一种检测细菌源性囊泡的方法和试剂

本技术涉及细菌源性囊泡检测，特别是涉及一种检测细菌源性囊泡的方法和试剂。

背景技术：

1、肠道菌群是人体肠道内微生物群落的总称。肠道菌群包含几百甚至上千种不同的微生物，其基因总数是人类基因总数的100多倍。肠道菌群是近年来研究的热点和前沿，其在肠道进行局部相互信息交流、对宿主肠道生理、病理状态进行局部调控，因此肠道菌群又被称为人体的“新器官”。大量研究通过宏基因组分析证实，肠道菌群稳态与营养不良、肥胖症、糖尿病、阿尔兹海默病等全身性疾病息息相关，这提示着肠道菌群也有可能可以远程对宿主的其他器官和组织的生理、病理过程发挥关键调控作用。这些前期研究为肠道细菌与宿主跨物种之间相互作用具体机制及因果关系的探讨提供了科学依据。然而，为了更深入地理解肠道菌群与宿主生理、病理状态之间的内在联系，从肠道菌群与疾病的相关性聚焦到两者相互作用具体分子机制是本领域的重要发展趋势。

2、肠道细菌除了可通过毒力因子以及代谢产物(如短链脂肪酸)参与宿主疾病的发生发展外，近年来，越来越多研究表明，细菌分泌的细菌源性囊泡(bacterialextracellular vesicles,bevs)在细菌群体行为和跨物种间通讯起着重要的作用。bevs是直径范围在20～400nm的脂质双层囊状结构，内部除了包含有细菌母体的代谢产物、毒力因子等成分，还携带了大量与细菌母体相同的活性生物大分子。这些囊泡携带了丰富的生物信息，被认为是细菌与细菌之间、细菌与宿主之间相互作用的一个重要的新途径。在肠道细菌之间，它们可以通过bevs进行相互信号传递、毒力因子运输、dna转移等多种复杂的生物过程。然而，针对bevs在肠道细菌与宿主相互作用方面的研究，目前多局限于在体外实验水平验证bevs对人体细胞的功能调节。例如，致病菌bevs被证实能促进肠道免疫细胞分泌炎症因子；而益生菌bevs可以效调节肠道免疫细胞成熟并且能修复肠屏障功能损伤；更有学者发现bevs通过促进肠外器官器质性病变的发生发展。鉴于人体肠道菌群的巨大数量，其分泌的bevs能否以进入循环的方式参与肠道外的生理病理活动？若能进入，其进入循环的主要影响因素是什么？与肠道功能的相关性如何？这些科学问题的解答，将有望为肠道细菌远处传递信息研究提供全新思路。

3、然而，人体循环中bevs的研究，目前仍面临着巨大的技术挑战：1.循环中人源的evs与bevs皆为脂质双分子层结构，其大小、结构、及物理性质相似，目前缺乏对bevs特异且普适的生物标志物；2.血液成分复杂，总evs含量相对较低，若要将bevs从总evs中区别检测出来，亟需高灵敏、单颗粒精度的检测分析技术。已有研究通过高通量测序、elisa等常用的技术对人体循环中的总evs进行检测分析，初步发现人体循环的总evs中含有细菌源性的产物。然而，这些方法仅可实现对evs样本中靶分子的总量进行检测与分析，不仅无法排除循环中免疫细胞吞噬细菌而残留的细菌片段的干扰；更重要的是，这些方法仍无法对循环中的bevs进行单颗粒精度的定量分析，未能为循环中稳定存在bevs提供直接的证据。因此，寻找合适的bevs特征性标志物，建立灵敏、特异且可实现单颗粒精度的bevs检测分析技术对探究生物体内bevs潜在作用至关重要。

技术实现思路

1、本技术的目的是提供一种新的检测细菌源性囊泡的方法和试剂。

2、为了实现上述目的，本技术采用了以下技术方案：

3、本技术的一方面公开了一种检测细菌源性囊泡的方法，包括将待测囊泡样本溶液与荧光探针混合，恒温孵育，离心获得囊泡沉淀，用缓冲液将囊泡沉淀重悬；采用生物颗粒检测平台分析重悬的囊泡溶液中与荧光探针结合的囊泡的数量和占比，即细菌源性囊泡的数量和占比；其中，荧光探针为荧光标记的脂多糖抗体和荧光标记的脂磷壁酸抗体。本技术中，脂多糖抗体是能够特异性的识别和结合脂多糖(lipopolysaccharide,lps)的抗体，脂磷壁酸抗体是能够特异性的识别和结合脂磷壁酸(lipoteichoic acid,lta)的抗体。

4、需要说明的是，本技术创造性的采用荧光标记的脂多糖抗体和荧光标记的脂磷壁酸抗体作为荧光探针，特异性的对细菌源性囊泡进行荧光标记，然后采用生物颗粒检测平台分析样本中的总evs数量和荧光标记的evs数量，以及荧光标记evs占总evs的占比，该荧光标记的evs数量和占比，即细菌源性囊泡的数量和占比。本技术的检测方法，不仅能够准确无误的检测细菌源性囊泡数量及其占比，还能够精确的对单颗粒的细菌源性囊泡进行检测和统计，灵敏度高、特异性强，能够作为循环中稳定存在bevs的直接证据，为探究生物体内bevs及其作用提供了一种新的方案和途径。

5、本技术的一种实现方式中，每107-109颗粒的待测囊泡对应添加4-6μg荧光探针。

6、需要说明的是，本技术的检测方法中，荧光探针的作用是特异性的识别和标记细菌源性囊泡；原则上需要加入充分过量的荧光探针，以确保所有细菌源性囊泡都被有效识别和标记。因此，本技术优选的每107-109颗粒的待测囊泡对应添加4-6μg荧光探针。可以理解，根据具体的待测囊泡样本中囊泡的数量，可以在该比例范围内进行适当调整，只要能够确保所有细菌源性囊泡都被有效识别和标记即可。

7、本技术的一种实现方式中，恒温孵育的温度为35-40℃。

8、优选的，恒温孵育的时间为10-30min。

9、需要说明的是，本技术的检测方法中，恒温孵育的作用是使荧光探针能够有效的识别和标记细菌源性囊泡，即使脂多糖抗体和脂磷壁酸抗体能够有效的结合在脂多糖和脂磷壁酸上。

10、本技术的一种实现方式中，恒温孵育后的离心条件为，2-8℃，95000-160000g离心35-70min。

11、需要说明的是，恒温孵育后的离心主要是为了使囊泡被离心沉淀，以此方法去除溶液中过量的荧光探针，以确保后续检测的准确性；可以理解，基于这样的考虑，如果在后续检测时荧光背景仍然很强，可以进一步的采用缓冲液对沉淀进行至少1次清洗，然后采用相同的离心条件进行离心获得沉淀用于后续检测。

12、本技术的一种实现方式中，缓冲液为pbs或生理盐水。

13、需要说明的是，本技术采用的缓冲液一方面主要是为了确保囊泡的稳定性，使其不被破坏；另一方面，主要是为后续生物颗粒检测平台检测提供溶液环境。因此，原则上能够满足以上两者的缓冲液都能够用于本技术，不仅限于pbs或生理盐水。

14、本技术的一种实现方式中，生物颗粒检测平台为纳米流式检测仪。

15、需要说明的是，纳米流式检测仪只是本技术的一种实现方式中具体采用的生物颗粒检测平台，原则上，只要能够准确有效的对囊泡和荧光标记囊泡进行区分检测的生物颗粒检测平台都能够用于本技术，不仅限于纳米流式检测仪。例如，exocounter、nanoview等全自动外泌体荧光检测分析系统，也可以用于本技术。

16、本技术的一种实现方式中，本技术的检测方法还包括设置所述生物颗粒检测平台的检测阈值，检测重悬的囊泡溶液中40-1000nm的囊泡。

17、需要说明的是，本技术的待测囊泡样本溶液，实际上是从血清、血浆、漱口液、脑脊液、胸腹水、尿液、肺泡灌洗液、脓液、宫颈拭子或粪便样本中分离获得，在分离囊泡时就已经通过离心、过滤等方式去除了大量的非囊泡的细胞碎片或颗粒；因此，待测囊泡样本溶液中已经可以确保就是需要检测的囊泡。通过设置阈值检测40-1000nm的囊泡，仅仅是为了进一步确保检测的准确性。

18、本技术的一种实现方式中，荧光标记可重复的选自alexa fluor 488、二氢罗丹明123、四甲基罗丹明-6-马来酰亚胺、四甲基罗丹明-5-马来酰亚胺、5-吲哚乙酰氨基荧光素、6-羧基-2'4,7,7-四氯荧光素琥珀酰亚胺酯、双[nn-双(羧甲基)氢甲基]荧光素四钠盐、荧光素-5-马来酰亚胺、5-异硫氰酸荧光素尸胺、磺基罗丹明g、7-羟基-4-甲基香豆素、3-氰基-7-羟基香豆素、荧光素二钠盐fluorescein荧光素、6-荧光素氨基磷酸酯、四甲基罗丹明-6-异硫氰酸、6-羧基-x-罗丹明琥珀酰亚胺酯、5-羧基-x-罗丹明琥珀酰亚胺酯、6-羧基-x-罗丹明、5-羧基四甲基罗丹明琥珀酰亚胺酯、6-羧基四甲基罗丹明、5-羧基四甲基罗丹明、6-羧基罗丹明6g、异硫氰酸荧光素、6-羧基荧光素琥珀酰亚胺酯、5-羧基荧光素琥珀酰亚胺酯、5-羧基荧光素、6-羧基荧光素、罗丹明b、罗丹明6g、7-氨基-4-甲基香豆素、cy3或cy5。

19、需要说明的是，本技术采用的荧光标记主要是为了将细菌源性囊泡区分开来，原则上只要能够对抗体进行修饰，不影响抗体和抗原结合，且荧光标记自身不会对囊泡进行非特异性的染色，必须通过抗体和抗原结合才能染色，这样的荧光标记都能够用于本技术。至于脂多糖抗体和脂磷壁酸抗体两者的荧光标记可以相同，也可以不同，这可以根据检测平台或者检测需求而定。如果两者的荧光标记相同，则无法区分革兰阴性菌和革兰阳性菌分泌的bevs；如果两者的荧光标记不同，则可以区分脂多糖抗体特异性结合的bevs和脂磷壁酸抗体特异性结合的bevs。

20、本技术的一种实现方式中，待测囊泡样本溶液由血清、血浆、漱口液、脑脊液、胸腹水、尿液、肺泡灌洗液、脓液、宫颈拭子或粪便样本中分离获得。

21、本技术的一种实现方式中，血清或血浆中分离待测囊泡样本溶液的方法包括，将血清或血浆与缓冲液混合，4℃，200-500g离心5-20min，取上清液、弃沉淀；上清液在4℃，1000-3000g离心15-30min，取上清液、弃沉淀；上清液在4℃，9000-15000g离心15-40min，取上清液、弃沉淀；上清液在4℃，95000-160000g离心10-45min，弃上清液；沉淀采用缓冲液重悬，即获得待测囊泡样本溶液。

22、本技术的一种实现方式中，漱口液或脑脊液采用exo-spin尺寸排阻层析柱分离囊泡，最后采用缓冲液洗脱收集囊泡组分，即获得待测囊泡样本溶液。

23、本技术的一种实现方式中，胸腹水中分离待测囊泡样本溶液的方法包括，将胸腹水样本1000-3000g，4℃离心10-30min，取上清液、弃沉淀；上清液9000-15000g，4℃离心15-40min，取上清液、弃沉淀；上清液在4℃，95000-160000g离心0.5-1.5h，弃上清液；沉淀采用缓冲液重悬，即获得待测囊泡样本溶液；或者进一步的，对重悬液在4℃，95000-160000g离心0.5-1.5h，弃上清液，沉淀再次采用缓冲液重悬，作为待测囊泡样本溶液。

24、本技术的一种实现方式中，尿液中分离待测囊泡样本溶液的方法包括，未添加蛋白酶或核酸酶抑制剂的尿液样本在采集后72h内进行离心处理，具体包括，将尿液样本于1000-3000g，4℃离心5-20min，取上清液、弃沉淀；上清液于3000-4000g，4℃离心10-25min，取上清液、弃沉淀；上清液在4℃，95000-160000g离心1-3h，弃上清液；沉淀采用缓冲液重悬，即获得待测囊泡样本溶液。

25、本技术的一种实现方式中，肺泡灌洗液中分离待测囊泡样本溶液的方法包括，肺泡灌洗液中加入缓冲液，在4℃下以1000-2000g离心5-15min，取上清液、弃沉淀；上清液使用带有0.2μm滤膜的无菌瓶顶过滤器进行过滤；滤液在4℃，95000-160000g离心1-3h，弃上清液；沉淀采用缓冲液重悬，即获得待测囊泡样本溶液。

26、本技术的一种实现方式中，脓液中分离待测囊泡样本溶液的方法包括，将浸泡有脓液的纱布用缓冲液浸湿，在4℃下孵育1-3h，将脓液从纱布中挤压出来，对挤压出来的脓液进行200-400g，4℃离心10-30min，取上清液、弃沉淀；上清液以1000-3000g，4℃离心10-30min，取上清液、弃沉淀；上清液于9000-15000g，4℃离心15-40min，取上清液、弃沉淀；上清液以95000-160000g，4℃离心0.5-1.5h，弃上清液；沉淀采用缓冲液重悬，即获得待测囊泡样本溶液。

27、本技术的一种实现方式中，宫颈拭子中分离待测囊泡样本溶液的方法包括，采用缓冲液浸润宫颈拭子，将悬液以600-1000g，4℃离心3-10min，取上清液、弃沉淀；上清液于1000-3000g，4℃离心10-30min，取上清液、弃沉淀，重复该步骤至少一次；上清液以95000-160000g，4℃离心1.5-2.5h，弃上清液；沉淀采用缓冲液重悬，即获得待测囊泡样本溶液。

28、本技术的一种实现方式中，粪便中分离待测囊泡样本溶液的方法包括，采用缓冲液悬浮粪便样本，以2000-4000g，4℃离心5-15min，收集上清液；采用缓冲液对沉淀再次进行重悬，以2000-4000g，4℃离心5-15min，再次收集上清液；合并两次上清液，使用定量滤纸过滤以去除残留物，获得滤液；滤液于9000-15000g，4℃离心15-40min，取上清液、弃沉淀；上清液通过0.22μm滤膜过滤，收集滤液；滤液以95000-160000g，4℃离心1.5-2.5h，弃上清液；沉淀采用缓冲液重悬，即获得待测囊泡样本溶液。

29、本技术的另一面公开了一种检测细菌源性囊泡的试剂，包括荧光探针，该荧光探针为荧光标记的脂多糖抗体和荧光标记的脂磷壁酸抗体。

30、需要说明的是，本技术的细菌源性囊泡检测试剂，实际上就是把本技术的细菌源性囊泡检测方法中使用的荧光标记的脂多糖抗体和荧光标记的脂磷壁酸抗体作为试剂的主要成分；因此，脂多糖抗体和脂磷壁酸抗体的具体荧光标记可以参考本技术的检测方法，在此不累述。可以理解，为了方便使用，本技术的试剂中还可以包括其他的辅助成分，例如pbs等缓冲液，在此不做具体限定。

31、还需要说明的是，本技术的细菌源性囊泡检测试剂，能够简单方便的对待测囊泡样本溶液中的细菌源性囊泡进行特异性的荧光标记，再结合生物颗粒检测平台，能够实现对细菌源性囊泡的单颗粒精度的检测和分析。本技术的试剂能够灵敏度高、特异性强从待测囊泡样本溶液中区分检测细菌源性囊泡，对探究生物体内bevs的作用至关重要。

32、本技术的再一面公开了荧光标记的脂多糖抗体和荧光标记的脂磷壁酸抗体在制备细菌源性囊泡检测的试剂中的应用。

33、需要说明的是，脂多糖和脂磷壁酸分别是革兰阴性菌和革兰阳性菌的细胞壁成分，本技术研究发现，其能够稳定且特异性的存在于革兰阴性菌和革兰阳性菌分泌的bevs；因此，本技术创造性的提出，将其用于细菌源性囊泡检测，并提出通过荧光标记的方式，即荧光标记的脂多糖抗体和荧光标记的脂磷壁酸抗体，实现bevs从待测囊泡样本中区分检测。

34、由于采用以上技术方案，本技术的有益效果在于：

35、本技术的细菌源性囊泡检测方法，采用特异性识别和结合细菌源性囊泡的荧光标记的脂多糖抗体和荧光标记的脂磷壁酸抗体，对细菌源性囊泡进行单颗粒精度的检测和分析，不仅检测灵敏度高、特异性强；而且检测方法简单、易操作。本技术的检测方法，为探究生物体内bevs及其作用提供了一种新的方案和途径。