一种食品中牛源性和羊源性乳铁蛋白定量检测的方法与流程

本发明涉及检测乳铁蛋白的，具体涉及一种食品中牛源性和羊源性乳铁蛋白定量检测的方法。

背景技术：

1、乳铁蛋白作为母乳乳清蛋白的重要组分，约占母乳乳清蛋白的50％，具有辅助新生儿建立免疫系统，降低婴幼儿感染风险的作用。因此，乳铁蛋白作为食品营养强化剂添加到婴儿配方食品中，是有很大需求的，国家标准gb 14880-2012食品安全国家标准食品营养强化剂使用标准中规定乳铁蛋白可作为营养强化剂添加到婴儿配方食品中，最大使用量1.0g/l。现有市售奶粉中含有乳铁蛋白的产品众多，截止2023年8月，市售奶粉中乳铁蛋白最高含量为468mg/100g。

2、目前，针对食品中的乳铁蛋白检测主要有酶联免疫法(elisa)、色谱法、色谱-质谱联用法(lc-ms)以及蛋白质电泳法(sds-page)。不同的检测技术因其特点不同，适应环境也所差别。elisa免疫法操作简单，但灵敏度低，对抗体依赖性强，并且同源蛋白容易存在交叉反应；sds-page是蛋白分析常用的电泳法，耗时长，重现性较差；液相色谱技术简便、快速，普及性强，但预处理需要采用肝素亲和柱纯化，其他蛋白依然存在干扰。乳制品尤其是婴幼儿配方食品作为复杂基质，采用色谱-质谱联用分析(lc-ms)具有很大的分析优势，色谱分离结合质谱确证，在乳蛋白检测中得到了广泛应用。但如今使用色谱-质谱联用法对婴幼儿配方食品等乳制品中乳铁蛋白定量检测时，依然存在以下缺点：(1)当下婴幼儿配方食品等乳制品中乳铁蛋白定量检测研究主要聚焦牛源性产品中乳铁蛋白定量检测，或采用牛源性乳铁蛋白特征肽段对其他种源乳品中乳铁蛋白进行定量测试，少有针对羊乳铁蛋白的定量检测方法。(2)lc-ms在乳蛋白检测中得到了广泛应用，但目前方法中蛋白质预处理复杂，耗时长，对操作人员要求高。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明提供了一种牛源性和羊源性乳铁蛋白定量检测的方法，所述检测方法能够用于区分牛源性和羊源性乳铁蛋白，且对样品预处理的方法进行了优化，利用乳铁蛋白结构松散的特性，采用了一步酶解法。

2、为解决背景技术中提出的技术问题，本发明采用以下技术方案：

3、第一方面，本发明中提供了一种食品中牛源性和羊源性乳铁蛋白定量检测的方法，所述检测方法包括以下步骤：

4、s1：向待测样品中加入缓冲溶液和胰蛋白酶溶液进行酶解，得到酶解液；

5、s2：采用液相色谱-串联质谱正离子模式测试s1中所述酶解液，并采用内标法定量乳铁蛋白的含量；

6、所述内标法中，牛乳铁蛋白特异性肽的氨基酸序列为dsalgflr，同位素标记牛乳铁蛋白特异性肽的氨基酸序列为dsalgfl*r；羊乳铁蛋白特异性肽的氨基酸序列为dsalgfvr；同位素标记羊乳铁蛋白特异性肽的氨基酸序列为dsalgfv*r，其中l*为[13c6,15n]-亮氨酸，v*为[13c5,15n]-缬氨酸。

7、具体地，所述牛乳铁蛋白特异性肽的氨基酸序列seq id no:1为dsalgflr；所述羊乳铁蛋白特异性肽的氨基酸序列seq id no:2为dsalgfvr。

8、进一步地，所述食品包括乳粉和液体乳中的至少一种。

9、进一步地，样品预处理中所述缓冲溶液为碳酸氢铵溶液，所述碳酸氢铵溶液的浓度为80～120mmol/l。

10、进一步地，所述样品预处理的方法为：向待测样品中加入缓冲溶液和胰蛋白酶溶液并混合均匀，在35～42℃下酶解2～8小时，酶解完成后加入甲酸终止反应，得到所述酶解液。

11、进一步地，所述s2中，色谱分离条件为：

12、色谱柱：pro-solution-c18多肽色谱柱；

13、流动相a为含有0.05～0.15％甲酸的水溶液；

14、流动相b为乙腈；流速为0.1～0.5ml/min；

15、柱温为20～50℃；进样量为1μl。

16、进一步地，色谱分离的梯度洗脱程序为：0～5min，95％～60％a相；5～5.1min，60％～0％a相；5.1～5.5min，0％a相；5.5～5.6min，0～95％a相；5.6～7.6min，95％a相。

17、进一步地，所述s2中，流动相a为含有0.1％甲酸的水溶液。

18、进一步地，所述s2中，质谱条件为：

19、离子化模式：电喷雾正离子(esi+)；

20、离子源温度：100～300℃；

21、毛细管电压：3.3～3.8kv；

22、脱溶剂气流量：500～800l/hr；

23、脱溶剂温度：400～500℃；

24、锥孔电压：10～30kv；

25、锥孔反吹气流量：100～200l/hr；

26、扫描模式：多反应检测。

27、进一步地，所述多反应检测的参数条件为：

28、所述牛乳铁蛋白特异性肽的氨基酸序列为dsalgflr，母离子的质荷比为439.7m/z，它的两个特征碎片离子分别为492.3m/z和605.4m/z，对应的碰撞能量均为15ev；

29、所述同位素标记牛乳铁蛋白特异性肽的氨基酸序列为dsalgfl*r，母离子的质荷比为443.2m/z，它的碎片特征碎片离子为499.3m/z，对应的碰撞能量为15ev；

30、所述羊乳铁蛋白特异性肽的氨基酸序列为dsalgfvr，母离子的质荷比为432.7m/z，它的两个特征碎片离子分别为478.3m/z和591.3m/z，对应的碰撞能量分别为10ev和15ev；

31、所述同位素标记羊乳铁蛋白特异性肽的氨基酸序列为dsalgfv*r，母离子的质荷比为435.7m/z，它的碎片特征碎片离子为484.3m/z，对应的碰撞能量为10ev。

32、进一步地，所述内标法定量乳铁蛋白的含量的方法为：

33、用所述牛乳铁蛋白特异性肽、同位素标记牛乳铁蛋白特异性肽、羊乳铁蛋白特异性肽和同位素标记羊乳铁蛋白特异性肽配制成系列浓度的标准工作曲线溶液，与所述酶解液在相同的色谱质谱条件下进行分离检测；

34、以所述牛乳铁蛋白特异肽和同位素标记牛乳铁蛋白特异性肽的峰面积比为纵坐标，以浓度为横坐标，建立线性回归方程，将所述酶解液中测得的牛乳铁蛋白特异肽和同位素标记牛乳铁蛋白特异性肽的峰面积比代入线性方程，可计算得到所述酶解液中牛乳铁蛋白特异肽的浓度，再根据牛乳铁蛋白特异肽的浓度计算得到所述酶解液中牛乳铁蛋白的含量；

35、以所述羊乳铁蛋白特异肽和同位素标记羊乳铁蛋白特异性肽的峰面积比为纵坐标，以浓度为横坐标，建立线性回归方程，将所述酶解液中测得的羊乳铁蛋白特异肽和同位素标记羊乳铁蛋白特异性肽的峰面积比代入线性方程，可计算得到所述酶解液中羊乳铁蛋白特异肽的浓度，再根据羊乳铁蛋白特异肽的浓度计算得到所述酶解液中羊乳铁蛋白的含量。

36、本发明的上述技术方案的有益效果如下：

37、本发明提供了一种食品中牛源性和羊源性乳铁蛋白定量检测的方法，所述检测方法包括以下步骤：s1：向待测样品中加入缓冲溶液和胰蛋白酶溶液进行酶解，得到酶解液；s2：采用液相色谱-串联质谱正离子模式测试s1中所述酶解液，并采用内标法定量乳铁蛋白的含量。

38、本发明中通过蛋白质理论研究和多肽筛选，筛选出了一组能够用于鉴别牛源性和羊源性乳铁蛋白的特异肽(牛乳铁蛋白特异肽dsalgflr/羊乳铁蛋白特异肽dsalgfvr)，可以用于检测牛羊乳中乳铁蛋白掺假情况。此外，本发明中的样品预处理不需要加入二硫苏糖醇和碘代乙酰胺，降低了操作的复杂程度，通过检测步骤的减少降低了结果的不确定度。