专利名称：:利用原子力显微镜的生物分子相互作用的制作方法
技术领域：
：本发明主要涉及原子力显微镜(AFM)、用于AFM的悬臂以及利用原子力显微镜测量生物分子之间的分子间相互作用的设备和方法。本发明涉及树枝状大分子涂布的Bio-AFM针尖在测定生物分子之间相互作用时的用途。本发明还提供了通过利用具有可控中间间隔的表面进行细胞受体的Bio-AFM(生物原子力显微镜)作用力作图的细节。
背景技术：
：在后基因组时代，为了药物发现以及疾病诊断和预防的目的，对基因组的定量和全面研究是快速成长的研究和发展领域。这些方面的发展已经形成了对具有高度敏感性和优良特异性的先进的生物分子识别探针的强烈需求(K.Wangetal.Anal.Chem.76,57212004)。在多种生物分子识别研究中，理解互补DNA链的机械稳定性(或识别特性)对于深入理解多个重要的生物过程例如DNA转录、基因表达和调节以及DNA复制都很关键。在这个方面，已经利用多种技术例如光镊子、微吸量管抽吸和AFM等研究了拉伸和力诱导的DNA角军链(H.Clausen-Schaumann,M.Seitz,R.Krautbauer,H.E.Gaub,Curr.0pin.Chem.Biol.4,524，2000;R.Merkel，PhysicsReports346，343，2001;G.U.Lee，LA.Chris，R.J.Colton，Science266，771，1994)。由于能够在几皮牛顿力之下，以较小的长度尺度和较高的敏感性测定单个分子之间的特异性相互作用，AFM正成为一个快速发展的技术，用于在分子水平探测亲和力和识别性能(R.Krautbauer,M.Rief,H.E.Gaub,NanoLett.3,493,2003)相比于其他用于力测定的敏感方法，AFM具有较高力分辨率和较高空间分辨率的优势，且可在生理条件下操作，用于研究生物过程中的特异相互作用，例如静电相互作用(J.Wang，A.J.Bard,Anal.Chem.73,2207,2001)、配体-受体结合(S.M.Rigby-Singletonetal.，J.Chem.Soc.,PerkinTrans.21722,2002)、抗原-抗体相互作用(F.Schwesingeretal.,Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.97，9972，2000)、核酸适体-蛋白相互作用(C.Baietal.，Anal.Chem.75，2112，2003)、蛋白质折叠/去折叠(P.M.Williamsetal.,Nature422，446，2003;M.S.Ζ.Kellermayer,S.B.Smith,H.L.Granzier,C.Bustamante,Science276,1112,1997)、细胞-细胞黏附(M.Benoit,D.Gabriel,G.Gerisch,H.E.Gaub,NatureCellBiol.2,313,2000)以及DNA-DNA杂交(C.ff.Frank,Biophys.J.76，2922，1999)。尽管实施了多个对互补DNA链之间的解链力测定的研究(H.Clausen-Schaumann,M.Seitz,R.Krautbauer,H.E.Gaub,Curr.0pin.Chem.Biol.4,524,2000；R,Merkel,PhysicsReports346，343，2001；G.U.Lee,L.A.Chris,R.J.Colton,Science266，771.1994；R.Krautbauer,M.Rief,H.E.Gaub,NanoLett.3,493,2003)，在单分子水平的研究过程中，DNA链之间的识别依然存在问题。通常的固定途径经受多点相互作用，分辨出单分子相互作用尚不是一个容易的任务。为了避免不需要的相互作用，可通过与惰性的表面活性剂混合而降低表面密度，但该途径导致较低的识别效率，从而得到可靠性较低的分析。因此，通常用于这种固定所使用的表面化学例如氧化物-硅烷和金-硫醇化学(T.Hugel,M.Seitz,Macromol.Rapid.Commun.22,989,2001；ff.K.Zhang,X.Zhang,Prog.Polym.Sc1.28,1271,2003)尚未优化为可纠正在利用AFM的力测定过程中单个DNA-DNA相互作用中的无价值基础信息。传统上，原子力显微镜在理解生物体内存在的生物分子之间的多种相互作用机制中发挥重要作用。尽管其能够分析相互作用力，随着在分子水平上开展了越来越多的研究，预期未来其在纳米和生物
技术领域：
：内的重要性将会增加。利用该技术的优势，已经努力研究不同表面上生物分子之间的相互作用机制。然而，与液体不同，观察表面上的生物材料产生了独特的问题，例如不随意吸收和空间位阻。在解决这种问题所采取的多种措施中，最常用的措施涉及到通过将复合自组装膜涂布于表面上而测定单分子相互作用。当用AFM观察两个生物分子之间的单一相互作用力时，遇到了两个问题。第一个问题涉及表面上生物分子活性与机体内部相比的差异。第二个问题围绕这样一个事实，即在这种情况下不能保证单分子相互作用。先前的研究表明两个问题均可利用自组装膜技术和中间间隔控制技术得到解决(Langmuir2005，21，4257，WO2006/016787)。所述技术涉及通过限制官能团(其上可引入所述分子)的数目而控制生物分子的间隔和数目，从而在单分子水平上观察分子间相互作用。该方法最常见的问题涉及导致相分离的相同官能团的分子之间的非期望的吸引。此外，没有具体的证据表明生物分子彼此之间是平均间隔的。利用BiO-AFM技术的生物分子研究的重要性正在迅速增长，BiO-AFM能够在支持生物活性的液体环境中观察非传导性物质例如纳米水平的生物分子的能力，已经使Bio-AFM成为一种研究生物分子的结构和亚结构的重要工具。此外，Bio-AFM使得可以通过它的Bio-AFM针尖近距离观察分子相互作用，生物分子可加载于所述针尖上。重要的应用包括观察互补DNA分子之间的相互作用、蛋白质之间的相互作用、配体-受体相互作用，后者在研究对药物的免疫反应中具有显著意义。在单分子水平上研究生物分子之间的相互作用力时，高敏感性是最重要的。单分子观察可以通过诸如Bio-AFM、光镊子和磁镊子等方法实现。每一种方法均有其缺点，例如磁镊子方法缺乏准确性，光镊子方法则可招致对分子的潜在损伤。为了利用Bi0-AFM研究配体-受体机制，需要将配体加载于所述针尖的顶端。通常这可利用生物素-抗生物素蛋白链菌素相互作用或利用复合自组装膜而实现。然而，这些方法不能直接控制分子距离，而且可引起配体在某个区域聚集，使得准确观察配体-受体相互作用比较困难。
发明内容本发明的一个目的是提供用于原子力显微镜(AFM)的悬臂，所述原子力显微镜包括具有固定端和自由端的悬臂体，所述自由端具有的表面区域可用树枝状大分子进行化学修饰，其中所述树枝状大分子分支区的多个末端均结合于该表面，树枝状大分子的线性区的末端被功能化。本发明的另一个目的是提供用于AFM的悬臂，其中在线性官能团之间，所述树枝状大分子以约0.1nm和约IOOnm之间的固定间隔隔开。尤其是,所述树枝状大分子以约IOnm的固定间隔隔开。本发明的进一步目的是提供用于制造悬臂的方法，包括(i)功能化所述悬臂的表面区，使得其可与树枝状大分子的末端反应；以及(ii)将树枝状大分子接触表面区使得该末端与表面形成键。本发明的一个目的是提供用于制造悬臂的方法，其中探针核苷酸、用于受体的配体或连接于所述探针核苷酸或配体的连接分子固定于树枝状大分子线性区的末端，包括以下步骤i)从表面区域上所述树枝状大分子线性区的末端去除保护基团；以及ii)使探针核苷酸、配体或连接于所述探针核苷酸或配体的连接分子接触支持物(substrate)枝状大分子线性区的末端，从而使所述探针核苷酸、配体或连接分子与所述末端成键，其中所述连接分子是同-双功能或异-双功能连接子。本发明还提供一种用于通过原子力显微镜测定一个探针核苷酸或配体与一个靶核苷酸或配体结合伴侣例如其受体之间的相互作用的设备，所述设备包括:具有固定端和自由端的悬臂，所述自由端具有被树枝状大分子化学修饰的表面区，其中所述树枝状大分子的分支区的多个末端结合于该表面，树枝状大分子的线性区的末端连接于所述探针核苷酸或配体。支持物，靶核苷酸或配体结合伴侣被固定在支持物上。控制器，用于调节悬臂和支持物上的靶核苷酸或配体结合伴侣的相对位置和方向，以引起固定于悬臂树枝状大分子修饰的表面区上的探针核苷酸或配体与固定于支持物上的靶核苷酸或配体结合伴侣之间的相互作用；以及检测器，用于测定与探针核苷酸或配体和样本核苷酸或配体结合伴侣之间的相互作用相关的物理参数。在一个具体实施方式中，由靶核苷酸或配体结合伴侣固定的支持物可采取本领域中任何一种表面修饰的方法。优选地，所述支持物具有一个树枝状大分子修饰的表面。本发明的另一个目的是提供分析与探针核苷酸或配体相互作用的靶核苷酸或配体结合伴侣的方法，所述方法包括以下步骤:(a)提供具有固定端和自由端的悬臂，所述自由端具有被树枝状大分子化学修饰的表面区，其中所述树枝状大分子的分支区的多个末端均结合于该表面，以及支持物；(b)化学修饰所述支持物，以在其上固定靶核苷酸或配体结合伴侣；(C)化学修饰树枝状大分子修饰的悬臂表面区，以固定探针核苷酸或配体；(d)将支持物和悬臂连接于包含控制器的设备，所述控制器用于调节支持物和悬臂的相对位置和方向，以引起固定于树枝状大分子修饰的悬臂表面区上的探针核苷酸或配体与固定于样品支持部件的支持物上的靶核苷酸或配体结合伴侣之间的相互作用；(e)控制悬臂和支持物的相对位置和方向，以引起探针核苷酸或配体与靶核苷酸或配体结合伴侣之间的相互作用；以及[0028](f)测定与探针核苷酸或配体和靶核苷酸或配体结合伴侣之间相互作用相关的物理参数。上文中，分支区的末端用-C0Z、-NHR、-0R’或-PR”3进行功能化处理，其中Z可以是离去基团，其中R可以是烷基、其中R’可以是烷基、芳香基或醚，R”是H、烷基、烷氧基或O。尤其是，COZ是酯、活化酯、酸性卤化物、活化酰胺或CO-咪唑基(imidazoyl);R可以为C1-C4烷基，R’可以为C1-C4烷基。此外，在上述支持物中，所述聚合物可以为树枝状大分子。更进一步，所述聚合物的线性区可以包括一个间隔区。而且所述间隔区可以通过第一官能团连接于分支区。这种第一官能团不限于-順2、-0!1、-!13、-(1)0!1、-010或-5!1。此外，所述间隔区可包括共价结合于所述第一官能团的连接区。在所述支持物和AFM悬臂中，优选AFM针尖，所述连接区可包括取代或未取代的烷基、烯基、炔基、环烷、芳香基、醚、聚醚、酯或氨烷基。此外，所述间隔区可包括第二官能团。所述第二官能团可包括但不限于-NH2、-oh、-PH3>-C00H、-CHO或-SH。第二官能团可以位于线性区的末端。而且，保护基团可结合于线性区的末端。这种保护基团可以为酸不稳定或碱不稳定的。在本发明的另一个具体实施方式中，在上述AFM悬臂中，探针配体或核苷酸和/或靶配体结合伴侣或核苷酸可结合于树枝状大分子线性区的末端。尤其是，所述靶核苷酸和探针核苷酸可以为DNA、RNA、PNA、核酸适体、核苷酸类似物或其组合。靶特异性配体包括核苷酸，但更通常被认为是化学复合物、多肽、碳水化合物、抗体、抗原、生物模拟物(biomimetics)、核苷酸类似物或其组合。此外，结合于树枝状大分子线性区的配体或核苷酸之间的距离可以为从约0.1nm至约100nm。在本发明的另外一个具体实施方式中，上述支持物可由半导体、合成的有机金属、合成的半导体、金属、合金、塑料、硅、硅酸盐、玻璃或陶瓷。尤其是，所述支持物可以不限于载玻片、颗粒、珠、微孔或多孔材料。根据本发明的下列描述、本文中所附的参考附图以及所附的权利要求，可以更充分地理解本发明的这些和其他目的。图1A是Bio-AFM的示意图，图1B和IC是Bio-AFM的照片。图2A是用于Bio-AFM的悬臂的示意图，图2B示出了根据本发明的示例性实施方式的AFM悬臂的针尖的放大视图，图2C示出了多种市售的AFM针尖。图3是AFM的探针针尖与支持物祀标之间接触面的示意图,该接触面用于通过AFM方法学来测定结合力和非结合力。图4A是一个柱状图，示出了具有相对较窄间隔的互补的30个碱基对在110nm/s的回缩速率下的力分布；图4B至图4C是在540nm/s的回缩速率下直接测定互补的30个碱基对的单一非结合力。图5A是一个柱状图，示出了具有相对较宽间隔的互补的30个碱基对在110nm/S的回缩速率下的力分布；图58至图5C是在110nm/S的回缩速率下测定互补的30个碱基对的结合力。[0040]图6A和图6B是柱状图，示出了互补的DNA双链的结合力分布，图6C是柱状图，示出了互补的DNA双链的非结合力分布。图7是一个柱状图，示出了单碱基错配的DNA双链的结合力分布。图8是一个柱状图，示出了双碱基错配的DNA双链的结合力分布。图9示出了AFM悬臂的示意图和AFM悬臂针尖的放大视图。图1Oa示出了树枝状大分子修饰的AFM针尖的示意图，该针尖连接有具有足够间隔的配体。图1Ob示出了AFM针尖的示意图，该针尖连接有紧密填充的配体。图1la示出了将蛋白固定于树枝状大分子修饰的AFM针尖上的方法的示意图。图1lb示出了将蛋白固定于树枝状大分子修饰的支持物上的方法的示意图。图12示出了利用AFM进行力测量的方法的示意图。图13a示出了利用AFM通过封闭蛋白进行力测量的示意图。图13b示出了利用AFM通过竞争性蛋白进行力测量的示意图。图14a是一个柱状图，示出了Munc-18-l与PLD1-PX之间相互作用的力分布。图14b是一个柱状图，示出了在溶液中加入过量的游离Munc-18-l后，Munc-18-l与PLDl-PX之间相互作用的力分布。图15是一个曲线，示出了力随着竞争蛋白PLC-YI的浓度而变化的情况。图16a示出了通过配体涂布的AFM针尖筛查细胞上受体的方法的示意图。图16b_16d示出了FPRl与其结合肽之间相互作用的力曲线。图17a_17b示出了在细胞每个不同区域上FPRl与其结合肽之间相互作用的力图谱和柱状图。图18示出了用游离WKYMVm(SEQEDNO:17)封闭之前和封闭之后FPRl与其结合肽之间相互作用的力图谱和柱状图。具体实施方式在本申请中，“一个”既用来指单个又用来指多个对象。如本文中所使用的，“核酸适体”意思是单链、部分单链、部分双链或双链核苷酸序列，有利地为可复制的核苷酸序列，它们能够通过不同于Watson-Crick碱基配对或形成三体的机制而特异性识别选择的非寡核苷酸分子或分子基团。如在本文中使用的，“模仿生物的(biomimetic)”意思为模拟生物分子、分子基团、结构的分子、基团、多分子结构或方法。术语“树枝状聚合物”的特征在于具有一个核心、至少一个内分支层以及一个表面分支层(见Petaretal,Pages641-645,InChem.1nBritain,August1994)。“树枝状大分子”是一种树枝形聚合物，具有从焦点发出的分支，所述焦点为核心或可直接或通过连接基团连接到核心以形成树枝状聚合物。许多树枝状聚合物包括连接于一个共同核心的两个或多个树枝状大分子。然而，术语“树枝状聚合物”可广泛应用，包括单个树枝状大分子。如在本文中使用的，“超分支”或“分支”，如其用来描述大分子或树枝状大分子结构，意思指具有多个末端的多个聚合物，所述末端能共价结合或通过离子键结合于支持物。在一个具体实施方式中，包含所述分支或超分支结构的大分子是“预先制备的”，然后连接于支持物。如在本文中使用的，“固定的”意思为不溶解的或包括连接于或可操作地连接于不溶的、部分不溶的、胶体、微粒、分散体系、悬浮液和/或脱水物质或分子或包括固态支撑物或连接于固态支撑物的固相。如在本文中使用的，“文库”指的是分子、材料、表面、结构形状、表面特征的随机或非随机混合、收集或分类，或可选地但不限于多种化学实体、单体、聚合物、结构、前体、产物、修饰、衍生物、物质、构型、形状或特征的随机或非随机混合、收集或分类。如在本文中使用的，“配体”意思是一种选择的分子，其能够通过基于亲和力的吸引而特异性结合于另一个分子，所述吸引包括互补性碱基配对。配体包括但不限于核酸、多种合成的化学物质、受体激动剂、部分激动剂、混合激动剂、拮抗剂、反应诱导或刺激分子、药物、激素、信息激素、递质、内泌素、生长因子、细胞因子、辅基、辅酶、辅因子、底物、前体、维生素、毒素、调节因子、抗原、半抗原、碳水化合物、分子模拟物、结构分子、效应分子、可选择的分子(selectablemolecules)、生物素、地高辛、交叉反应物、类似物、这些分子的竞争剂或衍生物以及从文库选择的非寡核苷酸分子，这些分子能够特异性结合于选定的靶标和通过将这些分子中任何一种连接于另一种分子而形成的轭合物。如在本文中使用的，“配体结合伴侣”指特异性结合于该配体的分子。如在本文中使用的，“连接分子”和“连接子”，用于提到分子时，将大小受控的大分子例如分支/线性聚合物的分支部分连接于保护基团或配体。连接子可以包括例如但不限于间隔分子、例如所选择的能够将配体连接于树枝状大分子的分子。如在本文中使用的，“低密度”指的是约0.01至约0.5个探针/nm2，优选约0.05至约0.2，更优选约0.075至约0.15，最优选约0.1个探针/nm2。如在本文中使用的，“分子模拟物”和“模拟物(mimetics)”是天然或合成的核苷酸或非核苷酸分子或分子基团，其经设计、选择、制造、修饰或加工而具有的结构或功能等同于或类似于另一种分子或分子基团(例如天然存在的生物的或可选择分子)的结构或功能。分子模拟物包括能够发挥天然的、合成的、可选择的或生物分子的代替物、替换物、升级物、改良物、结构类似物或功能类似物的作用的分子和多分子结构。如在本文中使用的，“探针核苷酸”或“靶核苷酸”包括核苷酸序列，例如寡核苷酸，且不限于一种核苷酸。如在本文中使用的，“核苷酸类似物”指的是在核酸合成和加工中，优选在酶促合成以及化学合成和加工中可替代天然存在的碱基而使用的分子，特别是能够碱基配对的修饰的核苷酸，可选合成的碱基不包括腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶或稀有碱基。该术语包括但不限于修饰的嘌呤或嘧啶、稀有碱基、可逆核苷、嘌呤和嘧啶的结构类似物、带标记的、衍生的及修饰的核苷和核苷酸、轭合的核苷和核苷酸、序列修饰物、末端修饰物、间隔区修饰物、以及具有主链修饰的核苷酸，包括但不限于核糖修饰的核苷酸、氨基磷酸酯、硫代磷酸酯(phosphorothioates)、亚膦酰胺(phosphonamidite)、甲基膦酸酯、甲基亚磷酰胺(methylphosphoramidites)、甲基亚膦酰胺(phosphonamidite)、5’氰乙基亚憐酸胺(cyanoethylphosphoramidites)、亚甲基勝酸盐(methylenephosphonates)、二硫代磷酸酯(phosphorodithioates)、肽核酸、非手性和中性核苷酸间键和非核苷酸桥例如聚乙二醇、芳香聚酰胺和脂类。[0072]如在本文中使用的，“多肽”、“肽”和“蛋白”可以在本文中交换使用，指的是氨基酸残基的聚合物。所述术语适用于氨基酸聚合物，其中一个或多个氨基酸残基是相应天然存在的氨基酸以及天然存在的氨基酸聚合物的人工化学类似物。该术语还包括传统肽键的变异体，所述传统肽键连接构成多肽的氨基酸。如在本文中使用的，“保护基团”指的是连接于分子上反应基团(例如羟基或胺)的基团。所述被选择的保护基团用来防止特定基团在化学反应的一个或多个步骤中的反应。通常，选择所述特殊保护基团以允许在后期去除该基团，以恢复所述反应基团并不改变分子中存在的其他反应基团。保护基团的选择依赖于待保护的特定基团和该保护基团将暴露于其中的化合物。保护基团的选择为本领域中的技术人员所熟知。参见例如Greeneetal.，ProtectiveGroupsinOrganicSynthesis,2nded.，JohnWiley&Sons，Inc.Somerset,N.J.(1991)，其全部内容以引用的方式结合于此。如在本文中使用的，“受保护胺”指的是已经与氨基保护基团发生反应的胺。所述线性针尖官能团是氨基的情况下，氨基保护基团防止在分支末端连接于固态支持物的过程中氨化物功能的反应。氨基保护基团可以在后期去除而恢复氨基，并不改变分子中存在的其他反应基团。例如，环外胺可以与二甲基甲酰胺二乙缩醛发生反应，形成二甲基氨基亚甲胺(dimethylaminomethylenamino)功能部分。氨基保护基团通常包括氨基甲酸盐/酯、苯甲基、亚氨酸酯以及其他为本领域中技术人员已知的基团。优选的氨基保护基团包括但不限于P-硝苯基乙氧羰基或二甲氨基亚甲基胺。如在本文中使用的，“固定间隔”指的是尺寸受控的大分子的针尖之间的间隔，其为约Inm至约IOOnm的距离，以留出靶特异性配体与靶标之间相互作用的空间，基本上无空间位阻。因此，支持物上的大分子层不过于浓密，从而使特异性分子相互作用能够发生。如在本文中使用的，“固态支持物”指具有固定基质的组合物，该固定基质例如但不限于不溶物质、固相、表面、支持物、层、涂布层、纺织或无纺纤维、基质、晶体、膜、不可溶聚合物、塑料、玻璃、生物或生物相容性或生物蚀解性或生物可降解性聚合物或基质、微粒子或纳米粒子。固态支持物包括，例如但不限于单层、多层、商品膜、树脂、基质、纤维、分离介质、层析支持物、聚合物、塑料、玻璃、云母、金、珠子、微球、纳米球、硅、砷化镓、有机和无机金属、半导体、绝缘体、微结构和纳米结构。微结构和纳米结构可以包括但不限于超小型化、纳米尺度和超分子探针、针尖、棒、钉、塞、杆、套管、金属线、丝和管。如在本文中使用的，“间隔分子”指的是一个或多个核苷酸和/或非核苷酸分子、基团或间隔臂，其经选择或设计用来连接两个核苷酸或非核苷酸分子，优选用来改变或调节这两个核苷酸或非核苷酸分子之间的距离。如在本文中使用的，“特异性结合”指的是配体与其特异性结合伴侣之间，或确定的序列节段与选定的分子或选定的核酸序列之间可测定且可再现的吸引的程度。该吸引的程度无需最大化而优化。微弱、中等或强烈吸引适合于不同的应用。在这些相互作用中发生的特异性结合为本领域中的技术人员所熟知。提到合成时，指的是序列片段、合成的核酸适体、合成的杂聚体、核苷酸配体、核苷酸受体、形状识别元件以及特异性吸引表面。术语“特异性结合”可包括结构性形状和表面特征的特异性识别。在其他方面，特异性结合特指两个分子(即特异性结合伴侣)之间的特异性、可饱和的、非共价性相互作用，可被第三个分子(即竞争剂)竞争性抑制，所述第三个分子与两个特异性结合伴侣之一共有一种化学识别特性(即一种或多种相同的化学基团)或分子识别特征(即分子结合特异性)。所述竞争剂可以为交叉反应物，或者抗体或其抗原的类似物、配体或其受体，或者核酸适体或其靶标。例如，抗体与其抗原之间的特异性结合可以被交叉反应性抗体或被交叉反应性抗原竞争性抑制。为了方便，术语“特异性结合”可用来近似或简略表示既包括特异性结合又包括结构性形状识别的特异性识别的亚类(子集)。如在本文中使用的，“支持物”当用在物质、结构、表面或材料时，是指一种包括非生物的、合成的、无生命的、平面的、球形的或扁平表面的组合物，迄今人们还不知道其包含特异性结合、杂交或催化识别位点或多个不同的识别位点或超过了构成所述表面、结构或材料的不同分子种类数目的多种不同的识别位点。所述支持物可包括例如但不限于半导体、合成(有机)金属、合成的半导体、绝缘体和掺杂剂；金属、合金、元件、化合物和矿物质；合成的、切割的、蚀刻的、平版印刷的、印刷的、机床加工的和微装配玻片(microfabricatedslides)、装置、结构和表面；工业聚合物、塑料、膜；硅、硅酸盐、玻璃、金属和陶瓷；木、纸、卡纸板、棉花、羊毛、布、针织和非针织纤维、材料和织物；未通过分支/线性聚合物由固定探针分子而修饰的纳米结构和微观结构。如在本文中使用的，“靶探针结合”意思是两种或多种分子(其中至少一个为选定的分子)以特异性方式彼此连接。典型地，第一个选定的分子可结合于第二种分子，该结合可以为间接的，例如通过插入间隔臂、基团、分子、桥、载体或特异性识别伴侣，或直接地，即无需插入间隔臂、基团、分子、桥、载体或特异性识别伴侣，通过直接结合比较有利。选定的分子可通过杂交特异性结合于核苷酸。用于核苷酸和非核苷酸分子轭合的其他非共价方式包括例如离子键合、疏水性相互作用、配体-核苷酸结合、螯合剂/金属离子对或特异性结合对例如抗生物素蛋白/生物素、抗生物素蛋白链菌素/生物素、抗荧光素/荧光素、抗_2，4-二硝基苯酚(DNP)/DNP、抗过氧化物酶/过氧化物酶、抗地高辛/地高辛，或者更常见地，受体/配体。例如，受体分子(例如碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、半乳糖苷酶、脲酶、萤光素酶、罗丹明、荧光素、藻红蛋白、发光氨(鲁米诺，3-氨基苯二甲酰肼)、异发光氨、吖啶酯或荧光微球，其为了例如标记目的，利用抗生物素蛋白/生物素、抗生物素蛋白链菌素/生物素、抗荧光素/荧光素、抗过氧化物酶/过氧化物酶、抗DNP/DNP、抗地高辛/地高辛或受体/配体连接于选定的分子或选定的核酸序列(即非直接和共价连接)，则可通过特异性结合配对的方式轭合于选定的分子或选定的核酸序列。通过控制固定在AFM针尖和支持物表面上的DNA链之间的间隔，测定单个寡核苷酸的非结合和结合力。已观察到可改善识别效率，通过选择恰当的间隔可消除多重和/或次级相互作用。特别地，具有20、30、40和50个碱基对的DNA双链的非结合力的柱状图变尖，且代表单个双链体的力。令人吃惊的是，还观察到了结合的发生，且相应的力与所述非结合力一致。此外，观察到两种力随着DNA链长度的增加而出现线性增加，且力测定足够敏感，可区分单一的点突变。本发明提供用于原子力显微镜(AFM)的悬臂，包括具有固定端和自由端的悬臂体，所述自由端具有被树枝状大分子化学修饰的表面区域，其中所述树枝状大分子分支区的多个末端均结合于该表面，所述树枝状大分子的线性区的末端被功能化。在本发明的一个具体实施方式中，在悬臂游离末端附近提供至少一个锥形突起，所述突起是角锥形或圆锥形。图2C中示出了多种类似结构的探针针尖。因此，可使悬臂的游离末端的表面区与特定突起相接触或到达其附近，这样，即可测定参照化合物分子之间的相互作用。所有类型的AFM悬臂均可用于本发明中，且对其无特殊限制。根据本发明所述的悬臂可用于所有类型的AFM，例如在图1B和IC中示出的设备。图1A示出了常见原子力显微镜的实例，图2A是用于AFM的悬臂。可参照图1A阐释本发明的AFM0AFM系统10包括底座15、支架20(其中心位置有一个开口，固定于底座15)、固定于底座15的管状压电传动器55。通过接线将电压从控制器CO传送至压电传动器，使得管状压电传动器55在垂直方向即悬臂的厚度方向是可转向的(由箭头V2指出)。参照图2A，悬臂50具有一个在支持物95的一个侧面上形成压电传动器25的结构。悬臂的一个示例性具体实施方式，悬臂50包括悬臂底座90，其具有形成在绝缘层110上的电极10，其中绝缘层110层积在矩形支持物95上。所述悬臂可由本领域中已知用于AFM悬臂中的任何材料构建，包括S1、SiO2,Si3N4,Si3N4Ox^Al或压电材料。悬臂的化学组成并不关键，优选为可易于微装配且具有用于AFM测量的必要机械性能的材料。同样，所述悬臂可以为本领域中用于AFM悬臂的任何大小和形状。悬臂的大小优选长约从5微米至约1000微米，宽约从I微米至约100微米，厚约从0.04微米至约5微米。典型的AFM悬臂长约100微米，宽约20微米，厚约0.3微米。可对悬臂的固定端加以改造使得该悬臂适合传统AFM的悬臂容纳的部分与其形成的界面。悬臂的游离末端的表面区可通过硅烷试剂例如GPDES或TPU修饰用于用树枝状大分子进行处理。本发明的设备和方法不限于通过基于悬臂的AFM仪器而使用。描述本发明的聚合物时，可提到诸如化学式I的聚合物。化学式I权利要求1.一种用于原子力显微镜AFM的悬臂，包括具有固定端和自由端的悬臂体，其中所述自由端包括包含多个共价结合的树枝状大分子的表面区域的锥形突起，其中每一个树枝状大分子包含分支区和单个线性区，并且其中每个树枝状大分子的所述分支区的多个末端共价结合于所述表面区域，并且每个树枝状大分子的所述单个线性区的末端被功能化，并且树枝状大分子的线性官能团以0.1nm至IOOnm的固定间隔隔开。2.根据权利要求1所述的悬臂，其中所述突起是角锥形或圆锥形的。3.根据权利要求1所述的悬臂，其中所述树枝状大分子的所述线性官能团以IOnm的固定间隔隔开。4.根据权利要求1所述的悬臂，其中所述分支区的末端通过由_C(=O)-、-NR-、-O-、和_PR2”-组成的一组基团被共价连接于所述表面，其中R是氢或烷基、并且R”是H、烷基或烷氧基。5.根据权利要求1所述的悬臂，其中所述线性区包括间隔区。6.根据权利要求5所述的悬臂，其中通过第一官能团将所述间隔区连接于所述分支区。7.根据权利要求6所述的悬臂，其中所述官能团选自由-NH-、-O-、-PH2-,-COO-,和-S-组成的组。8.根据权利要求5所述的悬臂，其中所述间隔区包含共价结合于所述第一官能团的连接区。9.根据权利要求6所述的悬臂，其中所述连接区包括取代或未取代的亚烷基、亚烯基、亚炔基、环亚烷基、亚芳基、醚、聚醚、酯或亚氨烷基。10.根据权利要求5所述的悬臂，其中所述间隔区包括第二官能团。11.根据权利要求10所述的悬臂，其中所述第二官能团选自由-NH-、-O-、-PH2-、-C00-、和-S-组成的组。12.根据权利要求10所述的悬臂，其中所述第二官能团位于所述线性区的末端处，以使得所述第二官能团将所述线性区共价连接于所述分支区。13.根据权利要求1所述的悬臂，其中存在于所述线性区的所述末端处的所述官能团包含保护基团。14.根据权利要求13所述的悬臂，其中所述保护基团是酸不稳定的或碱不稳定的。15.根据权利要求1所述的悬臂，其中探针核苷酸或配体结合于存在于所述树枝状大分子的线性区的末端处的所述官能团。16.根据权利要求15所述的悬臂，其中所述探针核苷酸或配体以0.01探针/nm2至0.5探针/nm2范围的低密度存在。17.根据权利要求15所述的悬臂，其中所述探针核苷酸是DNA、RNA、或其组合。18.根据权利要求17所述的悬臂，其中所述探针核苷酸是寡核苷酸。19.根据权利要求17所述的悬臂，其中所述探针核苷酸是cDNA。20.一种用于制造根据权利要求1所述的悬臂的方法，包括(i)功能化所述悬臂的表面区域，使得所述悬臂的表面区域可与所述树枝状大分子末端起反应；以及(ii)使所述树枝状大分子接触所述表面区域以便所述末端与所述表面成键。21.根据权利要求20所述的用于制造悬臂的方法，其中探针核苷酸或配体固定于所述树枝状大分子线性区的末端，包括以下步骤i)从在所述表面区域上所述树枝状大分子线性区的末端去除保护基团；以及ii)将所述探针核苷酸、配体或连接于所述探针核苷酸或配体的连接分子接触所述支持物上树枝状大分子线性区的末端，从而使所述探针核苷酸、配体或连接分子与所述末端成键，其中所述连接分子是同双官能或异双官能连接子。22.一种利用原子力显微镜AFM测定单个探针核苷酸与单个靶核苷酸之间相互作用的设备，所述设备包括:权利要求1所述的悬臂，其中所述探针核苷酸连接于存在于所述树枝状大分子线性区的末端处的官能团；固态支持物，包含多个树枝状大分子的单层，其中每一个树枝状大分子包含分支区和单个线性区，并且其中每一个所述树枝状大分子的所述分支区的多个末端共价连接于所述固态支持物表面，并且其中靶核苷酸连接于存在于所述树枝状大分子线性区的末端处的官能团；控制器，用于调节所述悬臂相对于所述靶核苷酸支持物的位置和方向，足以引起固定于所述悬臂的所述树枝状大分子修饰的表面区域上的所述探针核苷酸与固定于所述支持物上的所述靶核苷酸之间的相互作用；以及检测器，用于测定与所述探针核苷酸和所述靶核苷酸之间的相互作用相关的物理参数。23.一种分析靶核苷酸与探针核苷酸相互作用的方法，所述方法包括以下步骤:(a)提供具有固定端和自由端的悬臂，所述自由端的表面区域由树枝状大分子进行化学修饰，其中所述树枝状大分子分支区的多个末端结合于权利要求1所述的表面；(b)将靶核苷酸固定于支持物上；(C)化学修饰所述悬臂的树枝状大分子修饰的表面区域，以固定探针核苷酸；(d)将所述支持物和所述悬臂连接于包含控制器的设备，所述控制器用于调节所述支持物和所述悬臂的相对位置和方向，以引起固定于所述悬臂的树枝状大分子修饰的表面区域上的所述探针核苷酸与固定于所述样品支持部件的支持物上的所述靶核苷酸之间的相互作用；(e)控制所述悬臂和所述支持物的相对位置和方向，以引起探针核苷酸与所述靶核苷酸之间的相互作用；以及(f)测定与所述探针核苷酸和所述靶核苷酸之间相互作用相关的物理参数。24.根据权利要求23所述的方法，其中所述探针核苷酸是单链DNA或RNA，所述靶核苷酸是DNA或RNA的互补链或碱基错配链。25.根据权利要求23所述的方法，其中在步骤(b)中，所述支持物由树枝状大分子进行化学修饰，以将靶核苷酸固定于其上。26.—种通过原子力显微镜AFM测定一个配体与一个靶受体之间相互作用的设备，所述设备包括:根据权利要求1所述的悬臂，其中，所述配体连接于存在于所述树枝状大分子线性区的末端处的官能团；固态支持物，包含多个树枝状大分子的单层，其中每一个树枝状大分子包含分支区和单个线性区，并且其中每一个所述树枝状大分子的所述分支区的多个末端共价连接于所述固态支持物表面，并且其中靶受体连接于存在于所述树枝状大分子的线性区的末端处的官能团；控制器，用于调节所述悬臂相对于所述靶受体支持物的位置和方向，足以引起固定于所述悬臂的树枝状大分子修饰的表面区域上的所述配体与固定于所述支持物上的所述靶受体之间的相互作用；以及检测器，用于测定与所述配体和靶受体之间相互作用相关的物理参数。27.一种分析靶受体与配体相互作用的方法，所述方法包括以下步骤:(a)提供具有固定端和自由端的悬臂，所述自由端具有由树枝状大分子进行化学修饰的表面区域，其中所述树枝状大分子分支区的多个末端结合于权利要求1所述的表面；(b)将配体固定于支持物上；(C)化学修饰所述悬臂的树枝状大分子修饰的表面区域，以固定配体；(d)将所述支持物和所述悬臂连接于包含控制器的设备，所述控制器用于调节所述支持物和所述悬臂的相对位置和方向，以引起固定于所述悬臂的树枝状大分子修饰的表面区域上的所述配体与固定于所述样品支持部件的所述支持物上的所述靶受体之间的相互作用；(e)控制所述悬臂和所述支持物的相对位置和方向，以引起配体与所述靶受体之间的相互作用；以及(f)测定与配体和所述靶受体之间相互作用相关的物理参数。专利摘要本专利申请描述了一种用于原子力显微镜(AFM)的悬臂，包括具有固定端和自由端的悬臂体，所述自由端具有被树枝状大分子化学修饰的表面区域，其中所述树枝状大分子的分支区的多个末端均结合于该表面，并且树枝状大分子的线性区的末端被功能化。文档编号G01Q60/24GKCN101322030B发布类型授权专利申请号CN200680036706公开日2013年6月19日申请日期2006年8月14日发明者朴准远,郑瑜*,洪凤振,金镒弘,朴振圭,柳成浩,李惠映申请人:浦项工科大学,Posco公司导出引文BiBTeX,EndNote,RefMan专利引用(2),