专利名称：中型多核苷酸扩增装置的制作方法
本申请是1994年9月19日提交的美国申请号08/308,199的部分继续，而后者又是1992年5月1日提交的美国申请号07/877,662的继续申请，它的公开内容在此引入作为参考，本申请还与普遍认可的美国申请号[Attorney Dockct No.H-1203/1222]同时提交，后者是以下三个申请的部分继续，美国申请号07/877,702(1992年5月1日提交)，08/196,021(1994年2月14日提交)，08/250,100(1994年5月26日提交)的部分继续，以上三者的公开内容都在此引入作为参考。发明背景概括地说，本发明涉及对多核苷酸进行扩增和做各种分析的方法和装置。更具体的说，本发明涉及一些典型的，任意使用的微型组件的设计和构建，这些微型组件是用于包括多核苷酸扩增反应如聚合酶链式反应(PCR)的多种分析。
近几十年来，本领域涌现出大量实验方案，检测试剂盒及药盒，它们为各种诊断和监测目的进行生物样品分析。免疫测定法，免疫度量测定法，凝集反应测定法以及以多聚核苷酸扩增反应(如聚合酶链式反应)为基础的各种分析，或基于各种配体-受体相互作用及/或基于复合样品中各组合的不同迁移而进行的分析，所有这些都常用来鉴定各种生物化合物或污染物的存在或浓度，或用来鉴定特定细胞的存在。
近些年来已陆续发明了一些用于处理生物样品和进行某些临床试验的小而可任意使用的装置。Shoji等曾报道过很薄的硅片上造成的微型血的气体分析仪的使用，Shoji et al.，Sensors and actuators，15101-107(1988)。Sato等报告过用微型机加工的硅装置进行细胞融合的技术。Sato et al.，Sensors and actuators，A21-A23948-953(1990)。Ciba Corning Diagnostics Corp.(USA)曾制造了一台用于诊断血凝块的微型计算机控制的激光光度计。
使用了诸如硅物质的微型机加工技术使得微操纵装置的制作有很小的结构元件，从上十个微米(生物细胞的大小)到几个纳米(仅相当于一些生物大分子的大小)。Angell et al.，Scientific American，24844-55(1983)。Wise et al.，Science，2541335-42(1991)和Kricka et al.，J.Int.Fed.Clin.Chem.，654-59(1994)。大多数包含这种大小的结构的实验与微观力学有关，即机械运动和流动特征。这些结构的潜在用途在生命科学领域还没有被充分开发。
Brunette(Exper.Cell Res.，167203-217(1986)和16411-26(1986)研究了存在于涂覆有硅，钛等多聚物等凹槽中的成纤维细胞和表皮细胞的行为。McCartney等(Cancer Res.，413046-3051(1981))检测了在塑料凹槽中肿瘤细胞的形为。LaCelle(BloodCells，12179-189(1986))观察了白细胞和红细胞在微毛细血管中的流动，试图获取关于微循环的信息。Hung和Weissman报道过在微型机加工的管道中流体动力学的研究，但没有得出与分析装置有关联的数据，Hung et al.，Med. and Biol.Engineering，9237-245(1971)；和Weissman et al.，Am.Inst.Chem.Eng.J.，1725-30(1971)，Columbus等在实验性的多频道测试装置中使用了一个三明治式的装置，这个装置包含两块互相垂直并有V-型槽浮凸的板，这两块板又被用于控制生物流体向独立的有离子选择性的电极的毛细管式流动。Columbus et al.，Clin.Chem.，331531-1537(1987)。Masuda等人和Washizu等曾报道过用液流小室进行细胞操作(如细胞融合)。Masuda et al.，Proceedings IEEE/IAS Meeting，pp.1549-15539(1987)；和Washizu et al.，Proceedings IEEE/IAS Meeting pp.1735-1740(1988)。硅物质可用来发展一些微型装置如pH计和生物传感器。McConnell et al.，Science，2571906-12(1992)；和Erickson et al.，Clin.Chem.，39283-7(1993)。但用这种装置进行生物流体分析的潜力至今没有很好地开发。
用聚合酶链式反应(PCR)扩增DNA片段的方法学已很成熟了。(参见Mainatis et al.，Molecular CloningA Labaratory Manual.Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989， pp.14.1-14.35.)PCR扩增反应以DNA链为模板进行，并且要有热稳定的DNA聚合酶，如Taq DNA聚合酶(Chien et al.，J.Bacteriol.，1271550(1976))，三磷酸核苷和两段序列不同的寡核苷酸(“引物”)，它们分别与模板DNA链两端的序列互补且位于待扩增的DNA序列的侧面。反应在高温和低温之间反复循环，高温(如94℃)使双链模板DNA变性(“熔解”)随后低温(如40-60℃使引物退火，如70-75℃进行聚合)。这种在变性退火和聚合温度间进行的重复循环反应可以使模板DNA几乎呈指数扩增。比如，长达2kb，起始含量仅10-6μg的DNA片段经30-35次扩增循环可以得到高达1μg的目的DNA片段。用热循环器进行自动PCR扩增反应的机器是可以购得的(Perkin ElmerCorp.)。
多聚核苷酸扩增反应已用于遗传疾病的诊断(Engelke et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，85544(1988)，临床样品中病原有机体核酸序列的检测(Ou et al.，Science，239295(1988))，法庭上样品如精子遗传特征的鉴定(Li et al.，Nature，335414(1988))，活性癌基因的突变分析(Farr et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.851629(1988))以及许多分子克隆方面的应用(Oste，Biotechniques，6162(1988))。多核苷酸扩增反应还可以有更广泛的用途，如扩增已克隆双链DNA中特定序列作为探针，通过选择性扩增cDNA的特定片段获得没有克隆过基因的特异性的探针，从小量mRNA制备cDNA文库，获得大量DNA用以测序和作突变分析。
通过循环方法进行多核苷酸扩增反应领域中，已记述了很多种装置和系统。Templeton，Diag.Mol.Path.，158-72(1993)；Lizardi etal.，Biotechnology，61197-1202(1988)；Backman et al.，Eur.Patent No.320308(1989)；和Panaccio et al.，Biotechniques，14238-243(1993)这些装置采用一系列转换的设计原则，如水浴，空气浴和干物质的块料如铝。Haff et al.，Biotechniques，10102-112(1991)；Findlay et al.，Clin.Chem.，391927-33(1993)；Witter et al.，Nucl.Acids Res.，74353-7(1989)。在小反应体积中进行PCR反应也曾有描述。Wittwer et al.，Anal.Biochem.，186328-31(1990)；和Witt et al.，Clin.Chem.，39804-9(1993)。从硅制作成的多核苷酸扩增装置也有介绍。Northrup et al.，inDigestof Technical PapersTransducers，1993(Proc.7th InternationalConference on Solid State Sensors and Actuators)Institute ofElectrical and Electronic Engineers，New York，NY，pp.924-6；和Northrup et al.，PCT WO 94/05414(1994)。
已知道硅颗粒可以与核酸结合，并已用于PCR分析之前的核酸的分离。Zeillinger et al.，BioTechniques，14202-3(1993)。当在这个领域中报导用硅和其它微型通道和小室进行各种分析时，但很少将注意力集中到通过对微型机加工中的硅或其它表面进行改良的方法上，从而降低由表面的结合或其它表面特性而引起抑制反应，如在装置中进行的多核苷酸扩增反应。Northrup等曾描述过对硅底座中深0.5mm的PCR反应小室进行化学的硅烷化修饰。Northrup et al.，inDigeest ofTechnical PapersTransducers.1993(Proc.7th InternationalConference on Solid State Sensors and Actuators)Institute ofElectrical and Electronic Engineers，New York，NY，pp.924-6；和Northrup et al.，PCT WO 94/05414(1994)。但是Northrup等的参考文献(inDigest of Technical PapersTransducers，1993)公开，未进行硅烷化，反应小室中未处理的硅表面对PCR反应也无抑制的影响。
需要有一个方便，快速的多核苷酸扩增的分析体系以使它能在临床上以临床检测方法在有潜在应用的广大范围中应用，如父子判别检测，遗传及感染性疾病的检测，还有在环境和生命科学中的各种各样其他检测等。需要发展以硅等物质制造的微型装置，以达到物质表面对进行多核苷酸扩增反应没有干扰效应，而使有高产率。
本发明的目标之一是提供多核苷酸扩增反应的小型分析装置，并使扩增有好的反应环境，能够检测很低浓度的多核苷酸并迅速得出分析结果。另一个目标是提供易于大量制备，一次性使用，小的(比如，体积小于1cc)装置，它包含一些功能元件，能在应用范围中，对事先选定的全细胞或无细胞体系样品进行快速的，自动的多核苷酸扩增分析。本发明进一步的目标是提供用于装在实心底座如硅中的微型反应室的试剂以减少底座表面对多核苷酸扩增反应的潜在抑制效应。本发明另一个进一步目标是提供将试剂或样品液体送到建造在实心底座如硅上的多核苷酸扩增小室和从中取出试剂和液样的装置，并提供在扩增反应时封闭反应小室的组件。本发明还有一个进一步的目标是提供可用于进行一系列快速临床检测的组件，如，检测病毒、细菌感染、检测细胞培养污染物、检测细胞中某基因或重组DNA的存在，等等。
本发明的这些以及其它一些目标和特征在下面的说明书、附图和权利要求书中会明显体现出来。发明概述本发明提供一批小的，大量生产的，典型的一次性使用的装置(这里有时叫做“chips”)，使样品中多聚核苷酸进行快速扩增。在一个实施方案中，这个装置包括一个制造有包括中型多核苷酸扩增小室的实心底座。本装置也包括盖子，如置于底座上方的透明盖子，在进行多核苷酸扩增反应时，至少能盖住反应小室的一部分。本装置还包括一个与反应小室进行液体交换的开口，用以将样品导入反应室(这里有时称为“进样口”或“进口”)。此装置也可以包含一个或多个流体通道，从各个开口伸展到反应小室，和/或连接两个或多个反应室。本装置也可包含一个或多个附加的口以与反应室进行液体交换用作进口，进样/出样口和/或出口。装置的一个或多个开口和/或流体通道可以制造在盖上或制造在底座上。在这个装置内，为反应小室提供某种组合物，以减少反应室内壁对多核苷酸聚合反应的阻抑作用。这个装置还包括对反应小室的内容物进行温度循环的方法以使样品多核苷酸进行扩增。
“中型”这个词用在这里指的是那些反应小室或流通通道，其中至少有一个它的截面中至少有一截面部分大小约为0.1μm～1000μm。导向反应室的流通通道的优选宽度和深度应在约2.0～500μm数量级。位于底座中进行扩增反应的小室可以有一种或多种更大的尺寸，如宽度和/或长度约1～20mm。而反应小室的优选宽度和长度大约5-15mm数量级。反应小室深度从0.1到最大1,000μm。典型的反应室可制作成深度为小于500μm，比如为小于300μm，也可挑选小于80μm。深度浅的如小于300μm的反应小室有利于向小室内容物转移热量，比如，通过底座可以使需要热循环的扩增反应进行有效的热循环。但是在一些实施例中制作成反应室的深度大约在500-1000μm之间。整个装置的厚度尺寸取决于所采用的制作材料，是从微米级到几个毫米，长度和宽度大约为0.2-5.0厘米。
当微量样品从进样孔，如穿过底座或顶盖的交换孔，引入到流通系统，本装置就可对其进行扩增和/或分析。典型的中型流通系统体积小于50μl，反应室体积常小于20μl，比如10μl或更少。在另一个实施方案中，个别通道和反应室的体积可小于1μl，如处于纳升和皮升级。很低浓度的多核苷酸(如，纳克级的含量)可以被快速扩增(如，不到10分钟)并检测。当多核苷酸扩增测定结束后，这个装置即可丢弃或清洗后再用。
在一个实施方案中，环绕反应室各内壁的总表面积与反应室的体积比可做成大于3mm2/μl。反应室甚至也可做成更高的表面积/体积比，如5mm2/μl甚至选择大于10mm2/μl。当表面积和体积的比增大时，热通过底座传到反应室内容物或从内容物中传出都会容易，这样反应的热循环就变的更为有效，反应产率也会增加。但另外，当表面积与体积之比增大时，底座表面对多核苷酸扩增反应的潜在阻抑效应也相应增加。中型通道和反应室内壁表面干扰多核苷酸扩增反应，如，通过多核苷酸样品或扩增试剂与表面材料的相互结合作用则取决于制作这装置的材料。
本发明提供了一整套组合物以用于反应小室内表面，如硅表面，使减少对反应的潜在阻抑效应。在表面积与体积比大于3mm2/μl或5mm2/μl的反应室，或者在另外的实施方案中该比例超过10mm2/μl的反应室中，这些组合物就特别有用。此装置也可包括位于反应室上面，在扩增反应中用以封闭反应室的盖。这个盖也可以包含如玻璃或硅、或塑料物的一类材料。应用按置在反应室上的盖可以增加与反应室内流体的接触表面面积的总数。面向反应室的盖的那一面也可用这里公开的那些组合物处理，以减少盖表面材料对扩增反应的潜在阻抑效应。
用在反应室中以减少反应室内壁对扩增反应潜在抑制效应的组合物可以是共价或非共价方式粘附到反应室内壁，也可在扩增反应中以溶液形式加在反应小室中。在一个实施方案中，装置的一个或多个反应室和/或通道的内壁表面可以使用硅烷，用硅烷化试剂如二甲基氯硅烷、二甲基二氯硅烷、六甲基二硅氮烷或三甲基氯硅烷涂覆(可从诸如Pierce，Rockford，IL等公司购得)。另外的方法，反应室和/或液流通道的内壁表面，例如用硅元素类的物质做成，也可以使用一层相对惰性的涂层，例如，使用一些硅化试剂，象AquasilTM或SurfasilTM(Pierce，Rockford，IL)或SigmacoleTM(Sigma Chenical Co.，St.Louis，MO)。从商业生产商如Pierce(Rockford，IL)或Sigma Chemical Co.，(St.Louis，MO)处购得的硅化试剂是包含一个可水解基团的有机硅烷，它能在溶液中水解形成硅烷醇，硅烷醇能多聚化并在反应室的内表面形成一层涂层，并能与小室表面的羟基作用，这样就使膜紧紧结合在整个表面。这些硅涂层还可进一步包括与硅膜以共价或非共价缔合的一种大分子(在这里有时被称作“封闭剂”)，使进一步减少反应室内壁对扩增反应的阻抑效应。较有用的大分子包括氨基酸多聚物，或其它一些多聚物如聚乙烯吡咯烷酮、多聚腺苷酸和聚顺丁烯二酰亚胺。
硅底座内的反应室和/或通道内表面被以硅氧化膜也可以减少由壁表面引起的对扩增反应的阻抑效应。在氧存在的情况下硅底座被加热，通过热处理过程使形成硅氧化膜。另外也可利用等离子体加强的氧化作用或等离子体加强的化学蒸汽堆积过程。另外，反应室和/或通道内壁也可以用相对惰性的聚合物如聚氯乙烯涂布。
在反应室加入样品多核苷酸和扩增试剂之前，可以先加入其它多核苷酸(这里有时称作“封闭”多核苷酸)，如基因组DNA或多聚腺苷酸，其浓度最好要大于样品多核苷酸的浓度。这样，使封闭多核苷酸就占有反应室内壁表面上任何部位，这些部位可能潜在地与样品多核苷酸结合并降低反应产率或分析准确性。因此，在一个实施方案中，通过在硅底座内的反应小室使用封闭多核苷酸，使它占据反应室内表面与多核苷酸结合的所有部位游离的羟基。为避免干扰扩增反应，封闭多核苷酸应含有与样品多核苷酸无关的序列。其它可与反应室内表面结合的组合物如多聚鸟苷酸或各种多肽如酪蛋白或牛血清白蛋白也可用作封闭剂。此装置可在反应室中进行多核苷酸扩增反应，如聚合酶链式反应(PCR)。反应室中可以加入用于PCR的试剂，包括样品多核苷酸聚合酶，三磷酸核苷，可与样品多核苷酸杂交的第一引物，及与样品与多核苷酸有互补序列因而也可杂交的第二引物，这里第一引物和第二引物限定为多核苷酸扩增产物的端部序列。装置也包括对扩增反应室内容物进行热循环的方法，这样在每次循环中，温度受到控制以进行，1)双链多核苷酸变性(“熔解”)，2)引物向单链多核苷酸退火，及3)在引物之间合成扩增的多核苷酸。本领域中其它有用的扩增方法也可以采用，包括但不仅限于(1)靶多核苷酸扩增法如自身-持续的序列复制(3SR)和链替换扩增(SDA)；(2)以贴附在靶DNA上的信号的扩增为基础的方法，如“支链DNA”扩增法(Chiron Corp.)；(3)基于探针DNA扩增的方法如连接酶链式反应(LCR)和QB复制酶扩增(QBR)；(4)其它各种方法如连接激活转录(LAT)，依赖于核酸序列的扩增(NASBA)，链修复反应(RCR)和循环探针反应(CPR)(这些方法的综述可参见pp.2-7，The Genesis Report，DVol，3，No.4，Fe5，1994；Genesis Group，Montclair，N.T.)。
反应室可以被制造成一个部分，可以在多核苷酸扩增反应所需的温度和，如常规的PCR反应那样要求温度循环之间进行有序的温度循环。另外，反应室也可包含两个或多个部分，这几个部分分别设在变性，退火和聚合所要求的不同温度。在这种情况下，装置还应包含将反应室内容物在进行反应的几个部分进行传送的设备。如用计算机控制的泵。反应室至少一部分要有置于底座上的盖。此装置也还可包括本文所公开的对扩增的多核苷酸进行检测的方法。可用于完成各种自动，敏感，快速的多核苷酸分析的装置，包括细胞和溶液中分析多核苷酸的存在，或用已知的特定多核苷酸作为参照标志以分析病毒或细胞类型。
由实心底座设计和制造的中型流动通道和反应室可采用已建立起来的微型机械方法如照相影印石版术、蚀刻和后处理技术、激光机械加工，LIGA过程(Becker et al.，Microelec Eng，.435-36，1986)和塑料模子等。装置中的中型流通系统可以由做在底座表面的流通通道及一个或多个反应室以及然后用粘附或夹紧放在表面上的盖构成。实心底座和/或盖可包括以下材料如硅、多聚硅、硅石、玻璃、砷化镓、多聚酰亚胺、氮化硅和二氧化硅。另外盖和/或底座也可包含塑料材料，如丙烯、多聚碳酸盐、聚苯乙烯或聚乙烯。可任意选择的话，盖和/或底座可包含一种透明材料。
为使用本装置也可供给一种附件，它含有支撑装置底座的套架，并且他可任意选择与底座上的一个或多个进样口以及与附件上一个或多个流通线相配对。当估计含有某一特定多核苷酸的生物流体样品加到进样口后，就将底座放于附件上，开动泵，如位于此附件上的泵，就被启动，从而推动样品通过流通系统。另外，样品也可以用此附件注射进入底座(如，安装在此附件上的注射器)。反应需要的试剂，如聚合酶，在注射入底座之前可以加到多核苷酸样品中(以液体或干粉形式)。另外，完成反应所需的各试剂能从单独进样口被注入到反应室，如通过此附件。流体样品和试剂也可通过毛细管作用或通过重力进入中型流通系统。
本发明还提供了在扩增反应进行中为封闭一个或多个流体进样口/出样口用的方法。这就有效地防止了热循环中液体的蒸发，因而能在扩增反应中保证最适的反应浓度。在一个实施方案中提供一种包含为把液体通过本装置一个口进入反应室和从中取出的器具和适应于与这个口相互配合和/或相互封锁的组件，当液体送入反应室后它能可逆地封闭这个口。例如，流体传送仪器可包含注射器或移液器。一个实施方案中，流体移送可包含一个带有移液器头的移液器，移液器头就可在移液器和通道之间转移流体。这个管头可任意地从移液器上取下并可被处理，以防止样品之间的污染。
此装置包括一个底座，底座含有热导性材料如硅，以及置于底座上的盖，盖含有透明原料如玻璃或塑料。装置还包括做在底座或盖内的中型多核苷酸扩增室。盖上可包含有为接受和与用于送样品和试剂溶液到反应室和从中取出样品和试剂溶液的移液器相互匹配的凹槽通道，当移液器在槽内合适时，此通道可以通过底座和/或盖将移液器头上的小孔与反应室之间沟通。移液器头上的小孔可设在头的某一侧壁，使头可以在两个位置间移动，第一个位置可以使流体从头通过头上的开口和通道进入反应室，第二个位置是使头上的小孔对着盖上凹槽的侧壁，从而达到在反应时封闭流通通道和反应室的目的。另外，也可设置一个可按压的元件，从底座上延伸出来，当对着通道口按压此元件时，就可以封闭通道口。
反应室内一个或多个部分的温度可以受到调节，例如，在底座近反应室处安装一个或多个电热阻丝，或者用脉冲激光束或其它导向反应室的电磁能源。这个附件包括位于套架的电接头，它与整合到底座结构内的电接头配对，比如给反应室的电阻丝供电。附件中也可以装备冷却元件，以帮助反应室进行热调节。这个附件中设有常规电路与装置的传感器互相交流，来对变性和聚合所需的循环温度进行热调节。
中型反应室内通过扩增反应产生的多核苷酸可以由底座上的口收集并检测，另外，本领域内已知的特定试剂和方法可用来直接检测反应室内的扩增产物(“Taq Man”TMPCR reagents and kit，availablefrom Perkin Elmer Corp.)。另一种方法，在底座中微制作一个中型检测区，与本装置的反应室可进行流体交换，作为中型流动系统的一个部分。检测区可包括标记的结合部分，如标记的多核苷酸或抗体探针，能与扩增的多核苷酸进行可检测的结合。这样出现在检测区的多核苷酸产物就可以被检测，比如，多核苷酸多聚体形成的凝集和结合部分通过检测区的玻璃盖或底座本身半透明或透明的部分，进行光学检测。另外，检测区还可包括，为电泳分离和检测扩增多核苷酸的一系列(电)泳道或微石印装置。
阳性反应可以通过样品流体流动特性的变化而显示出来，例如由于反应室内扩增的多核苷酸产物导致流通系统中不同点上压力和电导的变化。在一个实施方案中，本装置包括中型流动系统，这个流动系统又包括多核苷酸扩增反应室和与附件联合应用的检测区(如，反应室或流动通道的一部分)，该附件含有传感装置例如分光光度计，通过，例如安置在检测区上的光学小窗能读出阳性结果。附件也可以设计成能接受压力读数，电导率以及其他的电信号指示数，而这些压力读数、电导率等是在反应室，检测区或流通系统中其它区域中感受到的。
底座可以包括多个反应室和/或检测室，使能对混合物中几种多核苷酸同时进行快速平行扩增和/或检测。中型流通系统中可包括突起部分或横断面面积减小的部分，以促使微量样品中的完整细胞在进入反应室之前被裂解。边缘锋利的硅片插在流动通道途径中，可以用作裂解的工具。中型流通系统也可包括细胞捕获区，这个区又包括细胞结合区域，比如，固定化在流通系统的壁上，当流体流动速度较慢时，它可以结合异质细胞群体中一种特定的细胞类型，当流速较高或更换溶液的性质，例如在传送进入细胞裂解区前又可以使这被结合的细胞类型释放，然后进入反应室，在这个实施方案中，从选定的细胞亚群中分离胞内DNA或RNA，并送到同一装置的中型反应室进行多核苷酸分析。在另外的实施方案中，结合剂也可以固定化在实心颗粒上，如胶乳珠或磁性珠，这在下面会有描述。
复合物形成介质，如涂覆多核苷酸探针的磁性珠，可以引入到中型流通系统，它们可以在如附件所提供的外加磁场作用下，沿着流通系统移动。固定化在磁珠上的多核苷酸探针能使磁珠与在反应室或单独的检测室中扩增出来的多核苷酸结合。比如，固定化有多核苷酸探针的小磁珠，可以在整个流通系统中流动或在扩增反应结束后导入反应室与扩增的多核苷酸产物结合。结合在磁珠上的多核苷酸可以随小磁珠一起运到流通系统中的检测或纯化室，或者到收集口。或者，磁珠也可以选贮于装置中某一事先定好的位置，当结合了多核苷酸产物以后再转移到检测或纯化室。
表1对本装置的一些特别和优点做了说明。本装置可以快速检测病原菌或病毒，或检测某种细胞类型的存在，或细胞中某基因或重组DNA序列的存在。这里公开的这套装置特征在于中型流通系统，包括有多核苷酸扩增反应室，最好要有至少一个中型反应室，用来扩增样品中的多核苷酸，其中也可供给所需的扩增反应试剂。本装置适用于很广的应用范围内多核苷酸的扩增，完成反应后，本装置可弃去，或可清洗后再用表1特点 优点可变通性装置设计的数量和可达到的用途不受限制可重复性本装置可进行可靠的，标准化的批量生产低成本生产 与现有体系相比，本装置在价格上有竞争力。有可以丢弃的性质能满足一次使用的过程。体积小 不需要大型的仪器。适用于非常规化实验室环境下可应用的可移动的单元和设计体系。并且贮存和运输费用低。微型要求最少量样品和试剂。降低试剂成本，尤其是对那些较昂贵的特殊的检测程序。简单化的测试仪器规划。无菌本装置能进行无菌处理以满足微生物测定或要求其它清洁环境的操作处理。封闭体系生物危险事故减到最小，操作过程保证完善。复合通路功能在单一装置中能完成多项反应或分析。可进行成组的反应。多样性和检测器功能 分析过程监测功能实质上扩展到任何系统。可供广范围应用。可重复使用的装置使用者对某些应用，可减少每次操作的费用附图简述
图1A是根据本发明的装置10的纵断面视图，包括完整的实心底座14，其上面是用机械加工的中型流动通道20，与进样孔16和多核苷酸扩增反应室22相联，以及依附在底座表面的盖子12。
图1B是根据本发明的另一个实施方案装置10的纵断面视图，包括实心底座14，其上是机械加工的中型多核苷酸扩增反应室22和进样口16，以及底座上面连有的盖12。
图1C示意另一个实施例的装置10的纵断面视图，包括完整的底座14，制造有中型多核苷酸扩增反应室22，盖12上做有进样口16和通道20，可与反应室22进行流体交换。
图2A是图1A装置的透视图。
图2B是图1B装置的透视图。
图3A是一个套入附件50中的分析装置10示意说明图。附件50用来支撑装置10，它包含有对装置10中反应室22进行温度调节的加热元件57。
图3B是一个套于附件50中的分析装置10的示意说明图，附件50用来支撑装置10，它包含有对装置10中的反应室22进行温度调节的加热元件53。
图4是根据本发明的一个装置的纵断面视图，包括一个实心底座14，其上面是机械加工的中型流动通道20，与之相连接的进样孔16及反应室22，依附在底座上面的盖子12。
图5是图4装置的透视图。
图6A是套入附件50的一个分析装置10的示意说明图，附件50用来支撑装置10，包含有对装置10中反应室22进行温度调节的加热元件57。
图6B是一个套入附件50中分析装置10的示意说明图，附件50可用于支撑装置10，它包括在装置10中反应室部位22A及对其调节温度的热元件57。
图7是一个底座14的示意平面视图，底座14上微制造有中型反应室部分22A和22B，当检测室进行流体交流而检测室又包含安置在底座上断面顺次递减的流动通道分支体系40。
图8是底座14上流动通道20一个截面透视图，底座14带有延伸到通道的某一壁上过滤细胞和碎片的突起80。
图9是底座14上流动通道20一个截面透视图，底座14带有延伸到通道的某一壁上刺破细胞的突起90。
图10A是一个包括反应室部分22A、22B和检测室22C的中型分析装置的平面示意图，22A、22B、22C都微制造在底座14上。
图10B是另一中型分析装置的示意平面图，包括反应室22A和22B，检测区26，它们都微制造在底座14上。
图11是又一个中型分析装置的示意平面图，包括微制造在底座14上的反应室22A。
图12是一个分析装置的示意平面图，该装置制造有多种中型小室，适合于完成各种包括细胞分选，细胞裂解及多核苷酸分析等的功能。
图13是一个组合有二套分流流通通道系统40的分析装置的示意平面图。
图14、15、16图示了不同实施方案中微制造在一个分析装置10中的流通通道20中的中型滤器24的顶部平面图。
图17是组件60的示意透视图，和装置10(未出示)联合使用以观察装置10里面的情况。
图18是图17中组件60一个断面图。
图19是包括底座14及透明盖12一个装置示意断面图，盖上又含有接受移液器的凹巢87。
图20是移液器头84，包括头端的开孔88的断面示意图。
图21是底座14及装配的构件85的断面示意图，构件85可以压缩以封住口15及通道20。
图22是一个组件透视示意图，组件包括透明盖12盖上的凹巢87和流通过道20A，这个过道引向底座上的流通通道20B和反应室22。
图23是一个说明在中型反应室中扩增的多核苷酸样品在琼脂糖凝胶电泳的模式图。
在各自的图中相似的参考特征表示相应的部分。这些附图是不需要按比例的。发明详述A.总述在本发明提供了小型，可大量生产，典型的一次性使用的装置系列，可以用来进行多核苷酸扩增反应，使液体样品中的多核苷酸快速扩增。本装置包括实心底座，由至少包含一个多核苷酸扩增反应室组合成，典型的装置长和/或宽大约0.1-5.0cm。穿过装置厚度看，通道和反应室的断面，可以是三角形的，截断的锥形的，正方形的，长方形的，园形的或其它形状。装置也包括一个进样口与反应室相通。装置还包括另外的口(其功能可作为进口或进样/出样口，或出口)，可设在流通系统上方的任一位置，还有一个或多个样品流通通道与反应室相通。这些一个或多个孔可以开放于空气中，或与一些合适的压力或抽吸装置相连，如，用来注入或抽空的装置，或可以将这些口封起来，比如在扩增反应进行之中。这些孔和通道可制造在底座上，或另外，制造在底座上方的盖上，或两者皆有。本装置还应包括一套对反应室内容物进行热循环的系统，以使样品多核苷酸进行扩增。
装置中至少有一个反应室和一个流通通道，最好是两者同时，具备中型大小，即至少有一个横断面的大小在0.1-1000μm数量级。反应室的优选深度是小于500μm左右，小于300μm更好，最优选则是小于80μm。反应室可以有大一些的长度和宽度，如在1-20μm的量级，优选5-15μm。
浅的反应室有利于对反应室内容物进行热传递，如，从底座附近的热源，从而在扩增反应中达到有效的热循环。在一个实施方案中，反应室的内壁表面积和体积比可做成从3mm2/μl到大于10mm2/μl左右。当表面积与体积比增加，热通过底座的传导及反应热循环的有效性都增加。但底座壁表面对扩增反应的潜在抑制效应也可能增加，这一点还取决于底座所采用的原料。因此，针对性地采用一些组合物用以减少反应室内表面如硅表面对反应的阻抑效应，在反应室内在壁表上这种处理是可以保证的。
用来减小反应室表面对扩增反应阻抑效应的组合物可以共价或非共价地粘合到反应室表面上。或者，这些组合物也可以在反应中以溶液加入反应室内。在一个实施方案中，中型流通通道和反应室可以建造在硅底座中。反应室和通道的壁上可涂覆一层上述组合物，用以减少装置中由硅表面所引起的阻抑效应。例如，装置的硅表面可以被上一层这里已公开过的在本领域可得到的硅烷化试剂范围内的任何一种。
在一个实施方案中，本发明的装置可用来在反应室中进行聚合酶链式反应。反应室内要供给PCR所需试剂，包括样品多核苷酸，聚合酶如Taq聚合酶，三磷酸核苷，可与样品多核苷酸杂交的第一引物，与一个互补于多核苷酸可杂交的第二引物，这里第一和第二引物是决定多聚化产物多核苷酸的端点。这些试剂可先加入到样品中，然后从进样口输入中型反应室，或者可与样品分开把各种试剂分别从进样口加入。
聚合酶链式反应可依照本领域已建立的方法进行(Man iatis etal.，Molecular cloningA Laboratory Manual，Cold spring harborLaboratory Press，1989)。本领域中任何耐热的多核苷酸聚合酶都可以使用。装置可包括对反应室内容物进行热循环的方法，这样在每一次循环，先是控制在使双链多核苷酸变性的温度，产生单链多核苷酸，然后使引物退火，进行多核苷酸多聚化。
尽管这里描述和例举的是聚合酶链式反应进行多核苷酸扩增，但本领域技术人员将会清楚本发明的装置和可同样有效地利用以进行其它一系列多核苷酸的扩增反应。这样的另外的反应，可以是热依赖的，如聚合酶链式反应，或可以在单一温度下进行(如，以核酸序列为基础的扩增反应(NASBA))。而且，这些反应可以使用很多种多样的扩增反应试剂和酶，包括其中的DNA连接酶，T7RNA聚合酶，和/或反转录酶。另外，多核苷酸变性能用已知的化学或物理方法完成，可单独使用或与温度变化结合使用。可在本发明的装置中进行的多核苷酸扩增反应包括但不仅限于(1)靶多核苷酸扩增法如自身-持续的列复制(3SR)和链替换扩增法(SDA)；(2)基于附在靶多核苷酸上的信号扩增的方法，如“支链”DNA扩增(Chiron Corp.Emeryville，CA)；(3)基于DNA探针扩增的方法，如连接酶链式反应(LCR)和QB复制酶扩增(QBR)；(4)基于转录的方法，如激活转录的连接(LAT)和基于核酸序列的扩增(NASBA)；和(5)各种其它扩增方法，如链修复反应(RCR)和探针循环反应(CPR)(这些方法的概述和它们的商业来源。请参见pp.2-7，The Genesis Report，DX，Vol.No.3，No.4，Feb，1994；Genesis Group，Montclair，N.J.)。
本发明的装置容量小，对很小量液体样品(如，小于50μl和甚至小于10μl能完成测定。本装置的中型流通系统可以微制造到微升体积或纳升的体积甚至更小，以有利于限制分析用的反应所需的样品量和/或液体试剂的量。装置可用来完成各种自动，敏感和快速的多核苷酸分析，包括细胞和溶液中的多核苷酸分析。在测定反应结束后，装置可被清洗后再用，也可以丢弃。一次性装置的使用可杜绝污染和减少生物危险事故。样品和反应混合物不论何时都能保持的是被包埋着的，低容量可简化废物处理。B.底座制作包括一个实心底座和置于其上的任选的盖子分析装置，能选用广范围的原料从设计和制造成有中型流通通道和反应室的装置。这些装置可选择易于灭菌的材料来制作。硅是比较有用的材料，因为它准确而有效的制造技术已比较完善，但其它许多材料也可在本发明范围之内被应用。其它可以被利用的材料包括，如，砷化镓，磷化锢、铝、多聚硅、氮化硅、二氧化硅、聚酰亚胺以及热电偶材料如铬/铝、及石英、玻璃、钻石、聚合碳酸盐、聚苯乙烯和其它多聚物如聚四氟乙烯。其它可能的材料包括超合金，锆锡合金，钠、金、银、铜、钨、钼、钽、KOVAR，陶、KEVLAR、KAPTON、MYLAR、黄铜、蓝宝石或任何本领域中可得到的塑料和有机聚合原料。
那些口，中型流通系统，包括样品流通通道和反应室及其它一些功能元件，可以大量地低成本地制造，如通过本领域技术人员已知的任一微机械制造方法加工的硅底座。现有的微型机加工方法包括膜镀过程，如化学蒸汽沉积，激光加工或照相影印石板术如紫外，X-射线LIGA过程和塑料模子，或蚀刻方法，可以用湿化学过程或等离子体过程。(参见，如，Manz et al.，Trends in Analytical Chemistry，10144-149(1991))。通道，装置内的小室和多个口的安排要有利于样品和试剂有序，适时及定量地加入。
在一个实施例中，不同浓度和宽度的流通通道和小室可以造在如硅的底座上，要至少有一个中型大小的。包含有中型通道和反应室的底座可以由玻璃盖儿盖上并封上，盖可以夹在，螺纹连接在或连在底座上。其它清亮或不透亮的原料也可以用作盖。或者，两个底座呈三明治式放置，或一个底座被两个玻璃盖夹在中间，用透明盖形成窗口，有利于对流通系统中的内容物进行动态观察。其它制造方法也可采用。C.钝化方法在中型扩增反应室或流通通道上可以提供一种组合物，以便它们的内壁表面钝化，即如壁原料的本质决定使成为必需这种处理以减少壁表面对扩增反应的抑制作用。这种组合物可以共价或非共价地粘附到反应室或通道内表面。例如，可在壁表面涂覆任一种本领域内已知的硅烷化试剂。或者，这组合物可以在反应室中供以溶液，在分析过程中与样品多核苷酸和扩增试剂一起加入。中型反应室的制造要符合反应室各壁的总表面与反应室体积比在3mm2/μl到大于10mm2/μl范围内，或者可以选择大于20mm2/μl。当表面积与体积比增加，热通过底座传到反应室的速度加快，依赖热的扩增反应也将循环得更快。但同时，表面积与体积的增加，表面抑制效应也将增加。同时，对在反应室表面积与体积比较高的情况下，如大于3mm2/μl左右，用来减少反应室壁对扩增反应的阻抑的这些组合物就显得格外有用了。
本领域那些技术人员将会意识到这里描述的钝化组分和方法只适用于某些材料，在那里已经观察到的是用这些材料做的反应室表面经钝化处理后扩增反应已有所改善。有一些考虑用作本发明装置的材料，本身就是惰性的，因此这里所描述的钝化处理对这些材料意义不大。
底座可包含热导性材料如硅或玻璃。反应室和/或通道内壁可以应用本领域可得到的硅烷化试剂通过涂覆硅烷而被钝化。有用的硅烷化试剂包括二甲基氯硅烷(DMCS)，二甲基二氯硅烷(DMDCS)六甲基二硅烷(HMDS)和三甲基氯硅烷(TMCS)。如果这些氯硅烷能与含有硅或其他物质的壁表面的羟基共价反应；而硅或其他物质能潜在地干扰这反应，例如由与样品多核苷酸或扩增试剂结合引起的反应。
另外，反应室和/或通道壁可用硅涂覆，这可应用从市场上能得到的硅化试剂，如AquasilTM或SurfasilTM(Pierce，Rockford，IL)或SigmacoleTM(Sigma Chenical Co.，St.Louis，MO)。从商业厂家如Pierce(Rockford，IL)或Sigma Chemical Co.，(St.Louis，MO)处得来的硅化试剂是含有可水解基团的有机硅烷，因而能在溶液中能进行水解，形成硅烷醇，硅烷醇能多聚化并在小室表面上形成一薄膜，并能与小室表面的羟基反应，使得这层膜紧密附着在整个小室表面。
这个涂层还可包括一类大分子，以共价或非共价地与涂层相联，进一步减少反应室壁对扩增反应的阻抑效应。有用的大分子包括氨基酸聚合物，或一些多聚物如聚乙烯吡咯烷酮、多聚腺苷酸，或聚顺丁烯二酰亚胺，或其它诸如顺丁烯二酰亚胺等组分。另外一些有用的大分子包括如，聚-L-丙氨酸、聚-L-天冬氨酸、聚甘氨酸、聚-L-苯丙氨酸、或聚-L-色氨酸。氧化硅薄膜也可以用于反应室和/或通道内壁以减少硅壁表面对扩增反应的阻抑。在氧存在下，加热底座，这样一个热处理可以形成氧化硅薄膜。或者，可以应用等离子体加强氧化作用或化学蒸汽沉积过程。另外，反应室和/或通道壁可以用多聚物，如聚氯乙烯涂覆。例如，聚氯乙烯的氯仿溶液加入中型流通系统，当溶剂挥发后，就形成涂层了。
在另一个实施方案中，反应室中可加入诸如多核苷酸或多肽等封闭剂。例如，基因组DNA或多聚腺苷酸可加入反应室的溶液中，其浓度最好要大于样品多核苷酸的浓度。这样，那些潜在的能与样品的多核苷酸或反应试剂相结合从而降低反应产率的表面任何位点都可被这些多核苷酸所占有。如果把DNA或RNA用做封闭剂的多核苷酸，就应该有效地避免能干扰扩增反应的序列(即，它们基本上只含有与样品多核苷酸无关的序列)。其它可被用作封闭剂的一些组合物包括牛血清白蛋白，或氨基酸多聚物或一些多聚物如聚乙烯吡咯烷酮，或聚顺丁烯二酰亚胺或诸如顺丁烯二酰亚胺等组合物。D.热循环多核苷酸扩增反应，如PCR反应，可以在图1A和2A所示的装置10的反应室中进行。在另一个实施方案中的装置10在图1B和2B也做了图示。如图1A、1B、2A和2B所示，装置10包括硅底座14，上面微制造有进样孔16，一个中型流通通道20和反应室22。扩增反应所需的样品多核苷酸和试剂的加入及产物的取出都是通过流动通道20从反应室22穿过进样口16，进样口16被制造在流通通道20的一端。底座14是盖着的，如用玻璃或塑料盖12。装置10也可和附件结合使用，如图3A简示的附件50。附件50含有嵌套部分58以支撑装置10，以指示出口，如装置10上的出口16，以及附件上一条流通线56。在附件50上的泵52就是用来将样品和/或试剂从附件上的通道56通过进样孔16泵入反应室22。
附件50可包括加热/冷却元件57以控制PCR扩增反应室内的温度，如一个电热元件和/或一个冷却线圈。电热元件或者可交替地整合到底座10中，用一个电源接头与位于反应室22下方的附件50中电接头相匹配。或者也可以象图3B所示那样，附件50可包括一个加热器53，如激光器，珀尔帖(Peltier)加热器，或电磁能源，放于装置10反应室上方或附近。加热器也可放在反应室下方的附件50中。附件中要有微型计算机可被用于调控加热元件，为了为扩增室提供，在适于去杂交的温度，如94℃，和适于退火和聚合的温度，如40-60℃退火和70-75℃聚合之间的温度循环。在底座与附件电接触的部位要安装有电热偶，热敏电阻或电阻温度计，使微型计算机能检测并维持反应室中的温度循环。通过使用单个元件，如电阻温度计，可以使加热和测温有利地结合起来，或者同时或者通过各个步骤将加热和感知温度结合起来，从而达到两个目的。
调节反应室温度的附件如微型的热温差泵(Meterials electronicProduct Corporation，Trenton，New Jersey)，珀尔帖(Peltier)温差电偶或Joule Thompson冷却装置，另一实施方案中，如图3B所示的附件中，反应室温度能被定时的脉冲激光调节，激光束穿过玻璃盖12射向反应室，这就使样品顺序加热和冷却到多核苷酸扩增循环所需的温度。另外，采用Peltier温差电偶可以将加热和冷却两个功能有利地结合起来。硅的热性能使它能进行快速的冷却和加热的循环。采用表面积与体积比大，如大于3mm2/μl的反应室是有利的因为热在反应室内容物中进和出的转移是方便的。有利的热传导又增加了反应室内热循环及扩增反应的效率。
如图4、5、6A所示意的那样，中型多核苷酸扩增反应室可以微制造成多个部分，如两个部分22A和22B，两者由流通通道20B相连。在这个实施方案中，22A部分是被加热到或保持在适于变性温度，22B部分被加热到或保持在适于退火和聚合的温度。分析时，装置10装入附件50里(图6A)。附件50设有控制反应室温度的仪器57。或者，可以用激光对反应室部分加热。底座可以包括热电偶或其它温度传感装置来监测反应室各部分的温度，它的输出的结果可以用于控制热的输入如在微型计算机的帮助下。
在操作中，附件中的泵52用来传送多核苷酸样品所需的反应试剂，从通过56通过进样品16A到反应室22A部分。泵52也可以由附件中的微型计算机控制，然后再被用于阶段性地通过通道20B在反应室22A和22A间进行样品转移，完成多核苷酸扩增循环的重复，而16B在这里作为出口。当反应结束后，附件50中的泵52又可以将样品从16B口通过附件中的通道56送到59口处回收产物。当然，也可以有3个或更多的反应室，其中每个部分分别保持在适合特定反应的温度。
在图4、5、6B中所示的装置10，使用热元件来加热22A反应室，使温度适合于双链DNA的变性，如94℃，而22B连接22A和22B的通道20B则位于这个加热区之外，这样在热的样品从22A向22B运送过程中，散发掉足够多的热量，使得样品在返回22A进行下一轮循环之前，温度降到退火及聚合所需的温度。这个很容易达到，因为硅有相对较高的导热性能，而且液体样品与底座接触的界面面积也相当大。在这样的实施方案中，附件50中的微型计算机用来控制泵52，由它来调节22A和22B间样品的循环流动。这样，沿反应室之间的流通路径，由于热力学平衡而产生温度梯度，而且，只用单一热源就可以得到两个适宜的温度。也可以采用其它设计，如，退火和聚合反应可以在一个反应室的不同部分完成，这两个部分分别设置合适的温度。E.封闭流体传送口装置包括，制造有中型多核苷酸扩增反应室的实心底座。装置还包括至少一个进样口及一个连接进样口和反应室的通道。装置中一个或多个的口及通道可以做在底座上(图14)或做在底座上的盖上(图1C)。盖可包括如透明材料象玻璃或本领域现有的一系列塑料原料。
本发明提供了扩增反应中封闭一个或多个口的方式以防止热循环过程中液体的挥发。在一个实施例中，设有流体运送组件，可以将流体通过口送到反应室或通过口从中取出，这个组件要适合于和口能互相匹配和/或互锁，这样当流体送入反应室口就可逆性地被封闭了。可以使用能和底座中流体进/出口相匹配并能将之封闭的注射器或移液器。
如图19和22所示，在一个实施方案内，盖12上可做成凹槽87与移液器86匹配并承接86。移液器86可备有移液器头84，上有孔88，当移液器安装在凹槽87中时可以将流体从头84，通过盖上的通道20A送到底座14上的通道20B和扩增反应室22。头可以选择性地从移液器上卸下来以防样品间的污染。
如图20所示，孔88可设在头84头端的侧壁，这样，如图22所示当移液器安装在装置10的87槽中时，移液器头可以在两个位置移动，位置1可以使流体从头经过孔88送到通道20A和反应室22，位置2使孔88面向槽87的壁，因而就在反应过程中封闭了通道20A和反应室22。另外，如图21所示，可以从底座上伸出一个可以按压的元件85，当元件85受到按压，就可以封闭开口。
上面描述的包含有封闭的流体转移口的装置，除了多核苷酸扩增还可用于其它各种目的。例如，这样的口可以在个别的装置中采用，用以样品制备，免疫分析或二者兼有，就象共同享有的共同未决的申请(登记号尚未指定)所描述的那样它的内容在此引入作为参考。F.扩增的多核苷酸的检测扩增室内已扩增的多核苷酸可以用本领域内现有的一系列检测多核苷酸的方法进行检测，如含溴化乙锭的琼脂糖凝胶电泳。在一个实施例内，扩增的多核苷酸产物可以在反应室内就地检测，采用现有的商业性的专门针对此目的的试剂(如“Taq Man”TM试剂，Perkin ElmerCorporation)。装置也可以在底座中或在与底座联合使用的附件中设置多核苷酸检测仪器。装置中扩增的多核苷酸产物的存在可以用以下任一种方法但并不限于这些。进行检测(1)监测中型流通系统中流入和/或流出反应室的液体样品的压力或电导率；(2)形成可检测的复合物，如，多核苷酸产物与标记的探针结合，如标记的寡核苷酸或抗体探针；和(3)在电泳上使多核苷酸产物和反应物及样品的其它组分分离。
分析装置也可和用来观测中型通道内容物的附件结合使用。一个实施例中的附件可以包括观测装置中型通道内容物的显微镜。在另外的实施例里，附件又可以包含照相机，如图17和18所示的附件60。附件60设有小屋62，观测屏64和用以把装置插入附件的狭缝66。如图18所示的断面那样，附件60也包括有视频照相机68，光学系统70和倾斜机构72以承接装置10，可以和调整装置10的位置和角度。光学系统70可包括透镜系统用来放大通道内容物，还有光源。视频照相机68和观测屏64可以对样品液体特性的变化，如由于多核苷酸扩增产物存在的诱导流动特征或颜色变化，用附件进行可见监测或选择性记录。另外，向反应室添加或从中取出液体样品也可以用这个附件进行监测，如进行光学监测。
在一个实施例中，扩增的多核苷酸产物可以在检测室内检测，检测室就装在底座上中型流通系统中，并与反应室相通。检测室备有复合物形成介质，如结合部分，可结合扩增的多核苷酸产物形成可检测的复合物，结合部分可包括，如多核苷酸或抗体探针。检测室的制作可以根据已公开的1992年5月1日提交的美国专利号07/877,702方法相一致，它的公开内容在此引入作为参考。在另一个实施例中，复合物形成介质可以在反应完成之后加入反应室，在那儿形成可检测的复合物。装置还可以与检测器结合使用，如包含有在分析中所得的检测和记录数据的微型计算机的附件。
一个实施例中，中型检测室可以备有惰性物质，如，能与多核苷酸产物结合的珠子或其它颗粒，当存在聚合的多核苷酸时，珠子形成可检测的凝集。在这样的颗粒上面附加结合部分，如抗体，能加强这种可诱导的凝集。
能结合多核苷酸产物的抗体或其它结合部分可被引入到检测室，或通过化学方式或吸附方式包被于检测区表面上，或者也可以包被于检测区的惰性颗粒上，以引发结合给出多核苷酸的阳性检测。化学激活硅表面的技术已比较完善，特别是在层析领域(参见如，Haller inSolidPhase Biochemistry，W.H.Scouten，Ed.，John Wiley，New York，pp535-597 (1983)；and Mandenius et al.，Anal.Biochem.17068-72(1988))。在一个实施方案中，结合部分可含有抗体，本领域内已知的免疫分析技术可以在这样的检测区进行。(参见如，Bolton etal.，Handbook of Experimental Immunology，Weir D.M.，Ed.，Blackwell Scientific Publications，oxford，1986，Vol.1，Chapter 26，for a general discussion of immunoassays)。
可检测的光学标记如荧光分子或荧光珠子可以贴附在结合部分以增强对扩增的多核苷酸产物的检测。或者第二种标记物，如荧光标记的抗体，可以从流通通道送入检测区，与已结合的多核苷酸/结合部分的复合物结合，形成一种“夹层结构”包含可以用光学检测的部分，表明待分析物的存在。在检测区与结合部分结合的多核苷酸扩增的结合是可被检测的例如，在光学上，从检测区上面的一个透明窗口可以见到或通过仪器检测。在一个实施例中，也可以通过加染料检测扩增的多核苷酸产物，如溴化乙锭，当它与双链DNA结合后，荧光增强。Higuchi et al.，Biotechnology，10413(1992)。
检测室也可设有标记的多核苷酸，它可以互补地与扩增的多核苷酸链中的一条结合，如，固定化于珠子上的标记多核苷酸通过珠子凝集的方式即可检测扩增多核苷酸产物。也可以应用本领域内已知的多核苷酸杂交技术。Maninatis et al.，Molecular CloningA LaboratoryManual，2nd ed.，Cold Spring Harbor Press，1989；Vener et al.，Anal.Chem.198308-311(1991)。多核苷酸探针也可以连到如亚微细粒胶乳上。Wolf et al.，Nucleic Acids Research，152911-2926(1987)。
在另外的实施例中，扩增的多核苷酸产物可以通过适合于本发明中型装置的电泳方法而与反应物以及原始样品中的其它组分分开。这样的技术本领域是有的。如，用SiO2做的微型石板影印设置可以达到电泳分离DNA分子的目的。(Volkmuth & Austin，Nature，358600-602，1992)。或者，玻璃板与各种通道相结合的微制造产品，可以进行毛细管电泳，分离各种生物分子(Harrison et al.，Science，261895-897，l993)。
在这种实施方案中，本发明的装置可以装备有检测区，该装置包含有微石板影印装置或一系列通道。提供一个穿越检测区的合适的电场，就可以在板上进行电泳了(如，在检测区的两端分别放置微电极)。检测区的一端设一个加样区，用以在电泳前收集反应室内容物。反应混合物中的不同组分就可以通过电泳彼此分离。多核苷酸扩增产物可以通过与已知大小的分子作比较加以鉴别。在一个实施例中，分子大小参照物也引入检测区(通过进口)，电泳分离后，记录结果并存贮(如，存在计算机里)。然后把反应室内容物引入检测区，电泳分离，记录结果，并与所保存分子大小参照物的电泳结果相比较。靠这种方式鉴别多核苷酸扩增产物并纯化以备后用，不需要惰性物质和结合部分来捕获多核苷酸产物。
反应室内扩增产生的多核苷酸可使流动受到限制，利用对这个限制敏感的检测区也可以检测多核苷酸的扩增。这在美国专利申请号08/250,100中已公开，它的公开内容已在此引入作为参考。扩增的多核苷酸的存在也可以通过感知进入或流出流通系统的液体样品压力和电导率的变化而检测出来。电导率是可被测定的，比如，通过底座上延伸出来的电触头，还有与装置结合使用的附件上的电触头，二者形成配对。电触头可以用已有的技术制作，如各种热梯度区域熔炼法。(参见Zemel et al.，inFundamentals and Applications of Chemical Sensors，D.Schuetzle and R.Hammerle，Eds.，Acs Symposium Series 309，Washington，DC，1986，p.2.)。
反应室中扩增的多核苷酸可以通过监测液体样品的压力而检测出来。例如，如图6A所示，装置10嵌在附件50里，通过口16进入和流出中型流通通道的液体样品与压力检测器54相连，由于聚合产物的存在，产生阻塞或流动限制以至压力减小，这个压力变化即可被检测器检测。中型压力传感器也可直接装在硅底座上。Angell et al.，SeientificAmerica 24844-55(1983)。
多核苷酸的扩增可以通过采用对流动限制敏感的中型流动系统来检测，采用“分枝”(“fractal”)模式，即流动通道分支的方式。通道可以造在硅底座上，尺寸逐渐减小，形成渐渐变狭的流动通道。本领域的技术人员应该知道，尽管这里举的是两个分支通道的例子，但装置可以制成数目不等的平行流动通道，或其它断面积减少的对称或不对称方式的流动通道。或者可以采用一个流动通道，包含有一段狭区，就如共同享有的美国专利申请号08/250,100中所述那样，(在此引入作为参考)。
图7显示的是一个底座14平面图，底座14上装有通道系统40，通过通道20与口16及包括22A和22B部分的反应反应室相联接。样品中扩增的多核苷酸的产物的存在影响流通通道中的流动特征。在这实施例中通道40是对称设置的，具有模型中部逐渐变狭的直径。在这样的通道模式中的流动对因多核苷酸扩增产物的存在而产生的流体粘性变化是很敏感的。另外如图13所示，可以采用一种更复杂的通道系统。图13图解了一对流通通道系统40A和40B，通道系统40A中通道的构造向着模型的中部逐渐变窄，结果使对流动限制的敏感度增加。
流动限制也可以通过检测区上方的透明盖进行检测，如光学检测。或者，由于流通限制路径之内或之外多核苷酸扩增的积聚导致流体特征变化，因为这个变化而引起的压力变化可以用一个或多个压力传感器来检测。多核苷酸的扩增引起的电导变化也可以由与流通区接触的电导传感器很容易地测出。例如，限制区40的阻塞，阻断了进样口16A到出样口16B的流通，这可以用常规的电导探测器17检测出，它的输出端可以指示流出通路中水状液体的存在与否。限制流通区也可包括结合部分如标记的抗体或多核苷酸探针，如固定化探针或结合于固相反应物如珠子上，通过结合扩增的多核苷酸诱发限制流通路径中流动限制的降低。
在一个实施方案内，中型流通系统包括一个裂解样品中细胞的小室，为下游进行多核苷酸分析作准备。装置也可包括适于在异质细胞群体中分离特定细胞类型的区域。细胞分离区包括固定化在底座内的结构上的结合部分，通过特征性细胞表面的分子如蛋白而选择性和可逆性地结合靶细胞。样品中的另一些细胞则通过下游，并被引导进入一个槽或穿过一个出口。流动可以继续以清洗细胞，如用缓冲液流。在高流速或压力下，或改变溶剂组分，被洗脱过的细胞就从它们原先被固定化的结构上释放出来，之后就从这个细胞分离区向下游的一个细胞裂解装置移动，使细胞在进行胞内RNA或DNA PCR分析前得以裂解。
细胞裂解装置典型设置的位置是在流通路径中细胞分离区(如果有的话)和多核苷酸扩增反应室之间，使得细胞在进行胞内多核苷酸分析前得以裂解。如图9所示，细胞裂解装置包括细胞膜穿剌突起90从流通通道20表面延伸。当液流受到推力经过这个穿剌突起90的时候，细胞就破裂了。在另一实施方案中，细胞裂解装置简单地包含一个断面大小受限制的区域，应用足够的流动压力完成细胞裂解。细胞裂解装置还可包括插在中型裂解室内的边缘锋利的硅片。附件还包含有某些设置，如泵，推动含有样品的细胞进入细胞裂解装置，应用足够的流动压力使细胞裂解，然后将样品通过流动系统送到反应室。在另外的实施方案中，细胞裂解装置可以包括细胞裂解剂。可以使用本领域现有的细胞裂解剂。
可以从底座上与反应室相的独立地进样口向反应室加入试剂。底座上的流通通道内可微制造一个滤器，能够在进行多核苷酸分析之前滤掉细胞碎片。在一个实施方案中，如图14、15、16所示，装置10中的滤器24可以包括一个中型的直径比通道20小的流通通道。操作时，样品流从通道20A流过滤器24，样品过滤液流出滤器24后又流过通道20B。滤器24被微制作成直的或弯的通道，其优选深度和宽度在0.1-50μm数量级，并跨越通道20A和20B，通道20A和20B的最大的深度和宽度约在500μm数量级。如图8所示，位于PCR分析室上游的通道20的表面也可包含由细胞筛组成的突起可通过大小分离细胞，当细胞样品流经通道时，典型的要在低压力情况下，只有足够小的细胞才可以通过细胞筛80到达下游的功能性单元中。这些细胞接着被送到细胞裂解区，然后再到多核苷酸扩增室进行分析。
另一个实施方案中中型流通通道内可含有顺磁性或铁磁性珠子，它们可以在外界磁场作用下沿通道系统运动，比如在附件磁场作用下。这些珠子可用来在装置的功能单元间运送试剂，或用来替换样品，试剂或反应混合物。在一实施方案，多核苷酸探针可以固定化于磁珠上使它们可以结合扩增的多核苷酸。测定结束后，这样的被有多核苷酸探针的磁珠可以沿流通系统被送到反应室去结合扩增的多核苷酸产物。结合的多核苷酸扩增物可以载在小磁珠上而运到流通系统中检测或纯化室，或到收集口。G.示范装置如图10所示的本套发明的一个实施方案，装置10包括底座14，上面微制造有中型多核苷酸扩增反应室包括22A部分和22B部分，二者靠通道20B相连。装置10要与附件结合使用，如图6A所示的附件50，包含有支持装置的套嵌部位，附件50中设有通路56与装置10中的口16A、16B、16C、16D相配对。附件中也含有可使口16A、16B、16C、16D机械地开和关的阀门。还包括口16E用来将试剂加到检测室22C。另一实施方案中，装置的流通系统可以保持用水力学充满状态，附件中或装置中的阀门可用来引导液流的流向。PCR反应室22A和22B分别加热到如94℃和40～65℃，提供了PCR和其它温度依赖性的扩增反应所需的熔解和退火温度。如前面曾经讨论的，反应室可以由整合在反应室下部的底座内的电元件加热，这个元件要和附件中的电元件配对。或者，可以采用光学的激光束，穿过底座上方的玻璃盖对反应室加热。在底座中可以设热传感器，它与附件要形成电接触。附件中微型计算机可用来控制反应室部分温度和流通系统中液体的流动。
装置10的流通通道安装有滤器24A、24B、24C。滤器24A用来防止细胞碎片及其它样品中不需要的颗粒物质进入反应室。滤器24B和24C用来将复合物形成介质即珠子92限制检测室22C里。因此滤器24A、24B、24C不必相同。
对于热依赖的扩增反应如PCR，操作开始，通道和小室中充满缓冲液，口16A和16C是开的而16B和16C是关的。附件中泵52将样品液体和/或扩增所需试剂如Taq聚合酶，引物和三磷酸核苷，从口16A通过滤器24A送到反应室22A。然后口16A关闭16B打开，附件中泵52在反应循环中，在反应室22A和22B之间，通过通道20B交互传送液流，其中22A中进行的是多核苷酸变性，而退火和聚合在22B中进行。口16C常用为这系统的出口或也可选择性地送Taq聚合酶，三磷酸核苷，引物或其它试剂，当扩增循环结束，如30-35个循环之后，口16C关闭，口16D打开，附件中泵又启动，将反应产物从反应室22A和22B送到检测室22C，其中包含有，如固定化于珠子92上与扩增的正义和/或反义链互补的多核苷酸。扩增产物观察到珠子92的凝集得到检测，如通过检测区上方的透明盖就可看见。
图10B所示的是另一实施方案装置。这个装置的功能，结构和操作与图10A所示的很相似，除了它包含检测区26，其中制造有用来进行多核苷酸扩增产物电泳分离的管道或其它装置(图中没有显示)。本装置包括口16E用来向检测室添加或取出原料。本装置和图16所示的附件50相类似的附件结合使用，它进一步包含有一个穿过检测区26的电场的应用设置。
图11所示的是又一个实施方案装置，本装置功能，结构和操作与图10所示的相同，只是它只包括一个单独的反应室22A。本装置与附件结合使用，如图3A所示的附件50。本装置包括交替加热和冷却反应室22A的仪器，以使反应室达到变性和退火，聚合所需的温度。
操作时，使用附件将含有聚合酶及其它扩增反应如PCR所需试剂的样本液从进样孔16A送到反应室22A。然后利用附件中连的阀门把口16A和16D关闭。接着利用附件中的加热元件对反应室进行热循环。循环是在适于变性温度和适于退火及聚合的温度之间进行。当扩增循环终止后，口16B和16D打开，样品被送到检测室22B，里面含有多核苷酸探针，如固定化于珠子92或其它固体物质上。多核苷酸阳性反应可以通过检测室内固体物质(如珠子)的凝集被显示出来。在如图10B所示的实施例中，反应室22A和22B内容物送到检测区26，在那儿，多核苷酸产物通过电泳进行分离和鉴定。
通过以下不加限定的例子，可以进一步了解本发明。实施例1在图11所示的装置中进行聚合酶链式反应，设有一个中型反应室22A。为了通过PCR反应来检测细胞内多核苷酸，将样品细胞裂解物加到PCR反应缓冲液中，包括Taq聚合酶，三磷酸核苷，多核苷酸引物及其它PCR所需的试剂。细胞样品裂解液从附件通过进口16A送到反应室22A。口16A和16D借助于附件上包含的阀门进行关闭。附件中的微型计算机和温控元件用来实现反应室22A中的温度，在94℃，多核苷酸变性和40-60℃，退火，以及70-75℃引物延伸之间的循环。
当聚合酶链式反应结束后，口16B和16D打开，附件中与16B相连的泵将PCR反应室22A中的样品通过通道20B送到检测室22B。检测室22B中含有珠子92，这些珠子包括在表面上固定化的与扩增多核苷酸互补的并能与之结合的多核苷酸。由于扩增多核苷酸和互补多核苷酸的杂交而促使珠子凝集，可以通过检测室22B上方的窗口观察到，从而对扩增多核苷酸产物存在进行检测。实施例2图12概要描述了装置10，包括底座14，用以从生物流体样品中的细胞亚群中分离核酸，然后对某特定的核酸序列进行分析。装置10上微制造有中型流通路径20，包括一个细胞分离室22A，一个细胞裂解室22B，滤器区24，PCR反应室包括22C部分和22D部分和限流检测区40。中型流通系统20也设有流体进/出口16A、16B、16C、16D。装置与附件如图6A所示的附件50联合使用。
起初，附件的阀门使口16C和16D关闭，口16A和16B打开。附件中泵52将含有细胞混合液的样品送到进样口16A，并流过中型通道20到达细胞分离室22A。分离室22A包括固定化于室表面的结合部分，能选择性地结合样品中期望的细胞类型的表面分子。样品中残余的细胞组分从口16B退出底座。当期望的细胞群体已在分离室22A结合后，继续使流动缓冲液流，用以洗脱和保证这种细胞群体的分离接下来，口16B关闭，口16C打开。然后液流加大足以使固定化的细胞洗脱下来。液流继续，推动细胞穿过裂解室22B中膜穿刺突起90，裂解细胞，释放出内容物。
样品流继续通过滤器24，滤掉大的细胞膜成分及其它碎片，进到中型PCR反应室22C，22C和22D借通道20B相连。Taq聚合酶，引物及PCR反应所需试剂从附件中与口16B配对的口和通路中加入，通过口16B到反应室22D，在这个过程中，分离后的细胞亚群的胞内可溶组分与PCR试剂得以混合。当口16A关闭，附件中通过口16B与装置相连的泵用来循环PCR样品和试剂，循环是在22C和22D之间通过通道20B进行，22C和22D分别设置不同温度，如94℃和65℃，来完成多核苷酸变性，退火和聚合的多次循环，从而扩增多核苷酸。或者，在反应进行中可以关闭所有的口，象上面所描述的实例1那样进行热循环。接下来，用附件中的阀门把口16D打开。附件中与口16B相连的泵将从细胞群体中分离扩增过的多核苷酸送到，包括双分支系列的流通路径40的检测区。检测区40中的液流限制可以作为扩增的多核苷酸产物存在的阳性指标，通过检测区上方的玻璃盖进行光学上的检测。实施例3样品多核苷酸(噬菌体λDNA)的扩增作用是在一个具有深80μm、宽8mm、长14mm的制造在硅底座上并用不同钝化方法钝化处理过的中型反应室中进行检测的。
要进行反应，PCR试剂(如，核苷酸，AmpiTaq DNA聚合酶，引物和噬菌体λDNA样品)先在管(tube)中混合，然后转移到硅底座的中型反应室中。反应物的终浓度为核苷酸，各200mM，Taq聚合酶，0.25U/10ml；引物，各1.00mm；DNA模板，每10ml0.1ng。用计算机控制下的帕尔帖(Peltier)加热-冷却器进行自动热循环(一般35次)。
装配在硅底座中的中型反应室壁经不同钝化方法处理后，PCR反应结果如图23所示。图23是反应产物在含溴化乙锭的琼脂糖凝胶上的电泳图。胶的泳道对应如下(1和7)分子量标准参照物(1000，750，500，300，150和50bp)；(2)在Perkin-Elmer 9600型热循环仪中进行扩增反应的产物，作对照；(3)未经处理的反应室中的扩增产物；(4)反应室表面有一层热处理后的硅氧化膜，在其中进行扩增反应的产物；(5)用硅氧烷和氨的混合物，通过等离子体增强的化学蒸汽沉积(PECVD)过程，在反应室表面被一层氮化硅，在这样的反应室中进行扩增反应的产物；(6)在被有通过PECVD过程形成的氧化硅薄膜的反应室中进行扩增反应的产物。硅的热氧化方法有过描述，如在Runyan and Bean，“Semiconductor Integrated Circuit ProcessingTechnology”，Addison-Wesley Publishing Co.，1990，Chapter 3，和等离子体协助参与化学蒸汽沉积过程在表面镀膜的方法有过描述，如，在Sze，“Technology”，McGraw-Hill Book Co.，1983，Chapter3中。
如图23所示，在被有热氧化膜(4泳道)和PECVD氧化膜(6泳道)的硅反应室中进行PCR反应，与未经处理的硅反应室相比(泳道3)，反应产物基本上增加了，相反，氮化硅膜(4泳道)对扩增反应没有任何正的钝化效应。实施例4制造在硅底座上中型多核苷酸扩增反应室涂覆有使反应室壁表面钝化的涂层。
硅底座上设有流体进口和出口，中型流通系统包括流通通道，它和口是相通的，可进行流体交换，还包括多核苷酸扩增反应室，中型扩增反应室深80μm，宽8mm，长14mm，用硅化试剂以及，选择性，用某种大分子一起形成钝化硅表面的涂层。扩增室中注满硅化试剂，如AquasilTM或SurfasilTM(Pierce，Rockford，IL)或SigmacoleTM(SigmaChenical Co.，St.Louis，MO)。注入时可采用100μl的移液器，并在底座片的出口处采用负压。硅化试剂在底座中于室温下保持至少30分钟。在出口处采取恒定负压以移去硅化试剂，至少要经4个小时。将100μl蒸馏水或0.1M TE缓冲液通过流通系统，从进样口送到扩增室，也是用100μl的移液器，并在出口外施加负压。这样的冲洗约重复6次。最后一次冲洗后，出口处的负压要维持10-15分钟以吸干通道。
或者，扩增室表面用硅烷化试剂如二甲基二氯硅烷(DMDCS)或二甲基氯硅烷(DMCS)。用硅化或硅烷化试剂进行表面处理的方法也有描述，如，在Pierce，“InstructionsSiliconizing Agents，”Rockford，I，1993，它的公开内容在此引入作为参考。
扩增反应室也可选择性地充满封闭剂，包括大分子(约0.1M Tris缓冲液中，pH 8.6，大分子浓度为10mg/mL)，如氨基酸聚合物(参见表2)，注入时也是用100μl的移液器从入口处注入，并在出口处施加负压。大分子溶液在反应室中于4℃至少保持1个小时。然后在装置的退出口施加10-15分钟负压。这样，提供了非共价地与硅处理过表面相结合的大分子涂层。实施例5对不同的涂层在降低硅对多核苷酸扩增反应的阻抑效应作了测试。
硅粉样品上涂覆一层SurfasilTM(Pierce，Rockford，IL)或SigmacoleTM(Sigma Chenical Co.，St.Louis，MO)。并使之干燥，然后再在上面涂覆表2所列的一系列不同的大分子(来自Sigma ChemicalCo.，St.Louis，MO)，如实施例4所述那样。然后把每个大约4mg的涂覆过的硅制品放入分开的含有45μl PCR反应混合液反应管内(参见实施例3)，并在Perkin Elmer 9600型热循环仪上运行。
或者，在深80μm，宽8mm，长14mm的中型反应室内表面涂覆一层硅烷化试剂，或参照例4所描述的程序用与不同大分子(表2)相联的硅烷化试剂。PCR反应就在有这样涂层的反应室中进行，利用实施例3所描述的试剂。使用不同涂层后所得的结果列于表2，采用0-4的比例范围，其中阳性对照(在Gene Amp 9600型中进行的反应)的比例是3。如表2所示，最有效的涂层是如SurfasilTM(Pierce，Rockford，IL)与聚乙烯吡咯烷酮或多聚腺苷酸结合使用。
表2编号 硅剂/大分子 对硅粉的 对PCR的效率比效率比1SigmacoteTM/聚-L-丙氨酸2-2SigmacoteTM/聚-L-天冬氨酸 0-3SigmacoteTM/聚甘氨酸 3＞14SigmacoteTM/聚-L-亮氨酸2-5SigmacoteTM/聚-L-苯丙氨酸 2-6SigmacoteTM/聚-L-色氨酸2-7SigmacoteTM/聚-L-赖氨酸0-8SigmacoteTM/聚乙烯吡咯烷酮 ＞1 -9SigmacoteTM/聚腺苷酸 4010 SigmacoteTM/聚顺丁烯二酰亚胺 0-11 SigmacoteTM/顺丁烯二酰亚胺 1-12 SurfasilTM/聚-a-丙氨酸 3213 SurfasilTM/聚-L-天冬氨酸 0-14 SurfasilTM/聚甘氨酸1-15 SurfasilTM/聚-L-亮氨酸 2-16 SurfasilTM/聚-L-苯丙氨酸 2-17 SurfasilTM/聚-L-色氨酸 1-18 SurfasilTM/聚-L-赖氨酸 0-19 SurfasilTM/聚乙烯吡咯烷酮 42-320 SurfasilTM/聚腺苷酸43-421 SurfasilTM/聚顺丁烯二酰亚胺0-22 SurfasilTM/顺丁烯二酰亚胺 1-23 不含涂层的硅00-224 SurfasilTM30-125 SigmacoteTM2-26 DMDCS -027 DMDCSC/聚腺苷酸 -128 AquasilTMin H2O 199-权利要求
1.一种通过进行多核苷酸扩增反应来扩增样品中多核苷酸的装置，该装置包括制造有至少包括一个多核苷酸扩增反应室的实心底座，所说的室至少有一个中型断面，大小要在约0.1-1000μm，所说的反应室至少含有一种对所说的多核苷酸进行体外扩增的试剂；以及至少一个可以与该反应室以流体相通，用以将所说的样品引入反应室的口。
2.权利要求1的装置，其中还包括将所说口与反应室相连的流通通道。
3.权利要求1的装置，其中所说的实心底座，包括的材料选自玻璃、硅、硅石、多聚硅、氮化硅、二氧化硅、塑料或有机聚合材料。
4.权利要求1的装置，其中所说的反应室深度小于500μm左右。
5.权利要求1的装置，其中所说的反应室深度小于300μm左右。
6.权利要求1的装置，其中所说的反应室深度小于80μm左右。
7.权利要求1的装置，其中所说的反应室表面积与体积比大于3mm2/μl左右。
8.权利要求7的装置，其中所说的比例大于5mm2/μl左右。
9.权利要求7的装置，其中所说的比例大于10mm2/μl左右。
10.权利要求1的装置，其中所说的反应室至少包含一面壁与一种组合物相结合，这组合物可以减少由所说反应室的所说的壁对多核苷酸扩增反应的抑制。
11.权利要求10的装置，其中所说的组合物是被粘附在所说的壁表面。
12.权利要求11的装置，其中所说的组合物是共价地贴附到壁表面。
13.权利要求11的装置，其中所说的组合物包括一种聚合物。
14.权利要求13的装置，其中所说的聚合物包括聚氯乙烯。
15.权利要求10的装置，其中所说的组合物包括一种，配置在该反应室的溶液里的封闭剂。
16.权利要求15的装置，其中所说的封闭剂选自多核苷酸和多肽。
17.权利要求16的装置，其中所说的封闭剂是一种选自DNA，RNA，多聚鸟苷酸和多聚腺苷酸的封闭多核苷酸。
18.权利要求17的装置，其中包含有所说的封闭多核苷酸的溶液还包含在所说反应室中待扩增的样品多核苷酸。
19.权利要求10的装置，其中所说的底座包括硅。
20.权利要求19的装置，其中所说的组合物包含涂覆于所说的壁表面的硅烷涂层。
21.权利要求20的装置，其中所说的涂层是通过所说的壁表面与硅烷之间的反应形成的，该硅烷选自二甲基氯硅烷、二甲基二氯硅烷，六甲基二硅氮烷和三甲基氯硅烷。
22.权利要求19的装置，其中所说的组合物包括涂覆于所说壁表面的硅氧烷。
23.权利要求22的装置，其中所说的涂层是通过壁表面与硅烷化试剂相互作用形成的。
24.权利要求22的装置，进一步包括与所说的硅氧烷涂层相连结的大分子。
25.权利要求24的装置，其中所说的大分子是一种氨基酸聚合物。26.权利要求24的装置，其中所说的大分子选自聚乙烯吡咯烷酮、多聚腺苷酸和聚顺丁烯二酰亚胺。
27.权利要求19的装置，其中所说的组合物包括涂覆于壁表面的氧化硅涂层。
28.权利要求1的装置，其中还包括调节反应室内的温度的热调节器。
29.权利要求1的装置，其中进一步包括用以检测多核苷酸扩增反应产物的检测系统。
30.权利要求29的装置，其中所说的检测系统包括一种复合物形成介质，当它与所说多核苷酸扩增产物接触时，与所说产物形成一种可检测的复合物；一个小室，多核苷酸扩增反应产物与复合物形成介质在其中接触，从而形成可检测的复合物；以及一种用以确定在所说小室中可检测复合物的存在或数量的检测器。
31.权利要求30的装置，其中所说的可在其中形成可检测复合物的小室，就是多核苷酸扩增反应室。
32.权利要求30的装置，其中所说的可在其中形成可检测的复合物的小室是检测室，它与多核苷酸扩增反应室以流体相通。
33.权利要求1的装置，其中所说的反应室至少要有一部分被底座上面的盖子所覆盖。
34.权利要求2的装置，其中的口和流通通道都制造在底座上。
35.权利要求2的装置，还包括置于所说底座上的盖子，其中所说的口和流通通道都制造在所说的盖上。
36.权利要求33的装置，其中所说的盖子包括一种选自玻璃和有机聚合物的材料。
37.权利要求34的装置，还包括从所说底座上延伸出来的一个元件，当对着所说口按压该元件时能将口封闭。
38.一种进行多核苷酸扩增反应的装置，该装置包括一种用以将样品引入到所说装置的进样系统，其中包括一个进样品和一个出样口；至少一个从所说的进样口延展出去的样品流通通道；一个制造的包括至少一个多核苷酸扩增反应室与流通通道和出样口以流体相通的实心底座，所说的反应室至少有一个中型断面，大小在0.1-1000μm，以及一种用以将液体送至进样口以及从该口接受液体的运送组件，其中所说的液体运送组件与进样口互相匹配并可逆地封闭进样口。
39.权利要求38的装置，其中所说的运送组件包括注射器。
40.权利要求38的装置，其中所说的运送组件包括一个移液器，所说的移液器包括一个移液器头，头上设有一个孔用以在移液器头和进样孔间转移液体。
41.一种进行多核苷酸扩增反应室，至少制造在底座或盖其中之一上，所说反应室至少有一个中型断面，大小在0.1-1000μm；其中所说的盖包括一个用来承接和匹配移液器的凹槽，移液器包括上面有孔的移液器头；和一个当移液器嵌入槽内时沟通所说移液器头上的孔和所说反应室的流通通道。
42.权利要求41的装置，其中所说的盖包括一种透明材料。
43.权利要求42的装置，其中所说有透明材料包括选自玻璃和有机聚合物的一种材料。
44.权利要求41的装置，其中所说的孔位于移液器头的侧壁，当移液器嵌凹槽中时，移液器头可以在下列两个位置间移动一个使流体从移液器头经其上的孔及通道送到反应室的位置1；以及一个使孔对着槽的壁因而封闭了通道和反应室的位置2。
全文摘要
这里公开的是通过多核苷酸扩增反应对样品中预先选定的多核苷酸进行扩增的装置。装置设有一个底座，其中微制造有多核苷酸扩增反应室，它至少有一个断面大小约为0.1-1000μm。装置还包括至少一个口与反应室相通，可进行液体交换，用以将样品引入反应室和必要时从此取出，而且可以选择性地用来从装置中移出产物或废物。反应室可备有对既定多核苷酸进行扩增所需的试剂。装置也可包括对反应室内容物进行热调节的方式，以扩增既定的多核苷酸。最好的是，把反应室制作成有高的表面积与体积比以有利于热调节。必要时可以用某种组合物处理扩增反应室，以减少包括反应室壁在内的物质对扩增反应的抑制效应。
文档编号G01N1/28GK1157639SQ95192076
公开日1997年8月20日 申请日期1995年11月13日 优先权日1994年11月14日
发明者P·韦尔丁, L·J·克里卡 申请人:宾夕法尼亚州大学信托人