一种高效液相-质谱法检测全血中吲达帕胺的方法与流程

本发明涉及药物生物检测，尤其涉及一种高效液相-质谱法检测全血中吲达帕胺的方法。

背景技术：

1、吲达帕胺(indapamide)，是一种带有吲哚环的磺胺衍生物，具有利尿和钙拮抗作用，是新型的抗高血压药物，对血管平滑肌的选择性比较高，可以降低血管外周阻力；还可以通过抑制肾皮质稀释段对钠的重吸收，增加尿钠和尿氯的排出量，发挥抗高血压作用。服用2.5mg剂量后，药物达到峰值血药浓度的时间为1至2小时。吲达帕胺在体内广泛分布，与红细胞结合率高达80％，与血浆蛋白结合率大于75％，因此临床中经常从全血中提取吲达帕胺用于药代动力学考察。

2、近年来曾有研究者采用lc-ms/ms的高通量检测方法从200μl全血样品提取待测物吲达帕胺。具体操作为：于200μl全血样品中加入20μl内标(吲达帕胺-d3)，200μl 0.2m硫酸锌水溶液，涡旋混匀30s后加入4ml乙醚，涡旋混匀3min。然后样品在2080g下离心3min，并在-70℃条件下冷冻10min。分离有机层并在氮气流下吹干。然后加入2ml甲醇和7.5mm乙酸铵水溶液(70：30)复溶，涡旋混合30s，取20μl进样考察。

3、lc-ms/ms的高通量检测方法，缩短了样本检测的时长，提高了检测的灵敏度。但是该方法对血液需求量比较大，每次处理都需要200μl血液样品，这就要求临床采血时需要增加采血量，对受试者的身体来说也增加了伤害；该方法萃取剂使用量较大，需要加入4ml乙醚萃取，试剂使用成本较高；该方法前处理时间也较长，步骤复杂，过长的处理时间不利于样品大批量检测，增加了检测时间成本；该方法进样量比较大，需要20μl复溶液进样考察，大的进样量会增加仪器被污染的几率。

技术实现思路

1、为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种灵敏度高、检测时间短的全血中吲达帕胺的检测分析方法；

2、为实现上述目的，本发明采用如下技术方案:一种高效液相-质谱法检测全血中吲达帕胺的方法，具体包括以下步骤：

3、s1.全血样品预处理：

4、将全血样品在室温黄光下融化，涡旋混匀后吸取一定量样品于连排管中，加入内标工作液、细胞皱缩剂、ph调节剂，涡旋混匀；加入萃取剂，涡旋后，在4℃条件下离心，取上清液至进样套管中，氮气吹干；向进样套管中加入复溶液进行复溶、涡旋，即得待测样品溶液。

5、s2.标准曲线样品配制：

6、称取一定量的吲达帕胺对照品于棕色玻璃瓶中，加入甲醇溶解，制成标准对照品储备液，于-15℃至-30℃的冷冻冰箱中保存，备用。

7、将标准对照品储备液用稀释液进行稀释，配制成一系列浓度的标准曲线工作液。

8、取标准曲线工作液，加入空白全血，混合均匀，制得具有浓度梯度的吲达帕胺标准曲线溶液。

9、s3.lc-ms/ms测定：

10、分别取样品溶液和吲达帕胺标准曲线溶液，采用液相色谱-串联质谱法进行定性或定量检测。

11、其中，s1和s2步骤无先后顺序。

12、优选地，所述s1样品预处理过程中，用到的全血量为50μl。

13、优选地，s1步骤中，所述细胞皱缩剂选用0.2m硫酸锌溶液。

14、优选地，s1步骤中，所述ph调节剂选用饱和碳酸氢钠溶液。

15、本发明中，采用0.2m硫酸锌高渗溶液作为细胞皱缩剂，可以使全血中红细胞皱缩，裂解，使吲达帕胺从红细胞中全部被释放出来，从而保证检测的准确性。由于吲达帕胺是一种碱性化合物，在血液样品中加入弱碱性ph调节剂，本发明选用饱和碳酸氢钠，不但可以稀释血液，克服血液粘滞性，还可以增加化合物离子化强度，提高提取回收率。

16、优选地，步骤s1中，所述内标工作液为溶有内标的50％甲醇水溶液，所述内标为吲达帕胺-d3。

17、优选地，所述内标工作液中吲达帕胺-d3的浓度为150ng/ml。

18、优选地，步骤s1中，所述萃取剂选用乙酸乙酯，乙酸乙酯的用量为500μl。

19、优选地，步骤s1中，所述复溶液为75％甲醇水溶液。

20、优选地，s1具体步骤为：将全血样品在室温黄光下融化后，涡旋混匀1min；吸取50.0μl样品于连排管中，加入20μl内标工作液、50μl细胞皱缩剂、50μlph调节剂，涡旋1min；再加入500μl乙酸乙酯进行液液萃取，涡旋5min，于4℃条件下，3700rpm离心5min，取上清液至进样套管中，氮气吹干；然后加入150μl75％甲醇水溶液复溶，涡旋2min，即得待测的样品溶液。

21、优选地，步骤s2中，所述稀释液为50％甲醇水溶液。

22、优选地，步骤s2中，所述标准对照品储备液的浓度为4mg/ml。

23、优选地，步骤s2中，所述吲达帕胺标准曲线溶液的浓度范围为2-220ng/ml。

24、优选地，步骤s3中，所述液相色谱的分析条件为：

25、色谱柱：c18柱；柱温：35-45℃；流速：0.2-0.7ml/min；进样量：3-8μl；流动相a为含0.02-0.08％甲酸的3-15mmol甲酸铵水溶液，流动相b为甲醇，进行梯度洗脱。

26、更优选地，步骤s3中，所述液相色谱的分析条件为：

27、色谱柱：shimadzu shim-pack giss-hp 3μm c18 2.1×50mm；柱温：40℃；流速：0.5ml/min；进样量：5μl；流动相a为含0.05％甲酸的10mm甲酸铵水溶液，流动相b为甲醇，进行梯度洗脱。

28、优选地，步骤s3中，所述梯度洗脱的条件为：

29、0-0.5min，90％流动相a，10％流动相b；0.5-1.5min，流动相a从90％降至10％，流动相b从10％升至90％；1.5-3min，10％流动相a，90％流动相b；3min-3.1min，流动相a从10％升至90％，流动相b从90％降至10％；3.1-4min，90％流动相a，10％流动相b。

30、优选地，步骤s3中，所述质谱条件为：

31、采用正离子电喷雾离子化多反应检测模式，离子源电压：5000v，离子源温度：500℃，气帘气：20psi，碰撞气：8psi，雾化气：50psi，辅助气：

32、50psi。

33、优选地，步骤s3中，所述多反应离子检测的参数设置为：

34、待测物吲达帕胺的参数设置：q1 mass：366，q3 mass：132，dwell：

35、200ms，ce：15v，dp：70v；内标吲达帕胺-d3的参数设置：q1 mass：

36、369，q3 mass：135，dwell：100ms，ce：10v，dp：70v。其中，待测物吲达帕胺和内标吲达帕胺-d3的子离子扫描图见图1和图2。

37、与现有技术相比，本发明的有益效果为：

38、1.本发明的检测方法中全血使用量为50μl，全血使用量较低，减少了受试者各个时间点的采血量，有利于临床试验的顺利进行；

39、2.本发明的检测方法中萃取剂的使用量为500μl，萃取剂的使用量较现有技术明显减少，有利于降低检测成本。

40、3.本发明的检测方法中加入细胞皱缩剂可以使全血中红细胞皱缩，裂解，从而使吲达帕胺从红细胞中全部被释放出来；ph调节剂的加入不但可以稀释血液，克服血液粘滞性，还可以增加化合物离子化强度；细胞皱缩剂和ph调节剂的加入，有利于提高吲达帕胺提取回收率。

41、4.本发明的检测方法中色谱分离运行时间短，进样量小，有利于提高检测通量，提高检测效率。

42、5.本发明可以实现对于全血中的吲达帕胺准确定性、定量检测，检测结果准确度高、精密度高、耗时短，可以有效应用于药代动力学和生物等效性研究。