一种碳青霉烯酶多联检测试纸及制备方法与流程

本发明涉及一种碳青霉烯酶多联检测试纸及制备方法，属于生物。

背景技术：

1、耐碳青霉烯类抗生素耐药的肠杆菌科细菌(carbapenems resistantenterobacter，cre)造成的感染呈现逐年上升的趋势。产碳青霉烯酶是耐碳青霉烯类肠杆菌最常见的耐药机制，碳青霉烯酶可以直接水解灭活大多数β-内酰胺类(包括碳青霉烯酶类)和多种非β-内酰胺类抗菌药物，产碳青霉烯酶肠杆菌科细菌具有快速传播的潜力，相比非产酶的耐碳青霉烯类肠杆菌更易引起院内感染，且病死率更高。碳青霉烯酶的编码基因位于染色体或质粒上，通过克隆传播或基因水平转移使细菌对美罗培南、亚胺培南等β-内酰胺类抗菌药物产生抗性。根据氨基酸序列同源性以及分子结构特点，可将碳青霉烯酶分为a、b、d三类，其中a类为丝氨酸蛋白酶，主要为质粒介导的肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶即kpc酶(klebsiella pneumoniae carbapenemase)、阴沟肠杆菌(imi酶、nmc-a酶)、黏质沙雷菌中由染色体介导的sme酶等；b类为金属酶，包括ndm型(new delhi metallo-βlactamase)、vim型(verona integron-encoded metallo-β-lactamase)及imp型(imipenemasemetallo-β-lactamase)金属β－内酰胺酶；d类为oxa酶(oxacillinase)，主要为oxa-48、oxa-23酶。其中kpc、ndm、oxa-48碳青霉烯酶是肠杆菌科细菌对碳青霉烯类耐药最主要的耐药机制。

2、目前，常用的检测碳青霉烯酶的方法主要分表型检测法和基因检测法。表型检测方法主要有改良霍奇试验(modified hodge test，mht)、基于比色的carba np实验、基于质谱的美罗培南溶解试验(mha)、碳青霉烯灭活试验(carbapenem enzyme inactivationmethod，cim)、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(maldi-tof)鉴定等，这些检测方法所需时间长。此外，生化方法耗时短且敏感性及特异性均较高，但不能区分亚型。基因检测法(聚合酶链式反应，polymerase chain reaction，pcr)是碳青霉烯酶检测的“金标准”，但人力及成本很高。例如，专利cn202110733877.1公开了一种检测六种主要碳青霉烯酶基因引物和探针、试剂盒及方法，其采用实时荧光定量pcr可以用于快速灵敏地检测样品中kpc、vim、ctx、ges、ndm和imp共6种碳青霉烯酶基因。

3、快速检测产碳青霉烯酶多重耐药和泛耐药菌株可以针对性进行及时有效治疗。目前，已有基于胶体金免疫层析法的试剂应用，但是仍然存在各种问题。专利申请号为cn202111630811公开了一种用于检测细菌内碳青霉烯酶的免疫层析试纸条及检测方法，该发明专利选用性质稳定的美罗培南作为底物，以金标青霉素结合蛋白pbp 4’作为受体，通过检测底物消耗情况间接检测样品中碳青霉烯酶的有无。该专利申请选用美罗培南作为底物，以金标青霉素结合蛋白pbp 4’作为受体，通过检测底物消耗情况间接检测样品中碳青霉烯酶的有无，这种方法并不是直接检测碳青霉烯酶，不能准确确定碳青霉烯酶的具体类型。

4、因此，亟需提供一种操作简单、高效、灵敏的免疫层析法多联检测碳青霉烯酶的方法。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种碳青霉烯酶多联检测试纸及制备方法。该多联检测试纸可一次性检测ndm、imp、kpc、oxa23、oxa48及vim型六种碳青霉烯酶，该方法操作简便、高效、灵敏且检测成本低，可用于碳青霉烯酶耐药菌株的早期分型、指导用药，以及辅助临床感染控制和治疗。

2、为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

3、一种碳青霉烯酶多联检测试纸，所述试纸包括支撑底板，在支撑底板上依次固定有样品垫、金标蛋白垫、层析检测膜和吸水垫；其中，金标蛋白垫上固定有胶体金标记的金标多抗pcab，所述金标多抗pcab为胶体金标记的分别抗ndm、imp、kpc、oxa23、oxa48及vim型碳青霉烯酶的单克隆抗体的混合物；层析检测膜上设有六条检测线及一条质控线，六条检测线上分别包被有抗ndm、imp、kpc、oxa23、oxa48及vim型碳青霉烯酶的单克隆抗体；质控线上固定有兔抗鼠igg。

4、所述抗ndm、imp、kpc、oxa23、oxa48及vim型碳青霉烯酶的单克隆抗体的混合物为单克隆抗体4f11、3d7、6h3、3a3、7e12、1b5的混合物；

5、所述包被的抗ndm、imp、kpc、oxa23、oxa48及vim型碳青霉烯酶的单克隆抗体分别为单克隆抗体6h9、5g5、4h9、4e3、3f9、1e1。

6、碳青霉烯酶的单克隆抗体的制备方法为：其中，x为ndm、imp、kpc、oxa23、oxa48或vim；

7、(1)免疫原的制备：

8、1)构建重组表达载体：按照大肠杆菌表达系统密码子偏爱性，分别对ndm、imp、kpc、oxa23、oxa48及vim型碳青霉烯酶的基因序列进行优化合成；优化后合成的基因序列如seq id no.1-6所示，相应的氨基酸序列如seq id no.7-12所示；

9、以合成的基因为模板，经pcr扩增获得目的片段，并将其克隆至表达载体pet-28a，得重组表达载体pet-28a-x；其中，x为ndm、imp、kpc、oxa23、oxa48或vim；

10、2)将重组表达载体pet-28a-x用cacl2法转入感受态细胞e.coli bl21(de3)中，获得阳性重组大肠杆菌bl21(de3)菌株；

11、3)将阳性重组大肠杆菌bl21(de3)接种于lb培养基，诱导表达过夜，收集样品进行超声破碎及纯化，分别得到ndm、imp、kpc、oxa23、oxa48及vim重组蛋白；

12、(2)单克隆抗体的制备：

13、以纯化的ndm、imp、kpc、oxa23、oxa48或vim重组蛋白为免疫原，免疫6-8周龄雌性balb/c小鼠，进行抗体制备。

14、所述的碳青霉烯酶多联检测试纸的制备方法，包括以下步骤：

15、(1)抗碳青霉烯酶ndm、imp、kpc、oxa23、oxa48及vim型单克隆抗体的制备；

16、(2)胶体金标记的抗体混合溶液的制备；

17、(3)金标蛋白垫的制备；

18、(4)层析检测膜的制备；

19、(5)吸水垫及支撑底板的制备；

20、(6)组装试纸。

21、胶体金标记的抗体混合溶液为胶体金标记的单克隆抗体4f11、3d7、6h3、3a3、7e12、1b5的混合物；胶体金标记的抗体混合溶液中单克隆抗体4f11、3d7、6h3、3a3、7e12、1b5的质量比为1：1：1：1：1：1，终浓度均为0.3mg/ml。

22、层析检测膜的制备方法为：

23、1)检测线包被液制备：用0.01mol/l、ph 7.0-7.6的磷酸盐缓冲液，将单克隆抗体6h9、5g5、4h9、4e3、3f9、1e1分别配制成1mg/ml的溶液，备用；

24、2)质控线包被液制备：用0.1mol/l tris-hcl缓冲液，将兔抗鼠igg抗体配制成1mg/ml的溶液，备用；

25、3)将硝酸纤维素膜切成2.5×30cm的长条，备用；

26、4)制备印迹：以0.9μl/cm的量，分别将检测线包被液和质控线包被液，喷涂于硝酸纤维素膜上，得到t1、t2、t3、t4、t5、t6六条检测线和一条质控线印迹；检测线与质控线相距0.2cm，于42℃干燥4h，干燥密闭保存。

27、所述的碳青霉烯酶多联检测试纸在ndm、imp、kpc、oxa23、oxa48及vim六种碳青霉烯酶的检测中的应用。

28、所述的碳青霉烯酶多联检测试纸在碳青霉烯酶耐药菌株的早期分型中的应用。

29、本发明有益效果：

30、1.本发明制备的试纸条是基于双抗夹心elisa检测法的原理，其是针对ndm、imp、kpc、oxa23、oxa48或vim抗原的检测，首先根据大肠杆菌的密码子偏好性优化并合成了ndm、imp、kpc、oxa23、oxa48及vim蛋白的编码区基因序列(seq id no.1-6)，通过原核表达系统制备ndm、imp、kpc、oxa23、oxa48和vim蛋白，经免疫本发明制备的试纸条能同时检测ndm、imp、kpc、oxa23、oxa48或vim六种碳青霉烯酶，快速、简便、特异性好，实现了准确、快速检测的目的。

31、2.本发明提供了六种碳青霉烯酶抗体，所述的ndm、imp、kpc、oxa23、oxa48或vim型碳青霉烯酶抗体与相应的碳青霉烯酶具有较好的亲和力，可制备成检测试剂盒用于碳青霉烯酶耐药菌株的早期分型。

32、3.本发明实现了一步多检，操作简单快速，结果清晰易辨，具有较好的检测灵敏度和准确性，可用于碳青霉烯酶耐药菌株的早期分型，指导用药，从而辅助临床感染控制和治疗。