同时发现了非法添加物喹乙醇和乙酰甲喹。

34、本发明的测定方法，经过对甲醇、乙醇、50％甲醇、50％乙醇、70％乙醇等多种不同溶剂的比较，各化合物响应有高有低均能检出，由于甲醇毒性比乙醇大，最终优选70％乙醇为提取溶剂，兼顾了众多化合物的溶解特性，兼顾多个化合物的响应值，对供试品进行提取，使用的溶剂毒性小，化合物的峰面积响应值适中，样品处理简便，减少了薄层检测时大量有机溶媒的使用，操作安全环保，且对人和环境危害小。

35、本发明的测定方法使用超高效液相色谱仪配合pda检测器，以色谱图和光谱图的方式呈现结果，方便快捷，结果直观，容易判断，检测限低，大大缩短了检验时间(从样品处理到上机检测判定结果，约2-3个小时可以检测完成，而薄层检测和显微检测方法，一个样品需要约18-24小时)，大大增加了检测指标，提升了检验效率、检测灵敏度和检验效果。