碳青霉烯类抗生素耐药基因检测dna芯片的制备和用图
【技术领域】
[0001] 本发明设及碳青霉締类抗生素耐药基因检测DNA巧片的制备和用途，属于基因巧 片检测技术领域。
【背景技术】
[0002] 碳青霉締类抗生素具有广谱、强效、对绝大多数0 -内酷胺酶高度稳定、对头抱菌 素耐药菌仍可发挥优良抗菌作用的特点。细菌对该类药物不存在交叉耐药性，因而碳青霉 締类抗生素对革兰氏阳性菌、阴性菌及厌氧菌都有强大的抗菌活性，是治疗危重感染或初 始抗生素治疗失败的复杂感染的常用抗菌药物之一。碳青霉締类抗生素在大多数情况下耐 受性良好，不良反应发生率较低，适用于严重的革兰阴性菌感染、混合感染、耐药菌感染和 免疫缺陷者感染，在抗菌治疗中基本处于最后一道防线的地位
[0003] 但随着广谱抗生素的广泛使用，世界各地陆续出现了产碳青霉締酶菌株感染造成 的暴发流行，给临床带来了极大的麻烦，因其对临床常用的广谱抗生素均耐药，由此引发的 感染往往无药可救，病死率极高。而且耐药菌株一旦无法及时清除，就有可能通过克隆传播 引起交叉感染，至造成院内感染的暴发流行。另外，由于肠杆菌科细菌对碳青霉締耐药主要 由质粒介导，耐药基因容易随质粒在不同菌种之间传播，造成耐药性的扩散。因此快速、准 确的早期诊断是预防及控制耐药株暴发流行、延缓耐药性的发展的关键。常见的碳青霉締 类耐药检测方法有纸片扩散法、稀释法、Etest(表型确认）、改良化dge实验、自动化药敏检 测（V口EK2系统、抓化oenix、ATB系统）等。但纸片扩散法和稀释法影响因素多，操作技 术误差大；Etest和自动化药敏检测价格昂贵，抗生素选择自由度差，不适用于基层临床单 位开展。基因巧片技术具有快速、准确、低成本等特点，适用于碳青霉締类抗生素耐药基因 的高通量检测。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于针对碳青霉締类抗生素耐药检测领域存在的一些不足，研制一 种高通量、特异、敏感、快速的碳青霉締类抗生素耐药基因检测DNA巧片，能同时检测九种 常见的碳青霉締类耐药基因，包括KPC、NDM-1、0XA-23、0XA-48、0XA-51、IMP、VIM、SIM、DIM， 为碳青霉締类抗生素耐药的临床诊断、表型确证及分子流行病学调查提供一种新的检测手 段。
[0005] 为了达到上述目的，本发明碳青霉締类抗生素耐药基因检测DNA巧片，其制备方 法如下：
[000引 1.步骤一：制备碳青霉締类耐药基因特异性引物
[0007]选择碳青霉締类耐药基因KPC、NDM-1、0XA-23、0XA-48、0XA-51、IMP、VIM、SIM、DIM作为检测基因，优选9对引物序列，如表1所示：
[000引表1弓I物序列及对应的扩增祀标 [0009]
【主权项】
1. 一种检测碳青霉烯类抗生素耐药基因的DNA芯片，本发明的基因芯片可以用于同时 检测耐药基因KPC、NDM-1、OXA-23、OXA-48、0XA-51、MP、SIM、VIM、DIM。其特征是包含检测 碳青霉烯类抗生素常见耐药基因的9对通用及特异性引物15条碳青霉烯类耐药基因特异 性寡核苷酸探针；1条片基质控探针和1条阴性对照探针和载体。上述探针分别分布在载 体上。 表1碳青霉烯类耐药基因扩增引物
表2碳青霉烯类耐药基因特异性寡核苷酸探针序列
2. 根据权利1所述的碳青霉烯类抗生素耐药基因检测DNA芯片，其特征是所述的载体 为醛基化修饰的玻璃片、硅片、聚苯乙烯基片、尼龙基片。
3. -种碳青霉烯类抗生素耐药基因检测DNA芯片的制备方法，包括以下步骤： 步骤一，探针和引物的设计：首先从NCBI基因数据库中下载碳青霉烯类耐药基因序 列，使用VectorNTIAdvancelO(invitrogen)软件包中的AlignX程序按照默认的参数设 置对各碳青霉烯类耐药基因序列进行全局比对。根据比对结果在基因序列的保守位置设计 特异性寡核苷酸探针、特异性引物。 步骤二，探针的合成，每条探针的3'端加入12个碱基T且3'末端T氨基修饰作为连 接臂，以使其能固定在醛基化修饰玻璃基片上；质控探针除3'末端T进行氨基修饰外，5'端 同时标记生物素标记； 步骤三，芯片的制备：将合成后的探针用去离子水稀释成100yM，分别取10yL探针溶 液，和10yL体积芯片点样液混匀，使探针点样终浓度为50yM，装于384孔板，将芯片表面 贴上10样品孔阵列膜，用芯片制备仪将探针点制在载体上，点样过程中保持一定湿度，点 样完成后将芯片置于干燥器中避光常温静置48h，使探针和芯片表面醛基共价结合，点制好 的芯片常温干燥保存。
4. 根据权利要求3所述的碳青霉烯类抗生素耐药基因检测DNA芯片的制备和用途的制 备方法，其特征是步骤一中15条特异性寡核苷酸探针及9对引物，探针长度在33-42nt，引 物长度在16-20nt。
5. 根据权利要求3所述的碳青霉烯类抗生素耐药基因检测DNA芯片的制备和用途的 制备方法，其特征是步骤三中所述的载体为醛基化玻璃片基或硅片、聚苯乙烯基片、尼龙基 片。
6. 碳青霉烯类抗生素耐药基因检测DNA芯片的制备和用途的使用方法，其特征是包括 以下步骤： 1) 步骤一，细菌基因组DNA的提取，采用核酸裂解液与样本按照1 : 1比例混合，提取 采用煮沸法，98°C水浴lOmin后置于4°C冰箱30min(期间每隔lOmin中晃动一下离心管）， 短暂离心，吸取上清液备用； 2) 步骤二，多重不对称PCR扩增：扩增使用多重PCR体系，将整个扩增体系分为A、B两 管。A管包括即(：、冊1-1、(《六-23、(《六-48、(《六-51、内标一出管包括頂?、￥]、5]、0]、内 标二。扩增按以下循环参数进行扩增：95°C预变性lOmin;95°C30s，55°C30s，72°C，60s，共 40个循环；72°C延伸5min;4°C保存或进行下一步实验； 3) 步骤三，芯片杂交：将基因芯片分别置0.2%SDS和去离子水中分别清洗30s，离心 干燥；将步骤二得到的扩增产物在98°C变性5min后立即置于冰浴中5min，取变性的A管产 物2. 5yL和B管产物2. 5.yL与5yL杂交液混匀，加于芯片加样孔使其均匀覆盖于阵列 表面，将基因芯片放入杂交盒内在45°C杂交lh; 4) 步骤四，杂交后清洗基因芯片：基因芯片杂交完成后，从杂交盒中取出芯片，并立即 依次在洗液1XSSC+0. 2%SDS、0. 2XSSC和0. 1XSSC中各清洗30s，最后将基因芯片表面 液体离心干燥； 5) 步骤五，样品标记：向芯片加入10yL标记液，用移液器涂匀后将芯片放回杂交盒中 置37°C水浴中反应30min，取出芯片以PBST清洗10s，离心干燥； 6) 步骤六，扫描：向芯片反应区加入刚刚1 : 1混合的化学发光液A和B的混合溶液， 用移液器涂匀后立即置化学发光成像仪中扫描，成像模式为触发模式，曝光参数511，增益 参数300,曝光时间10s，触发次数1次； 7) 步骤六，数据分析：成像结束后使用化学发光分析软件进行芯片探针信号分析。每 条探针的信号取其三个重复点的平均值，根据探针Cutoff值，探针信号值>该探针Cutoff 值的判读为该探针信号阳性。
7. 根据权利要求6所述的碳青霉烯类抗生素耐药基因检测DNA芯片的使用方法，其特 征是步骤二中使用的用于扩增各碳青霉烯类耐药基因的反向引物5'端进行修饰。
8. 根据权利要求7所述的反向引物5'端修饰分子可以是CY3、CY5、生物素。
9. 根据权利要求6所述的碳青霉烯类抗生素耐药基因检测DNA芯片的使用方法，其特 征是步骤三中使用的杂交液组分为8XSSC，0. 6%SDS，10%甲酰胺，lOXDenhardt。
10. 根据权利要求6所述的碳青霉烯类抗生素耐药基因检测DNA芯片的使用方法，其特 征是步骤六中使用的扫描方法，根据权利要求8中反向引物修饰分子的不同，扫描方法包 括荧光扫描，可见光扫描，化学发光成像。
【专利摘要】本发明涉及一种碳青霉烯类抗生素耐药基因检测DNA芯片的制备和用途，其制备方法包括制备九种碳青霉烯类耐药基因特异性引物，制备九种碳青霉烯类抗生素耐药基因特异性探针，制备寡核苷酸芯片，建立多重PCR体系，建立杂交体系。利用本发明制备的基因芯片可同时检测九种常见的碳青霉烯类耐药基因，包括KPC、NDM-1、OXA-23、OXA-48、OXA-51、IMP、VIM、SIM、DIM。该DNA芯片具有快速、准确、高通量、高特异的优势，可为碳青霉烯类抗生素耐药表型的耐药基因确认及分子流行病学调查提供一种新的检测手段。
【IPC分类】C40B50-18, C12Q1-68, C40B40-06
【公开号】CN104774941
【申请号】CN201510162146
【发明人】王升启, 宋燚, 刘琪琦, 陈苏红, 张敏丽
【申请人】中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所
【公开日】2015年7月15日
【申请日】2015年4月8日