本发明涉及生物检测分析，具体涉及一种植物n-糖链的精准相对定量分析方法及应用。
背景技术：
：：1、糖基化是一种重要的蛋白翻译后修饰。通过多种糖基转移酶(gts)和糖基水解酶(ghs)的催化作用蛋白质与碳水化合物通过共价结合形成糖蛋白（strasser r, seifertg, doblin ms, johnson kl, ruprecht c, pfrengle f, bacic a, estevez jm.cracking the "sugar code": a snapshot of
n- and
o-glycosylation pathways andfunctions in plants cells. front plant sci. 2021 feb 19;12:640919. doi:10.3389/fpls.2021.640919. pmid: 33679857;）。蛋白n-糖基化是真核生物蛋白质糖基化修饰中最普遍的类型（apweiler r, hermjakob h, sharon n. on the frequency ofprotein glycosylation, as deduced from analysis of the swiss-prot database.biochim biophys acta. 1999 dec 6;1473(1):4-8. ），糖链连接在蛋白asn-x-ser/thr序列的天冬酰胺（asn）上（ser是丝氨酸，thr是苏氨酸，x是除脯氨酸以外的任何氨基酸）称之为n-糖链。按照不用的糖残基的组成和链接方式，n-糖链分为高甘露糖型、复杂型、杂合型和寡甘露糖型（lerouge p, cabanes-macheteau m, rayon c, fischette-lainé ac,gomord v, faye l. n-glycoprotein biosynthesis in plants: recent developmentsand future trends. plant mol biol. 1998 sep;38(1-2):31-48.）。
2、n-糖组学是对检测样品中所有n-糖链提取、纯化分离、检测分析以得到其结构组成和相对定量信息进行系统分析的新兴学科，以表征蛋白糖基化在生命活动过程动态变化规律（chau th, chernykh a, ugonotti j, parker bl, kawahara r, thaysen-andersenm. glycomics-assisted glycoproteomics enables deep and unbiased n-glycoproteome profiling of complex biological specimens. methods mol biol.2023;2628:235-263.）。随着技术发展，质谱高通量检测技术逐渐成为检测分析首要分析工具，所述质谱高通量检测技术是指检测时通过内标与待检测样品混合后比较质谱峰信号的相对强度，来反映样品中糖链的丰度比例，从而进行样品n-糖链的相对定量分析。所述相对定量分析是以混合在样品中的内标作为参照，反应不同待检测样品含量相对于同一个检测内标含量的倍数高低变化，以与内标不同的倍数关系反应不同样品之间的含量相对高低的定量方法，可消除因仪器检测等的误差影响，操作简便，可以反应n-糖链的含量变化情况。所述相对定量分析分为普通相对定量分析和所述精准相对定量分析，所述精准相对定量分析是指内标与样品的质量位移差＞3da，反之普通相对定量分析是指内标与样品的质量位移差≤3da。3、在植物体n-糖链定量分析体系中，植物体中叶、根、果实和花等多种组织部位富含色素物质，植物体中色素的种类多如花青素、叶绿素、类胡萝卜素等参与植物色泽品质调控和挥发性物质形成。色素对紫外光具有吸收度且为极性较高，检测时严重影响n-糖链的相对定量分析准确性，（garcía-gómez be, salazar ja, nicolás-almansa m, razi m,rubio m, ruiz d, martínez-gómez p. molecular bases of fruit quality in
prunusspecies: an integrated genomic, transcriptomic, and metabolic review with abreeding perspective. int j mol sci. 2020 dec 30;22(1):333. doi: 10.3390/ijms22010333. pmid: 33396946; pmcid: pmc7794732.），因此植物体n-糖链相对定量分析体系需要进行更加复杂的除杂纯化。同时细胞壁是植物体细胞含有特征结构，坚硬而厚实的支撑物其成分为黏质复合物，存在于细胞膜的外部，维持细胞形态能增强植物抵抗外力的机械强度，在n-糖链提取过程中，植物样品需要比动物更加严密的工序才能使样品混合均匀。因此，植物n-糖链的提取、纯化比动物体更难。在分析检测方面，目前在动物体中使用的检测分析方式是代谢标记和酶促18o标记与样品的质量位移差均≤3da，属于普通相对定量分析，存在精准性差、应用对象局限、细胞培养周期长、操作复杂的问题。目前代谢标记和酶促18o标记应用对象是动物体，所述代谢标记的应用对象是细胞样品，具体是将内标的细胞样品置于培养基中培养，在培养基中加入酰胺-15n 谷氨酰胺作为细胞培养物的唯一氮源，使其通过己糖胺途径掺入到糖链中，标记后的糖链与普通酰胺-14n 谷氨酰胺标记的糖链仅能形成1da质量位移差，需要较长的细胞培养周期且需要每天更换培养基操作复杂。(zhu y, wu j, chen x. metabolic labeling and imaging of n-linked glycans inarabidopsis thaliana. angew chem int ed engl. 2016 aug 1;55(32):9301-5. doi:10.1002/anie.201603032. epub 2016 jun 27. pmid: 27346875.) 。所述酶促18o标记产生的内标与待检测样品之间仅有2da质量位移差，与样品混合检测时易与待检测样品n-糖链本身的2～3da的同位素峰堆叠引入误差，相对定量分析的精准性很差(cao w, zhang w,huang j, jiang b, zhang l, yang p. glycan reducing end dual isotopic labeling(gredil) for mass spectrometry-based quantitative n-glycomics. chem commun(camb). 2015 sep 14;51(71):13603-6. doi: 10.1039/c5cc05365j. pmid:26240031.)。因此，基于代谢标记对检测样品状态的限制和酶促18o标记较小的质量位移差使得样品分析时存在较大干扰，导致相对定量分析的精准性差。
4、目前精准的n-糖链的提取、富集、和相对定量分析体系是基于动物体中的唾液酸残基修饰设计的，但由于植物n-糖链的构成与动物体有本质不同，植物中不含唾液酸残基，因此基于动物n-糖链的构成而设计的精准n-糖链相对定量方法，完全不适用于植物n-糖链且植物无法借鉴。因此建立植物体精准的同位素标记定量体系十分必要。植物与动物体的n-糖链的构成如图1所示，二者之间的区别具体在于以下2点：（1）植物复杂型n-糖链的n-乙酰氨基葡萄糖由α-1,3-岩藻糖和β-1,2-木糖残基修饰，而哺乳动物中是由α-1,6岩藻糖修饰。（2）在植物n-糖链末端位置含有末端lewis-a表位，即β-1,3-半乳糖和α-1,4-岩藻糖残基修饰，不被唾液酸残基修饰，而在哺乳动物中其末端通常被含有β-1,4 -半乳糖和α-1,3-岩藻糖的lewis-x表位，哺乳动物n-糖链末端被唾液酸残基修饰。（何金霞,贾晓晨,王文霞,等. 植物n-糖链检测技术研究进展[j]. 生物技术进展,2018,8(6):500-508. doi:10.19586/j.2095-2341.2018.0119.）。目前广泛研究基于唾液酸残基修饰设计的方法是因为唾液酸残基修饰的位置、连接方式和数量对白塞病、乳腺癌等多种疾病的表征有关，相关n-糖链的分析对于多种疾病的治疗研究具有重要的意义，而从生物进化的研究发现，无脊椎动物中没有参与唾液酸残基的生物合成、激活或转移的基因（angata t, varki a.chemical diversity in the sialic acids and related alpha-keto acids: anevolutionary perspective. chem rev. 2002 feb;102(2):439-69.）。因此，现有的基于唾液酸残基修饰而设计的n-糖链相对定量分析方法不适用于植物体，且植物体中n-糖链含量少且易受到植物体自身色素等杂质的干扰，导致植物体中n-糖基化的研究远远落后于动物体（feng y, multiplex quantitative glycomics enabled by periodate oxidationand triplex mass defect isobaric multiplex reagents for carbonyl-containingcompound tags. anal chem. 2019 sep 17;91(18):11932-11937；seo n,. isomer-specific monitoring of sialylated n-glycans reveals association of α2,3-linked sialic acid epitope with behcet's disease. front mol biosci. 2021 nov23;8:778851．）。5、目前没有精准的植物n-糖链的相对定量分析方法。现有的植物体n-糖链的分析方法，在不同批次、不同样品的相同n-糖链之间没有可对比性，无法对植物样品进行系统分析，例如无法对不同植物种类、不同组织部位、同一部位不同生长发育阶段的样品进行系统分析蛋白糖基化对植物生理功能调控作用。现有的植物n-糖链相对定量分析方法是归一化表征糖链丰度的非标定量方法(label free)，糖链丰度是指通过检测计算出样品中某个n-糖链峰面积与样品中所有n-糖链的峰面积累加值的占比来表征样品中不同n-糖链的含量。非标定量方法是指独立的检测样品中的n-糖链含量，没有与n-糖链内标组成样品组进行同时检测进行标准参照，因此非标定量方法仅能分析同一批次检测的样品中各糖链之间的相对丰度占比（choi, hy., park, h., hong, j.k.
et al.
n-glycan remodeling usingmannosidase inhibitors to increase high-mannose glycans on acid α-glucosidasein transgenic rice cell cultures.
sci rep 8, 16130 (2018); wang t, jia x, liul, voglmeir j. 2021. changes in protein
n-glycosylation during the fruitdevelopment and ripening in melting-type peach.
food materials research 1:2;），但是如果不同的多个样品检测分析时，比如不同植物种类的样品、不同组织部位的样品、同一部位不同生长发育阶段的样品检测等，由于不同批次检测时存在的仪器、检测环境、操作等不可避免的影响因素，导致在没有内标糖链参照的情况下，不同样品中的同一糖链的含量变化没有可对比性，多个样品的糖链含量无法进行比较分析，从而严重限制了蛋白糖基化对植物生理功能调控作用的研究。另一种比较准确的植物n-糖链相对定量分析方法是15n同位素定量的代谢标记法，如前所述代谢标记法具有精准性差、应用对象局限、细胞培养周期长、操作复杂的问题，无法进行广泛应用(orlando r, lim jm, atwood ja 3rd,angel pm, fang m, aoki k, alvarez-manilla g, moremen kw, york ws, tiemeyer m,pierce m, dalton s, wells l. idawg: metabolic incorporation of stable isotopelabels for quantitative glycomics of cultured cells. j proteome res. 2009aug;8(8):3816-23.)。
6、综上所述，植物样本提取纯化较动物体复杂且检测分析方式落后，目前没有一种精准的植物n-糖链相对定量分析的方法，现有技术中的代谢标记和酶促18o标记检测分析方式存在精准性差、应用对象局限、细胞培养周期长、操作复杂的问题；现有较为精准的n-糖链的相对定量分析方法是基于动物n-糖链的唾液酸构成而设计的相对定量分析方法，而植物中没有唾液酸，因此完全不适用于植物n-糖链且植物无法借鉴；目前使用的植物n-糖链非标定量分析方法存在培养周期长、无法进行不同样品中的同一糖链的含量变化分析的问题，严重限制了蛋白糖基化对植物生理功能调控作用的研究。技术实现思路1、针对现有技术存在的问题，本发明提供一种植物n-糖链的精准相对定量分析方法及应用，构建了一种有效分离纯化提取均匀的植物n-糖链，并引入-特定的植物n-糖链相对定量分析的样品组和植物n-糖链样品和植物双标签n-糖链内标(isotope internalstandard)相对定量分析组，使植物样品能充分混合均匀，提取不受植物体色素等杂质干扰，得到高效纯化富集的n-糖链，同时在检测分析中构建双标签内标检测，检测图谱中样品每一个n-糖链峰与其对应的内标峰成对出现，通过特定的相对定量分析公式获得具有可对比性的n-糖链含量，对每个样品的植物n-糖链含量实现精准定量，可以反映每个n-糖链在不同样品中相对含量的高低，因此本发明的n-糖链相对定量体系可对不同植物种类、不同组织部位和各个生长发育阶段中的不同类型、不同批次的植物样品进行所有n-糖链的含量变化的比较分析，所有n-糖链的含量变化分析不受仪器、检测环境、操作等不可避免的误差因素的影响，可用于植物关键n-糖链的筛选，可应用于探讨植物的生长发育等诸多生理过程中不同糖残基组成以及多种糖基化加工酶的调控作用，对于进一步阐明蛋白糖基化对植物生理功能调控作用十分重要。2、本发明提供了一种植物n-糖链的精准相对定量分析方法及应用，包括以下步骤：3、（1）构建植物n-糖链相对定量分析的样品组：所述样品组包括植物n-糖链样品和植物双标签n-糖链内标，其中，将待测的植物n-糖链粗样品经过分离、酶切、n-糖链释放、纯化步骤获得植物n-糖链样品，以获得植物n-糖链峰的质谱信号强度达到104及以上的检测图谱；将待测的植物n-糖链粗样品经过分离、酶切、n-糖链释放、双标签标记反应、纯化步骤获得植物双标签n-糖链内标，所述植物双标签n-糖链内标与植物n-糖链样品的质量位移差能达到5da及以上；4、（2）构建植物n-糖链样品和植物双标签n-糖链内标相对定量分析组：将所述植物n-糖链样品和所述植物双标签n-糖链内标混合检测以获得质谱图谱，基于图谱中植物n-糖链样品中每个n-糖链及其对应的植物双标签n-糖链内标的峰面积，建立不同样品中每个n-糖链与对应内标的峰面积的比值关系，从而反应不同样品中同一种n-糖链相对含量的高低。5、在本发明的一个具体实施方式中，所述n-糖链含量的相对定量分析的公式为：a1=na1/na1内标，a2=na2/na2内标，……an= nan/nan内标……；6、其中，a1、a2、……an分别是样品中1、2、……n个n-糖链峰的相对含量；na1、na2、……nan分别是样品中1、2、……n个n-糖链的峰面积，na1内标、na2内标、……nan内标是n-糖链内标中1、2、……n个n-糖链的峰面积；na1与na1内标 为图谱中质量位移差为5da的成对出现的n-糖链峰，在一对n-糖链峰中，质量小的为na1，质量大的为na1内标 。7、在本发明的一个具体实施方式中，所述纯化是指采用c18、pgc固相萃取柱纯化富集植物n-糖链。8、在本发明的一个具体实施方式中，所述双标签标记反应是指在所述n-糖链释放的同时先进行酶促同位素标记，在所述n-糖链释放完成后再进行氧化还原开环反应以获得5da质量位移差的植物双标签n-糖链内标。9、在本发明的一个具体实施方式中，所述双标签标记反应的步骤为将酶切后的多肽溶于h218o的酸性缓冲液中加入 pngase a，使n-糖链末端反应上18o标签；然后加入nabd4使n-糖链末端发生氧化还原开环反应，获得5da质量位移差的植物双标签n-糖链内标。10、在本发明的一个具体实施方式中，所述分离的方法为将待测的植物n-糖链粗样品采用配置的buffer y缓冲液提取植物总蛋白，使用甲醇、丙酮除去植物总蛋白中的色素杂质，获得植物蛋白。11、在本发明的一个具体实施方式中，所述酶切的方法为采用胰蛋白酶、糜蛋白酶酶切植物蛋白得到植物多肽样品。12、在本发明的一个具体实施方式中，所述n-糖链释放的方法为采用pngase a试剂对获得的植物多肽样品进行酶切释放植物n-糖链。13、在本发明的一个具体实施方式中，步骤（2）中，所述植物n-糖链样品和所述植物双标签n-糖链内标的溶液按体积比1∶1混合。14、在本发明的一个具体实施方式中，步骤（2）中，所述质谱图谱包括基质辅助激光解吸附电离质谱、电喷雾质谱、串级质谱、多级质谱中的任意一种或多种。15、进一步地，所述分离的方法具体包括：16、本发明将植物样品进行液氮冷冻并研磨成均匀粉末，于-80℃保存。称取0.5～5g植物样品，添加3～4倍体积蛋白提取液并进行涡旋。蛋白提取液组成为：1 m tris-hcl（ph=8.2），10%（
w/v）十二烷基硫酸钠（sds），1%（
v/v）β-巯基乙醇，0.5 m 乙二醇四乙酸（egta），0.5 m 乙二胺四乙酸（edta），0.1 m苯甲磺酰基氟化物（pmsf）和1x蛋白酶抑制剂混合物。涡旋后的混合液65 ℃水浴加热20mins，离心取上清液转移到新的试管，后加入等量的预冷苯酚缓冲液（ph=7.5～7.9），涡旋均匀后12,000 rpm离心15mins，去除上相水相。用50 mmtris-hcl（ph=7～9）缓冲液对下相有机相再次萃取洗涤两次，操作同上。后将苯酚相与5倍体积预冷的0.1 m乙酸铵meoh溶液混合，-20°c下放置过夜沉淀蛋白。所得蛋白沉淀依次用预冷的meoh和丙酮洗涤两次并进行冷冻干燥，获得总蛋白，-80°c保存；
17、进一步地，所述酶切的方法具体包括：18、将所得总蛋白溶解于3～4 ml 0.01 m tris-hcl缓冲液（ph=8）中，100℃加热5min使蛋白失活。在37℃下加入0.01 m tris-hcl 配置30 mg/ml trypsin、30 mg/mlchymotrypsin和0.2 m cacl2，反应16 h，将蛋白酶切为多肽。反应结束后，100～120℃加热5 min使酶失活。5000 rmp常温离心5min，取上清液用nanodrop检测多肽浓度，定量1～3 mg多肽含量，最高30~45℃将定量后的多肽旋转蒸干。19、进一步地，所述双标签标记反应的方法具体包括：20、将蒸干后的多肽复溶于溶剂为h218o的0.1～1 m ph=4.0的酸性缓冲液中，加入2.5～5 u/g fw pngase a于37 ℃反应24 h，使从n-糖肽中酶切下的n-糖链末端反应上18o标签。反应结束后，100℃加热5 min使酶失活。加入0.2～0.3 mmol的nabd4，65℃反应2h，n-糖链末端发生氧化还原开环反应。与未加标签的n-糖链相比，n-糖链标签共增加5da质量位移差。21、进一步地，所述纯化的方法具体包括：使用c18固相萃取柱纯化n-糖链，pgc柱富集n-糖链,真空旋蒸后，于20～25 μl h2o复溶。22、本发明还提供一种如前所述的方法在植物n-糖组学中的应用，所述应用的方法为：23、（1）将不同的样品分别通过所述的植物n-糖链的精准相对定量分析方法获得n-糖链的相对定量数据；24、（2）将所有样品中相同n-糖链的相对定量数据进行比较分析，所述相同n-糖链是指所有样品在检测图谱中具有相同的质量位移且误差为±0.4以内的n糖链，以满足显著性差异(significant difference)
p<0.05筛选差异n-糖链，分析差异n-糖链对植物生理过程调控的作用。所述显著性差异是对数据差异性的评价，可通过t检验（student t-test）方法计算得到。
25、进一步的，本发明还提供一种如前所述的方法在果实成熟研究中的应用；优选的，所述果实为番茄；26、进一步的，在番茄果实成熟研究中的具体应用步骤如下：27、1）通过将绿熟期(img)、破色期（br）、破色15天后红熟期（br15）发育阶段的番茄果实各设置三个生物学重复，每个生物学重复取9个无机械伤、无病虫害大小均匀的番茄果实，提取n-糖链，破色期番茄果实制备检测内标；28、2）将待检测番茄果实样品与内标样品等比例混合后，使用n-糖链结构分析鉴定软件glycomod鉴定含有等质量位移差的一对糖链峰，其中质量小的为待检测n-糖链，另一个产生5da质量的为该糖链定量内标峰。得到相对定量值后，将所有检测样品中相同n-糖链相对定量进行比较分析，以满足
p<0.05筛选差异n-糖链；
29、进一步地，所述步骤2）中，具体包括：30、n-糖链检测基质使用溶于甲醇的0.01 m的 2,5-二羟基苯甲酸，检测仪器为配备smartbeam nd:yag (355 nm)激光器的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(ulraflextremetm maldi-tof/tof ms) 上以正离子模式进行检测。靶板采用384抛光板（mtp 384 polished steel），质谱数据分析采用bruker flexanalysis 3.4，通过鉴定3个番茄发育阶段样本中成熟相关特异性多糖的变化，鉴定出18个n-糖链，本发明筛选出与番茄果实发育成熟过程中以
p<0.05为筛选条件，筛选出丰度显著上调的7种标志性n-糖链（h2n2f1x1、h3n2f0x1、h3n2f1x0、h3n2f1x1、h4n2f0x1、h7n7f0x0、h3n4f1x1），在分析n-糖基化对植物生理过程调控有十分重要的作用。
31、本发明的有益效果如下：32、（1）本发明所述的植物n-糖链相对定量分析的方法，构建了特定的植物n-糖链相对定量分析的样品组和植物n-糖链样品和植物双标签n-糖链内标相对定量分析组，使检测图谱中样品每一个n-糖链峰与其对应的内标峰成对出现，通过特定的相对定量分析公式获得具有可对比性的n-糖链含量，对每个样品的植物n-糖链含量实现精准定量，可以反映每个n-糖链在不同样品中相对含量的高低，可对不同植物种类、不同组织部位和各个生长发育阶段中的不同类型、不同批次的植物样品进行所有n-糖链的含量变化的比较分析，所有n-糖链的含量变化分析不受仪器、检测环境、操作等不可避免的误差因素的影响，可用于植物关键n-糖链的筛选，可应用于探讨植物的生长发育等诸多生理过程中不同糖残基组成以及多种糖基化加工酶的调控作用，对于进一步阐明蛋白糖基化对植物生理功能调控作用十分重要。33、（2）本发明所述的方法通过对番茄成熟过程中n-糖链相对定量分析，筛选出与果实成熟相关的关键n-糖链，从而提高果实品质延长采后贮藏期限，减少经济损失。当前第1页12当前第1页12