一种同时检测尿液中多种蛋白的分析方法与流程

本发明涉及蛋白提取纯化领域，尤其涉及一种同时检测尿液中多种蛋白的分析方法。

背景技术：

1、早期肾脏疾病筛查往往需要检测尿液中的尿白蛋白（hsa）、尿转铁蛋白（trf）、尿视黄醇结合蛋白（rbp4）、尿α1微球蛋白（a1m）、尿β2微球蛋白（b2m）、nag等标记物，这些指标是肾小球、肾小管、近曲小管早期损伤和早期糖尿病肾病的敏感指标。在临床诊断过程中，往往各种尿液蛋白都需要检测一遍以进行筛查和诊断。但受限于检测方法，每个标记物都需要单独进行一次检测，不仅费时费力费钱，而且由于操作量大，更容易造成样本污染、操作错误，从而使检测结果不准确，导致不能准确诊断。

2、从文献调研的结果来看，分析测定尿液中一种至三种理化性质差别较大的蛋白的难度较低，但是同时分离尿液中多种蛋白需要更复杂的分离技术。目前，常用的主要有电泳技术、高度集成的蛋白生化分析技术、化学发光技术、质谱技术等，其中电泳技术操作繁琐、干扰因素多、结果不稳定、无法定量分析；生化分析技术的伪浊度会造成定量结果的不准确性，且不同种类的蛋白通常需分别检测；化学发光技术复杂，成本高；质谱技术仪器设备昂贵且依靠进口，使用操作难度高。

3、因此，现在亟需一种可以简单、快速、经济、准确同时检测分离尿液中多种蛋白的分析方法。

技术实现思路

1、为解决上述技术问题，本发明提供了一种可以同时检测尿液中多种蛋白的分析方法，该方法对尿液样品处理简便，可以快速、准确地检测尿液中的白蛋白、转铁蛋白、视黄醇结合蛋白、β2微球蛋白、α1微球蛋白等蛋白质。

2、本发明采用如下技术方案：

3、s1，过滤：用亲水性mce滤膜过滤尿液，得到滤液1；

4、s2，第一次固相萃取：将所述滤液1经过含葡聚糖的体积排柱凝胶柱处理，得到滤液2；

5、s3，第二次固相萃取：将所述滤液2经过以含有-n+(ch3)3官能团的多孔亲水性聚甲基丙烯酸酯为基质的阴离子交换柱处理，得到滤液3；

6、s4，高效阴离子液相色谱分析：用含有-n+(ch3)3官能团的无孔树脂填料的阴离子交换柱检测滤液3，洗脱方式采用含cl-的tris梯度流动相。

7、进一步地，所述亲水性mce滤膜的孔径为0.22微米。

8、进一步地，所述体积排柱凝胶柱为hitraptm desalting，5 ml，cytiva。

9、进一步地，所述第一次固相萃取的具体方法为：

10、置换：用25 ml tris-hcl缓冲液a（20 mm tris-hcl，ph=8.0）完全置换所述体积排柱凝胶柱中的乙醇溶液

11、平衡：5.0 ml tris-hcl缓冲液c（20 mm tris-hcl，25 mm nacl，ph=8.0）

12、上样：以1.5 ml计的所述滤液1

13、洗脱：2.0 ml 所述tris-hcl缓冲液c，收集洗脱液即为所述滤液2

14、流速：1.0-10.0 ml/min

15、柱温：室温。

16、进一步地，所述第二次固相萃取的阴离子交换柱为monomix mab60-q，monomixhc60-q-ii和polar mc60-q9中的一种。

17、进一步地，所述第二次固相萃取的具体方法为：

18、活化：3.0 ml超纯水

19、平衡：1.5 ml 所述tris-hcl缓冲液a

20、上样：所述滤液2

21、淋洗：1.5 ml tris-hcl缓冲液d（20 mm tris-hcl，50 mm nacl，ph=8.0）

22、洗脱：0.15 ml tris-hcl缓冲液b（20 mm tris-hcl，500 mm nacl，ph=8.0），收集洗脱液即为所述滤液3

23、流速：不超过1 d/s

24、柱温：室温。

25、进一步地，所述无孔树脂为聚苯乙烯/二乙烯苯（ps/dvb）树脂颗粒，粒径为1.7-10μm，表面键合亲水聚合物纳米薄层，所述纳米薄层上修饰所述-n+(ch3)3官能团。

26、进一步地，所述高效阴离子液相色谱柱为proteomix sax np5，4.6×50 mm，sepax。

27、进一步地，所述高效阴离子液相色谱分析的具体方法为：

28、流动相：所述缓冲液a和所述缓冲液b

29、上样：所述滤液3

30、洗脱梯度：

31、0-0.5min 0%b

32、0.5-7.0min 0-100%b

33、7.0-7.1min 100-0%b

34、7.1-15min 0%b

35、检测器：紫外检测波长210、280nm

36、柱温：室温

37、流速：0.5 ml/min。

38、进一步地，所述分析方法主要检测尿液中的白蛋白、转铁蛋白、视黄醇结合蛋白、β2微球蛋白、α1微球蛋白中的一种或多种。

39、尿液样本需要经过过滤和固相萃取进行前处理，这是由于尿液中杂质较多、5种目标蛋白含量低，需要通过前处理完成大部分杂质（主要是小分子类）去除和目标蛋白富集。首先使用针式过滤器（含0.22微米孔径的亲水性滤膜）对尿液进行过滤，去除沉淀、细菌等；然后利用目标蛋白和小分子类杂质的体积差异，选用体积排阻原理的葡聚糖凝胶柱，去除小分子类杂质，同时置换尿液至低盐浓度和弱碱性环境，为后续浓缩做准备；接着利用目标蛋白和其他蛋白的等电点差异，选用阴离子交换柱，选择性吸附目标蛋白并在后续被小体积液体洗脱下来，完成浓缩富集和进一步除杂。

40、将经过过滤和两次固相萃取的尿液样本进行高效阴离子液相色谱分析，在ph=8.0环境下固定相填料带正电，白蛋白、转铁蛋白、视黄醇结合蛋白、β2微球蛋白、α1微球蛋白带负电，固定相和蛋白之间有静电作用等结合力。由于五种蛋白等电点不同，固定相与五种蛋白之间的静电作用力也不同。梯度洗脱过程中，不断增加流动相b的比例，流动相b中的cl-与五种蛋白竞争结合固定相，使得五种蛋白会按照结合力由弱到强的顺序依次流出，进而完成定性和定量检测。

41、与现有技术相比，本发明提供的一种同时检测尿液中多种蛋白的分析方法，其操作简单、步骤少，可以快速、准确地对尿液中的白蛋白、转铁蛋白、视黄醇结合蛋白、β2微球蛋白、α1微球蛋白等蛋白进行定性和定量分析。

技术特征：

1.一种同时检测尿液中多种蛋白的分析方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种同时检测尿液中多种蛋白的分析方法，其特征在于，所述蛋白为白蛋白、转铁蛋白、视黄醇结合蛋白、β2微球蛋白、α1微球蛋白中的一种或多种。

3.根据权利要求1所述的一种同时检测尿液中多种蛋白的分析方法，其特征在于，所述亲水性mce滤膜的孔径为0.22微米。

4.根据权利要求1所述的一种同时检测尿液中多种蛋白的分析方法，其特征在于，所述体积排柱凝胶柱为hitraptm desalting，5 ml，cytiva。

5.根据权利要求4所述的一种同时检测尿液中多种蛋白的分析方法，其特征在于，所述第一次固相萃取的具体方法为：

6.根据权利要求1所述的一种同时检测尿液中多种蛋白的分析方法，其特征在于，所述第二次固相萃取的阴离子交换柱为monomix mab60-q，monomix hc60-q-ii和polar mc60-q9中的一种。

7.根据权利要求6所述的一种同时检测尿液中多种蛋白的分析方法，其特征在于，所述第二次固相萃取的具体方法为：

8.根据权利要求1所述的一种同时检测尿液中多种蛋白的分析方法，其特征在于，所述无孔树脂为聚苯乙烯/二乙烯苯（ps/dvb）树脂颗粒，粒径为1.7-10 μm，表面键合亲水聚合物纳米薄层，所述纳米薄层上修饰所述-n+(ch3)3官能团。

9.根据权利要求8所述的一种同时检测尿液中多种蛋白的分析方法，其特征在于，所述高效阴离子液相色谱柱为proteomix sax np5，4.6×50 mm，sepax。

10.根据权利要求9所述的一种同时检测尿液中多种蛋白的分析方法，其特征在于，所述高效阴离子液相色谱分析的具体方法为：

技术总结
本发明提供了一种同时检测尿液中多种蛋白的分析方法，将尿液依次经过亲水性MCE滤膜过滤、含葡聚糖的体积排柱凝胶柱、以及含有‑N+(CH3)3官能团的多孔亲水性聚甲基丙烯酸酯为基质的阴离子交换柱处理，完成杂质的去除和目标蛋白的浓缩，然后利用含有‑N+(CH3)3官能团的无孔树脂填料的高效阴离子色谱法进行检测分析。该方法操作简单、步骤少，可以快速、准确地对尿液中的白蛋白、转铁蛋白、视黄醇结合蛋白、β2微球蛋白、α1微球蛋白等蛋白进行定性和定量分析。

技术研发人员：贡文秀,黄学英
受保护的技术使用者：苏州赛分科技股份有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13