专利名称：牛奶中致泻型大肠杆菌pcr快速检测试剂盒及其制备方法
技术领域：
本发明涉及的是一种生物监测技术。
背景技术：
大肠埃希氏菌是流行性兼性厌氧菌，寄生在人类的结肠部位，是婴儿出生一小时内在胃肠道定居的典型微生物。其后，大肠埃希氏菌通常与其宿主保持共生关系。大肠埃希氏菌在正常情况下被局限在狭窄的肠道内不致病，但是当宿主过度疲劳或免疫力下降时，或当正常胃肠道壁被破坏时。以致正常“良性”大肠埃希氏菌株也可引起感染。致泻性大肠埃希氏菌是引起感染性腹泻的病原菌之一。目前，根据致泻性大肠埃希氏菌的毒力因子，致病机理及其遗传控制，国际上将其分为五类——肠致病性大肠埃希氏菌(EPEC)、肠出血性大肠埃希氏菌(EHEC)、肠侵袭性大肠埃希氏菌(EIEC)、肠产毒性大肠埃希氏菌(ETEC)、肠集聚性大肠埃希氏菌(EAggEC)，其中ETEC菌株通过LT和ST致病基因的作用引起腹泻。这些菌株可只表达LT。或只表达ST，或二者都表达。本实验中的所采用标准菌株44247(ETEC，O6:K15:H16)被Jav Sarantuya等人报道只含ST。EPEC是在发展中国家已被同婴儿腹泻联系在一起的一种重要的致腹泻大肠杆菌分类，其致病性与LEE毒力岛上的eaeA毒力基因有关。EIEC的侵袭机制是研究最为清楚的，其侵袭性是因为具有侵袭性质粒引起的，在侵袭性质粒上含有ipaH毒素基冈。目前采用的检测食品中这几种致泻型大肠杆菌的分离培养法阳性率低。且费时费力，需几周时间才能报告结果。近年来发展起来的聚合酶链式反应(PCR)检测技术具有减少检验时间、方法简单的优点，为大肠杆菌的快速检测提供了有力手段，但目前尚无同时检测几种腹泻致病菌的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种分别以ST、eaeA、ipaH毒素基因为目的基因设计引物。应用多重PCR同时扩增主要致病性大肠杆菌EPEC、EIEC和ETEC的毒力基因，建立一种牛奶中致泻型大肠杆菌PCR快速检测试剂盒。
本发明的目的是这样实现的 多重PCR快速检测试剂盒的组成包括 10×PCR buffer 5.0μl 10mM dNTP 1.0μl 25mM MgCI33.0μl
DNA模板5.0μl ddH2O29.5μl Taq DNA聚合酶(5U/L1) 0.5μl Total50.0μl 本发明的检测试剂盒还可以包括这样一些特征 1、所述的引物的浓度为 2、所述的模板DNA，是将样品或(ETEC、EPEC和EIEC)标准菌株混合物分别接种于LB，即10％蛋白胨、5％酵母提取物、10％氯化钠，pH7.5的液体培养基中。200rpm/min、37±1℃摇床培养2.5h，采取裂解法或者试剂盒方法提取提取的DNA。
3、PCR反应条件为 95℃ 5min； 94℃ 40S，51.3℃ 40S，72℃ 1min，循环30次，再72℃延伸1Omin。
本发明的检测试剂盒是采用这样的方法来制备的 1、细菌的增菌培养 将ETEC、EPEC和EIEC标准菌株分别接种于LB，即10％蛋白胨、5％酵母提取物、10％氯化钠，pH7.5的液体培养基中，37℃过夜培养。
2、模板DNA的提取及定量 采取裂解法或者试剂盒方法提取提取DNA,应用紫外可见分光光度计检测DNA的吸光值，先用去离子水洗4次石英比色皿，将提取的原DNA用去离子水稀释60倍。将3000μl去离子水的比色杯放入仪器中读取零值作参照。将稀释60倍后的DNA液加入到石英比色皿中上机检测，根据公式核酸(μg/ml)＝62.9×A260-36×A280计算DNA浓度将过夜培养的菌液做10倍递增稀释，选择2-3个适宜稀释度。吸取该稀释度1ml稀释液于灭菌平皿内。每个稀释度做两个平皿，及时将凉至46℃营养琼脂培养基注入平皿10-15ml，同时将营养琼脂培养基倾入加有1ml稀释液的灭菌平皿内作空白对照，待琼脂凝固后，翻转平板。置36±1℃温箱内培养48±2h，按照中国人民共和国国家标准食品微生物学检测菌落总数测定(GB4789.2-94)进行菌落计数； 3、引物的设计与合成 引物序列、扩增片段长度 4、建立单个PCR反应体系 PCR反应在0.5ml Eppendorf管中进行，采用50μl反应体系，各反应成分为 10×PCR buffer 5.0μl 10mM dNTP 1.0μl 25mM MgCI3 3.0μl 引物P1 1.0μl 引物P2 1.0μl DNA模板 5.0μl ddH2O 33.5μl TaqDNA聚合酶(5U/Ll) 0.5μl Total 50.0μl 引物浓度为 5、本发明的多重PCR反应条件为 95℃预变性5min；94℃变性40s，51.3℃退火40s，72℃延伸1min，进行30个循环；72℃延伸10min。
使用时取0.5ml奶样加到4.5ml LB液体培养基中，200rpm/min、37±1℃摇床培养2.5h，取36μl LB培养液，加入到1.5ml离心管中，在加入4μl的10×TE和60μl的2×蛋白酶K，56℃金属浴90min，95℃水浴10min，10,000×g离心1min，取上清做模板，制成试样，-20℃保存备用。按照PCR快速检测试剂盒反应体系的组成，即10×PCRbuffer 5.0μl；10mMdNTP 1.0μl；25mM MgCl2 3.0μl；引物P1各1.0μl；引物P2各1.0μl；DNA模板5.0μl；TaqDNA聚合酶(5U/Ll)0.5μl，其余用超纯水加至反应总体积为50.0μl。进行PCR扩增，95℃预变性5min；94℃变性40s，51.3℃退火40s，72℃延伸1min，进行30个循环；72℃延伸10min。再进行结果判定将50×TAE电泳缓冲液20ml加双蒸水稀释至1000ml(1×TAE)待用，14ml 1×TAE缓冲液于三角瓶中，加入3.5g琼脂糖加热溶解，冷至50℃左右后加入溴化乙锭(0.5μg/ml)0.5μl，倒人准备好的电泳平板上，电泳槽中加入1×TAE缓冲液，取PCR终产物按5∶1的比例加入溴酚蓝点样110V电泳25min，取出然后置于300nm的紫外透射仪上观察，样品出现和阳性对照在同一水平位置上的红橙色荧光带即为阳性，否则为阴性。
本发明的原理为 致泻性E.coli通过本身的致病基因引起腹泻，如ETEC菌株通过LT和ST致病基因致病。这些菌株可只表达LT，或只表达ST，或二者都表达。EPEC的致病性与LEE毒力岛上的eaeA毒力基因有关。EIEC的侵袭机制是研究最为清楚的，其侵袭性是因为具有侵袭性质粒引起的，在侵袭性质粒上含有ipaH毒素基因。本发明分别以ST、eaeA、ipaH毒素基因为目的基因设计引物，进行PCR扩增，证明这三对基因对相应致病菌是特异性的，且敏感性很高。所以，应用多重PCR技术在一次反应中同时扩增主要致病性大肠杆菌EPEC、EIEC和ETEC的毒力基因，以建立一种快速检测牛奶中致泻性大肠杆菌的PCR扩增方法。
本发明对牛奶中常见的腹泻致病性大肠杆菌即致病性大肠杆菌(EPEC)、产肠毒素大肠杆菌(ETEC)和肠侵袭性E.coli(EIEC)进行基因检测研究，建立了快速样品处理和多重聚合酶链式反应(PCR)诊断方法，在一次PCR反应中同时扩增这三种菌的致病基因ETEC的ST基因、EPEC的eaeA毒力基因和EIEC的侵袭性质粒上的ipaH毒素基因，建立了一种快速检测牛奶中致泻型大肠杆菌的PCR扩增方法。
本发明的关键技术在于建立一种快速样品处理和多重聚合酶链式反应(PCR)诊断方法。本发明与目前常用的分离培养法相比具有以下优点 1.快速本方法检测整个过程所需时间包括样品前处理3h，PCR扩增需3.5h，琼脂糖电泳观察需0.5h，全程仅需7小时左右。普通的活菌计数和生化分离鉴定方法耗时2周左右。
2.检出率高现行的诊断血清不包括所有致泻型大肠杆菌的血清类型，但是通过毒素基因的检测可以检测到诊断血清不能检测到的却携带毒素基因的致泻型E.coli。本试验证明，血清学玻片凝集反应、动物致病性试验阳性菌株用多重PGR方法均能检出含有毒素基因，并且在生化鉴定筛选出的，血清学玻片凝集反应阴性、动物致病性试验阳性的E.coli疑似菌中也发现含有携带毒素基因的分离菌株。说明本法检测率高于普通培养法。
3.灵敏度高 本方法灵敏度EPEC、EIEC、ETEC分别为4.3×103、1.5×103、2.6×104CFU/m，低于国家标准1×105CFU/ml。
具体实施例方式 下面举例对本发明做更详细地描述 1大肠杆菌ETEC、EPEC和EIEC单PCR检测方法的建立 1.1细菌的增菌培养 标准菌株44247(ETEC，O6:K15:H16)、44706(EPEC)、44350(EIEC)购自中国药品生物制品检定所将ETEC、EPEC和EIEC标准菌株分别接种于LB(10％蛋白胨，5％酵母提取物，10％氯化钠，pH7.5)液体培养基中，37℃过夜培养。
1.2模板DNA的提取及定量 1.2.1裂解法提取DNA 将36μl LB过夜培养液，加入4μl(10×TE)液和60μl(2×蛋白酶K)。56℃水浴90min，再95℃水浴10min，10,000×g离心1min，取上清做模板，-20℃保存备用。
1.2.2试剂盒方法提取DNA DNA质粒小提试剂盒由北京天为时代科技有限公司生产。
(1)取1～5ml过夜培养的菌液加入离心管中，13,000rpm/min离心1min，尽量吸除上清； (2)向留有菌体沉淀的离心管中加入250μl溶液P1，使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀。
(3)向离心管中加入250μl溶液P2，温和地上下翻转6～8次使菌体充分裂解。向离心管中加入350μl溶液P3，立即温和地上下翻转6～8次，充分混匀。13,000rpm/min离心10min，用移液器将上清转移到另一个干净的离心管中。
(4)将上一步所得上清液加入吸附柱CB3中，吸附柱放入收集管中，室温放置1～2min，13,000rpm/min离心30～60秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
(5)向吸附柱CB3中加入700μl漂洗液PW，13,000rpm/min离心30～60秒，倒掉收集管中的废液，将吸刚柱重新放回收集管中。
(6)向吸附柱CB3中加入500μl漂洗液PW，13,000rpm/min离心30～60秒，弃掉收集管中的废液。
(7)将吸附柱CB3重新放回收集管中置于13,000rpm/min离心2min，将吸附柱中残余的漂汰液去除。
(8)将吸附柱CB3置于室温或50℃温箱放置数分钟，以彻底凉干吸附材料中残余的漂洗液。
(9)将吸附柱CB3置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空清加50～100μl经65～70℃水浴预热的洗脱缓冲液TE，室温放置2min，13,000rpm/min离心1min将质粒溶液收集到离心管中。
1.2.3DNA定量 (1)紫外可见分光光度计法进行DNA定量 应用Spectrun-756P型紫外可见分光光度计检测DNA的吸光值。先用去离子水洗4次石英比色皿。将提取的原DNA用去离子水稀释60倍。将3000μl去离子水的比色杯放入仪器中读取零值作参照。将稀释60倍后的DNA液加入到石英比色皿中上机检测。根据公式 核酸(μg/ml)＝62.9×A260-36×A280计算DNA浓度[5]。
(2)计算LB液体培养基过夜培养菌液的细菌浓度(CFU) 将过夜培养的菌液做10倍递增稀释，选择2～3个适宜稀释度，吸取该稀释度1ml稀释液于灭菌平皿内，每个稀释度做两个平皿。及时将凉至46℃营养琼脂培养基注入平皿约15ml，并转动平皿使混合均匀。同时将营养琼脂培养基倾入加有1ml稀释液的灭菌平皿内作空白对照。待琼脂凝固后，翻转平板，置36±1℃温箱内培养48±2h。按照中国人民共和国国家标准食品微生物学检测菌落总数测定(GB4789.2-94)进行菌落计数。
1.3引物的设计与合成 进行eaeA、ipaH和ST引物设计，各引物均由宝泰克公司合成。引物序列、扩增片段长度 1.4PCR反应体系 PCR反应在0.5ml Eppendorf管中进行，采用50μl反应体系，各反应成分为 10×PCR buffer 5.0μl 10mM dNTP 1.0μl 25mM MgCI33.0μl 引物P1 1.0μl 引物P2 1.0μl DNA模板5.0μl ddH2O 33.5μl TaqDNA聚合酶(5U/Ll)0.5μl Total 50.0μl 引物浓度 1.5PCR反应条件 采用热盖反应，按以下温度条件进行循环反应95℃预变性5min；94℃变性1min，52℃退火1min，72℃延伸1min，进行30个循环；72℃延伸10min。
1.6 PCR产物的琼脂糖凝胶电泳鉴定 采用常规琼脂糖凝胶电泳进行电泳。琼脂糖凝胶浓度为2.5％，含溴化乙锭0.25μg/ml，缓冲液为1×TAE，以110V衡压电泳20min左右行紫外灯下观察结果。
1.7特异性片段胶回收 将PCR产物在1％的琼脂糖凝胶中进行电泳，在紫外扫描仪下切下特异性片段，用博日胶回收试剂盒进行胶回收。
1.8 PCR产物的克隆与鉴定 在微型离心管中加入下列溶液 pMD18-18T Veceor 0.5μl Control Insert DNA 4.5μl Ligation Solution 5.0μl Total 100.0μl 14℃～16℃反应30min。从-70℃冰箱中取出大肠杆菌感受态(Dh5 a)。放在冰上使之慢慢熔化，加入10μl的连接产物，用预冷的Tip头轻轻混合。放于冰上静止30min。42℃水浴90S，放于冰上冷却2～4min。加入200μl液体LB，37℃摇床温育1h。取出后加X-gal(20mg/ml)35μl。IPTG(100mmol)33μl。在Amp+(60μg/ml)LB固体琼脂平板上涂菌。置37℃恒温箱中倒置培养12～16h。次日取出平板放入4℃冰箱显色。挑取白色菌落摇菌。应用质粒小提试剂盒提取转化后大肠杆菌中的质粒DNA做模板，进行PCR鉴定。
1.9 PCR反应特异性片段测序 将确定为重组、转化成功的质粒送往上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序，将测序结果与NCBI中的已经报到的毒素基因[gi|2809547|gb|AF043226.1|、gi|24080789|gb|AE005674.1|、gi|148029|gb|M29255.1|ECOTOXHS]序列进行同源性比较分析。
判断PCR产物的特异性。
1.10 PCR敏感性实验 对LB过夜培养的标准菌进行菌落计数，用紫外可见分光光度计测提取DNA的吸光值，计算其浓度，然后倍倍稀释，进行PCR敏感性实验实验。
2、多重PCR的构建与反应条件的优化 2.1多重PCR反应体系 10×PCR buffer 5.0μl 10mM dNTP 1.Oμl 25mM MgCI33.0μl
DNA模板5.0μl ddH2O 29.5μl Taq DNA聚合酶(5U/L1) 0.5μl Total 50.0μl 多重PCR引物浓度说明 2.2多重PCR反应条件 95℃预变性5min；94℃变性40s，51.3℃退火40s，72℃延伸1min，进行30个循环；72℃延伸10min。
权利要求
1、一种牛奶中致泻性大肠杆菌PCR快速检测试剂盒，其特征是其组成包括
10×PCR buffer 5.0μl
10mM dNTP1.0μl
25mM MgCl2 3.0μl
DNA模板即LB培养菌液提取的DNA 5.0μl
ddH2O 29.5μl
Taq DNA聚合酶(5U/L1) 0.5μl
Total50.0μl
2、根据权利要求1所述的牛奶中致泻性大肠杆菌PCR快速检测试剂盒，其特征是所述的引物的浓度为
3、根据权利要求1或2所述的牛奶中致泻性大肠杆菌PCR快速检测试剂盒，其特征是所述的LB培养菌液提取的DNA，是将样品或作阳性对照的标准菌株分别接种于LB，即10％蛋白胨、5％酵母提取物、10％氯化钠，pH7.5的液体培养基中，200rpm/min、37±1℃摇床培养2.5h，采取裂解法或者试剂盒方法提取的DNA。
4、根据权利要求1或2所述的牛奶中致泻性大肠杆菌PCR快速检测试剂盒，其特征是PCR反应条件为95℃预变性5min；94℃变性40s，51.3℃退火40s，72℃延伸1min，进行30个循环；72℃延伸10min。
5、一种牛奶中致泻性大肠杆菌PCR快速检测试剂盒的制备方法，其特征是
(1)、细菌的增菌培养
将ETEC、EPEC和EIEC标准菌株分别接种于LB，即10％蛋白胨、5％酵母提取物、10％氯化钠，pH7.5的液体培养基中，37℃过夜培养。
(2)、模板DNA的提取及定量
采取裂解法或者试剂盒方法提取提取DNA；应用紫外可见分光光度计检测DNA的吸光值，先用去离子水洗4次石英比色皿，将提取的原DNA用去离子水稀释60倍，将3000μl去离子水的比色杯放入仪器中读取零值作参照，将稀释60倍后的DNA液加入到石英比色皿中上机检测，根据公式核酸(μg/ml)＝62.9×A260-36×A280计算DNA浓度；将过夜培养的菌液做10倍递增稀释，选择2-3个适宜稀释度，吸取该稀释度1ml稀释液于灭菌平皿内，每个稀释度做两个平皿，及时将凉至46℃营养琼脂培养基注入平皿10～15ml，同时将营养琼脂培养基倾入加有1ml稀释液的灭菌平皿内作空白对照，待琼脂凝固后，翻转平板，置36±1℃温箱内培养48±2h，按照中国人民共和国国家标准食品微生物学检测菌落总数测定(GB4789.2-94)进行菌落计数；
(3)、引物的设计与合成
引物序列、扩增片段长度
(4)、建立单个PCR反应体系
PCR反应在0.5ml Eppendorf管中进行，采用50μl反应体系，各反应成分为
10×PCR buffer 5.0μl
10mM dNTP1.0μl
25mM MgCI3 33.0μl
引物P1 1.0μl
引物P2 1.0μl
DNA模板 5.0μl
ddH2O 33.5μl
TaqDNA聚合酶(5U/L1) 0.5μl
Total50.0μl
引物浓度为
(5)建立多重PCR法应体系及反应条件
10×PCR buffer 5.0μl
10mM dNTP 1.0μl
25mM MgCl23.0μl
终浓度各1、0.5、1uM引物P1(eaeA、ipaH、ST)各1.0μl
终浓度各1、0.5、1uM引物P2(eaeA、ipaH、ST)各1.0μl
DNA模板5.0μl
ddH2O 29.5μl
TaqDNA聚合酶(5U/L1)0.5μl
Total 50.0μl
PCR反应条件为95℃预变性5min；94℃变性40s，51.3℃退火40s，72℃延伸1min，进行30个循环；72℃延伸10min。
6、根据权利要求4所述的牛奶中致泻性大肠杆菌PCR快速检测试剂盒的制备方法，其特征是所述的裂解法提取DNA是将36μl LB过夜培养液，加入4μl(10×TE)液和60μl(2×蛋白酶K)，56℃水浴90min，再95℃水浴10min，10,000×g离心1min，取上清做模板，-20℃保存。
7、根据权利要求4所述的牛奶中致泻性大肠杆菌PCR快速检测试剂盒的制备方法，其特征是所述的试剂盒方法提取DNA是
(1)取1～5ml过夜培养的菌液加入离心管中，13,000rpm/min离心1min，尽量吸除上清；
(2)向留有菌体沉淀的离心管中加入250μl溶液P1，使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀；
(3)向离心管中加入250μl溶液P2，温和地上下翻转6～8次使菌体充分裂解。向离心管中加入350μl溶液P3，立即温和地上下翻转6～8次，充分混匀，13,000rpm/min离心10min，用移液器将上清转移到另一个干净的离心管中；
(4)将上一步所得上清液加入吸附柱CB3中，吸附柱放入收集管中，室温放置1～2min，13,000rpm/min离心30～60秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；
(5)向吸附柱CB3中加入700μl漂洗液PW，13,000rpm/min离心30～60秒，倒掉收集管中的废液，将吸刚柱重新放回收集管中；
(6)向吸附柱CB3中加入500μl漂洗液PW，13,000rpm/min离心30～60秒，弃掉收集管中的废液；
(7)将吸附柱CB3重新放回收集管中置于13,000rpm/min离心2min，将吸附柱中残余的漂汰液去除；
(8)将吸附柱CB3置于室温或50℃温箱放置数分钟，以彻底凉干吸附材料中残余的漂洗液；
(9)将吸附柱CB3置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空清加50～100μl经65～70℃水浴预热的洗脱缓冲液TE，室温放置2min，13,000rpm/min离心1min将质粒溶液收集到离心管中。
全文摘要
本发明提供的是一种牛奶中致泻性大肠杆菌PCR快速检测试剂盒及其制备方法。试剂盒的组成包括10×PCR buffer5.0μl、10mM dNTP1.0μl、25mM MgCl23.0μl、终浓度各1、0.5、1uM引物P1(eaeA、ipaH、ST)各1.0μl、终浓度各1、0.5、1uM引物P2(eaeA、ipaH、ST)各1.0μl、DNA模板5.0μl、ddH2O29.5μl、TaqDNA聚合酶(5U/Ll)0.5μl、Total50.0μl。PCR反应条件为95℃预变性5min；94℃变性40s，51.3℃退火40s，72℃延伸1min，进行30个循环；72℃延伸10min。本发明具有检测速度快、检出率高、灵敏度高等优点。
文档编号C12Q1/04GK1974788SQ200510127340
公开日2007年6月6日 申请日期2005年12月16日 优先权日2005年12月16日
发明者李继昌, 霍贵成, 张铁男 申请人:东北农业大学