专利名称:肽定序的方法
本发明涉及到一种对肽及蛋白质进行化学定序的方法，其目的是确定组成肽及蛋白质的各个氨基酸的种类及位置。更具体地说，本发明涉及到超过经典的Edman降解系统的一种改进的方法。
天然存在的及近代由合成产生的蛋白质和多肽都是由氨基酸长链组成的化合物。在所有的生命体中都发现有蛋白质并在生命体中具有激素、结构基本成份、酶、免疫球蛋白及生命物质的其他组份的功能。关于蛋白质的功能及结构的研究，经常需要确定蛋白质的氨基酸排列顺序(一级结构)。为了用化学方法或应用重组体DNA技术来合成蛋白质或部份蛋白质(如生长激素抑制素、胰鸟素、内啡肽等)，在尝试进行合成之前通常必须确定该种蛋白质所含的氨基酸顺序。在包括蛋白质(如免疫球蛋白、酶、病毒外壳蛋白及细胞表面蛋白)功能的探索中，在试图阐明蛋白质作用的机理时，必须确定蛋白质或多肽的一级结构。在重组体DNA方法研究中，必须确定一级结构以阐明为该一级结构编码的相应的DNA或RNA结构。
在测定蛋白质或多肽中氨基酸的基本顺序时，通常是用一种逐步降解法，在该方法中，将单个的氨基酸逐个地从多肽末端除下以便进行鉴定。Edman降解作用是较好的方法，但是也发展了一些其他的方法并可在某些情况下应用。在Edman降解作用中，是使N-末端氨基酸残基与一种能有选择性地从蛋白质上除下该氨基酸残基的试剂来进行反应以从蛋白质的末端除下氨基酸。所除下的氨基酸衍生物可转变成一种稳定的化合物，用化学方法可将该化合物从反应混合物中分离出来并进行鉴定。
在五十年代由Edman提出的逐步降解蛋白质及肽的方法〔Edman，P.，斯堪的纳维亚化学学报，4，283(1950)〕在过去35年中几乎没有什么改变，如图1所示，该三步的反应过程包括在碱性或无水条件下，在一种溶剂中，使含有N氨基酸的一种肽的N-末端氨基酸偶合到异硫氰酸苯酯(PITC)上(图1A)。用液-液萃取法(通常用重复的步骤)除去过量的试剂(过量500至10，000倍克分子)并在真空中除去溶剂。然后用无水酸使N-末端氨基酸裂解以形成氨基-末端氨基酸的一种苯胺基噻唑啉酮(ATZ)衍生物以及N-1长度的氨基酸的一种游离肽的盐，此种肽是除去了末端氨基酸的原本的肽。图1B。在真空中除去裂解的酸并从留在液相中的残余肽中萃取氨基酸的ATZ衍生物。然后，接着就使这种及不稳定的ATZ氨基酸与酸的水溶液反应而转变成一种较稳定苯乙内酰硫脲(PTH)氨基酸。图1C。然后将此缩短了的残余肽(N-1氨基酸)用PITC处理以引发另一次降解循环。然后用色谱法鉴定所得到的PTH氨基酸。对于肽中的每个末端氨基酸，用重覆上述的步骤处理。
液相手动的EDMAN技术在发展的早期，Edman降解技术是用手动来进行的。反应室是一支试管或相似的容器，有时使用一种特殊的罩子，使试剂的添加及除去可在一种惰性气氛中进行。用注射器或移液管来加入试剂而试剂的清除则用真空操作或将其溶解或萃取入一种溶剂中。在偶合的过程中，将蛋白质或肽溶解于一种碱性偶合缓冲液中。这种方法对于大的蛋白质分子是无效的，因为它们相对地不溶于这种碱性介质中。
在偶合之后，在除去偶合缓冲液及不需要的付产物时出现了许多问题。在这种技术中的一个难题是所留下的肽衍生物可能干燥成为一种胶质薄膜，而难以从其中除去反应的付产物。应用冷冻-干燥的一些方法试图减轻这一难题。另一个非常大的难题是除去非挥发性物质，因为在将这类物质除去时，肽的PITC衍生物也易溶于同一溶剂中，因而要未留下过量的PITC要未就是使样品损失。有一种方法是将挥发的试剂除去而留下干的PITC-衍生物及不挥发的付产物。然后选择一种或几种易于溶解不需要的物质而较难溶解PITC-肽的溶剂来洗涤该剩余物。然而那些需要除去的物质易于被截留在不溶的PITC-肽的基体中。另一方法是将PITC-肽及其他物质溶于一种含有非极性溶剂的偶合缓冲液中并搅拌之，而非极性溶剂与偶合缓冲液是不相混的。这些其他物质在非极性溶剂中的溶解度很大故可用此种溶剂萃取，而留下极性较强的PITC-肽则溶于极性的缓冲液中。溶有可溶解物质的非极性溶剂可形成一个分离层，而此分离层可用移液管将之除去。但是此步骤似乎将某些PITC-肽萃取到非极性溶剂中。要除去萃取溶剂而不同时除去一定数量的PITC-肽和极性溶剂而且也不让氧气进到容器中是极难办到的。
由于上述PITC-肽偶合的过程是在液相中进行的，所以不能选择具有最佳偶合特性效果的偶合缓冲液。强碱能最有效地促进偶合作用。但是，由于在液相偶合介质中存在着大量的水，必须将pH值的水平限制在低于肽及试剂发生水解作用的数值。因此，选择介质的pH值水平约为9作为促进偶合所需要的高pH值与限制水解裂解及试剂降解所需要的低pH值之间的折衷数值。
将一种无水裂解酸加到PITC-肽中以进行裂解的步骤并随后将它清除。所应用的酸是挥发性的，在裂解反应完成后可用蒸发将其清除之。此后，用一种萃取溶剂将ATZ-氨基酸取出而留下残余的肽。
通常这些萃取过程必须以少量的物质如25微升来进行。如上所述，在萃取过程中常常导致物质非特定数量的损失。而且，手工操作的定序过程必然要求有很熟练的技术及实际的经验。为了克服这些难题，可将肽固定在一种高分子量的聚合物〔消化己二甲胺(Polybrene)〕上或者以共价键连接到一种不溶的基质上并使之经受如下所述的自动化降解作用。虽然自动化解除了许多所遭遇到的困难，但是它昂贵而缓慢(每小时最多一个氨基酸)。
固相手工操作的EDMAN方法在Schroeder，W.A.，酶学的方法11，445(1967)及Jentsch，关于蛋白质顺序分析方法的第一次国际会议会刊杂志，193(1975)。中叙述了对上述液相Edman方法的改进方法。在此法中，蛋白质或肽是以非化学方法淀积在一种纸条上，而在定序过程中它始终淀积在此纸条上。固相方法与上述液相方法的主要的区别在于偶合用的碱及裂解用的酸是由在一个封闭的容器中，将纸条暴露在一种气相的酸或碱的固定气氛中来供应的。
上述方法适用于大的蛋白质及肽的降解作用。因为这种方法不需要为了反应而将样品溶解，而是将肽以高稀释高分布在纸带上以形成覆盖在一个大的表面积上的薄膜。上述系统需要非常长的一段时间来进行一次降解循环。促成此种长时间的因素是由于气相试剂只能以一种低效率的对流方式与肽接触。而且，溶剂萃取及干燥过程是在没有搅拌或其他强制的对流措施下进行的。
此方法的另一个缺点是它只对相对小的蛋白质或肽的片段的降解有效。人们相信这种低效率在很大程度上是由于机械的及萃取的损失以及未能防止反应物的氧化。
此方法的另一缺点是必须用不同的溶剂来萃取组氨酸及精氨酸衍生物，而这些溶剂也同样易于萃取肽。人们相信这是由于在纸片上的肽的不完全固定所造成的。
螺旋杯自动定序器Edman，P.，及Begg，G.，在欧洲生物化学杂志1，80(1967)及美国专利第3，725，010号中叙述了自动化的蛋白质定序器。在这些定序器中，Edman降解作用是按上述液相技术相同的基本原理及方法进行的。其基本的区别在于其反应是在螺旋杯的内表面上的一种薄膜中进行，而液体则是由溢流出杯边而被除去，而不是用移液管或注射器。用泵及阀门系统将试剂加到杯中，而物质的除去则与上述的液相手工操作的Edman方法相同，是用真空蒸发或在非极性溶剂中溶解或萃取。
使样品在杯内壁上保持一层薄膜。上述仪器中的一个问题是对于小的肽的定序效率低。这是由于在杯壁上的样品的膜。受到剧裂搅拌后很容易溶于用来带走过量的试剂、付产物及所需要的ATZ-氨基酸衍生物的洗涤用的或萃取用的溶剂中。因此，小的肽就被溶解或悬浮于这些溶剂中并在定序完成之前即被洗出螺旋杯之外。在美国专利第3，725，010号中应用了可用蒸发的方法除去的一种挥发性偶合缓冲液。但是可应用一种液体萃取步骤从肽中除去大量的非挥发性的物质。在这一步骤中，可将相对小的肽从杯中萃取出来。
螺旋杯方法的另一缺点是，蛋白质的干燥必须很小心地进行以保持一层薄膜，因此，如果试图立即将大量的溶剂进行蒸发，则在杯壁上的溶剂将沸腾并飞溅出来，从而将膜破坏。因此，在开始干燥蛋白质时是在一种缓和的受限制的真空中进行。在这种条件下形成了稳定的干膜以后，再继续进行较大量的蒸发以完成干燥的过程。如果不应用全真空蒸发，某些挥发性溶剂将留在杯壁上并将与其他步骤中的不同的试剂化合，而形成可干扰降解反应的不溶性盐。这种广度的干燥是费时间的而实际上影响了整个循环时间。此外，该系统还需要有一个高度精密的真空装置。由于在真空系统中挥发的各种物质，在固定的空间中结合而形成固体盐类，故为了对装置进行适当的保养，必须在每次操作之后清洁该系统。这个问题很严重，以致某些工作者已经发现有必要对于在美国专利第3，725，010号中所叙述的装置的真空系统整个地重新设计。
螺旋杯定序器的另一个缺点是，它需要精密地计量加入杯中的试剂及溶剂，以确保以相同的数量送入后继的循环中。此外，在杯中未反应或部份反应的蛋白质会形成一个环，这样就难以达到进一步的反应，而妨碍了降解的过程。此种计量系统是复杂的而且难以保养。
Laursen，R.A.欧洲生物化学杂志20(1971)陈述了另一类型的自动定序器。将要降解的肽以共价键连接到一种凝胶型的固相支持物上并装在管状玻璃柱内以形成一个反应室。可用其他的溶剂或试剂替换的方法将所有的试剂和溶剂从反应柱上除去。
上述系统与以前的定序方法相比，其主要的区别是，不用蒸发的方法来作为除去物质的技术。而代之以在整个过程中以液体注入柱中，以便使固体支持物保持在膨胀的、多孔的状态。上述Laursen论文认为膨胀的聚合物小球支持物限制了对长度为30或较小残基的肽的定序过程。
在Waschter，E.，Machleidt，H.，Hofner，H.，及Otto，J.，欧洲生物化学协会联合会通信35，97(1973)中，应用了大孔玻璃支持物，使蛋白质及较大的肽能够定序，上述系统的一个主要的缺点是只能使用液态的试剂。因此，肽以完全的共价键连接到固相支持物上是必需的。这是由于裂解的酸是蛋白质及肽的极好溶剂，它会将未以共价连接的蛋白质及肽从支持物质上洗下来。由于肽或蛋白质偶合的效率(约30至50%)，所以完全以共价键连接的要求限制了这种技术的使用率。另一个缺点是由于凝胶型的支持物受到许多溶剂的不利的影响，所以只有有限选择出的溶剂可用来溶解用于偶合到支持物上的肽。必须指出的是此类凝胶型支持物对于留住小的肽是很有效的。由于所要求的偶合技术之故，某些残基是不能被鉴定出来的。另一个缺点是偶合是一个长而令人生厌的过程。
在上述系统中另一个主要问题是，裂解酸必须被用作从反应柱中萃取ATZ-氨基酸的溶剂，因为后者在前者中有高的溶解度，裂解酸也可从柱中萃取尺寸过小的物质，而这些物质干扰组氨酸及精氨酸的鉴定。应用裂解酸作为ATZ-氨基酸溶剂的另一个缺点是延长ATZ-氨基酸的暴露可引起干扰ATZ-氨基酸转变为PTH衍生物的化学变化。
本系统的另一个限制是在反应室中的液态溶剂及试剂的交换必须用泵将其泵进其他液体中来实现，因为它们之中没有一种可用蒸发作用来除去，泵送量受到柱的反压力的限制，因此这种交换是相对慢的。
PTH-氨基酸的鉴定已经制备成多种多样的异硫氰酸酯，以便使用多种方法来监测由降解产生的PTH-氨基酸。已经用过薄层色谱(TLC)，气体色谱(GC)，气体色谱/质谱分析(GC/MS)，液相色谱(LC)及带有紫外光及萤光监测的的高效液相色谱(HPLC)来鉴定PTH-氨基酸。而所有目前的方法都应用HPLC。
为了克服在肽的液态及固态定序中所遇到上述难题，发展了本发明的方法，其中先前所用的液-液萃取由液-固萃取所代替。所应用的固体是一种键合的硅胶吸附剂(它通过加入特定的反应官能度而对其进行化学的改性)。为了应用本发明的方法，已制备出一类新的异硫氰酸酯(ITC)，它含有设计用来与改性结合的硅胶吸附剂相偶合的功能团，本发明的ITC试剂及其合成方法，两者同样是分别待批的专利申请项目。
在本发明的方法中，所用的异硫氰酸酯试剂或其衍生物，具有A-B-C形式，其中A是一种顺式或共平面的1，2或1，3二醇(-OH)或1，3羟基叔胺，它们可用于与硼酸部份进行反应而形成一种环化结构(硼酸酯);B是任何的发色团，荧光团或起电团(electrophore)它们可用可见光的紫外光、用电化学方法的荧光来鉴定;而C是一种化学功能团，该团可用来与一种由肽而来的未端氨基酸反应，结果形成一种脲或硫脲键，并可以是但并不限于是下述这些伯胺反应活性物质
上述ITC化合物的每一种试剂通常都被称为“ITC试剂”。
在本发明的方法的第一步中，在可使ITC试剂的C部份及N-末端氨基酸的氨基部份之间进行反应的碱性条件下，将一种过量的ITC试剂加到多肽或蛋白质中以便定序。
使过量的ITC试剂与含有一个其反应性比脂肪族的N-末端的胺活泼的芳香胺的清除剂发生反应，完成以过量的ITC试剂的提取。这种清除剂也含有一个可与固定化的有机汞基质(PHgOH)进行反应而能有效地被提取的巯基。过量的ITC-清除剂和清除剂是被固定在PHgOH柱上或淤浆中，而反应了的ITC试剂则留在溶液中。
在Edman降解反应的技术中已知的标准条件下，通常是应用三氟乙酸(TPA)来裂解留下的ITC氨基酸部份，在裂解反应之后，将所得到的ATZ氨基酸及剩余的肽溶于偶合缓冲液中，而ATZ氨基酸则由它与固定化的苯基硼酸(PBA)进行反应来萃取。此反应的最适反应条件与偶合反应的条件相同。余下的肽并不保留在固定化的PBA上而是进入另一次降解循环。利用酸化作用使ATZ-氨基酸从吸附剂上分离，而酸化作用亦有利于ATZ-氨基酸转变成PTH-氨基酸，而接着再用常规的技术，如高效的液相色谱法来鉴定这种氨基酸。
图1说明现有技术水平的Edman降解。
图1A表示第4步，将PITC偶合到一种肽上。
图1B表示从肽上裂解N-末端氨基酸复合物(ATZ-氨基酸)的步骤。
图1C表示ATZ-氨基酸转化成PTH-氨基酸。
图2说明合成ITC试剂(DHMPITC)的各步骤。
图3说明应用本发明的方法，在一个肽定序中的一次循环。
图3A表明一个ITC试剂偶合到一个肽上。
图3B表明过量的ITC试剂结合到用于提取的清除剂分子上。
图3C表明应用固定化的PHgOH提取过量的ITC试剂-清除剂复合物。
图3D表明ITC试剂-肽复合物裂解成一种ATZ-氨基酸及缩短了的肽。
图3E说明在一个固定化的PBA柱上提取ATZ-氨基酸。
图3F说明ATZ-氨基酸转化成PTH-氨基酸。
本发明是一种用于从蛋白质或肽的N-末端对该蛋白质或肽定序的通用系统而且对于非常少量的起始物质是有效的。
该方法包括下裂步骤合成a)ITC试剂的合成(图2)。
b)固定化的有机汞制剂化合物(PHgOH)的合成。
c)固定化的苯基硼酸的合成。
定序d)ITC试剂偶合到多肽或蛋白质的N-末端氨基酸上(图3A)。
e)第一次提取-除去过量的ITC试剂。
1)将清除剂分子以H2N-〔 〕-SH的形式加到偶合反应混合物中，以形成由清除剂的巯基化合物与过量的ITC试剂结合成的一种复合物(图3B)。
2)使步骤e(l)的反应混合物流过装有一种固定化的有机汞制剂(PHgOH)的柱中，使过量的清除剂与ITC-清除剂复合物结合到柱上，从而使多肽-ITC复合物流过柱而不保留在柱上。(图3C)f)在无水酸条件下升温1至30分钟裂解。(图3D)。此反应从蛋白质的肽余下部份除下ATZ-末端氨基酸部份。
g)第二次提取-将(f)步骤的反应混合物倒入装有固定化的苯基硼酸(PBA)的柱中该PBA将1，2或1，3二醇或类似的活性部份结合到硼酸上而将ATZ-氨基酸从多肽残余物中分离出来(图3E)。
h)收集通过柱而未被保留在柱上的残余多肽并使其经受接着发生的降解循环。
i)在含水酸中从PAB柱上除下ATZ-氨基酸。
j)将ATZ-氨基酸转化成稳定的PTH-氨基酸。
k)应用高效液相色谱或其他的标准技术鉴定PTH-氨基酸。
ITC试剂应用于本发明的ITC试剂具有化学式A-B-C，式中A是一种顺式或共平面的1，2或1，3二醇(-OH)或在碱性或中性条件下可用来与硼酸反应的1，3羟基叔胺。
B是在已知条件下任何可检测的发色团、荧光团或可检测的起电团(electrophore);在应用高效液相色谱、气相色谱、液相色谱及类似的方法将氨基酸分离之后，应用检测技术B就可被用来对氨基酸进行定位及鉴定。
C是一个化学功能团，它可用于与从多肽而来的一个末端氨基酸进行反应从而形成一个脲或硫脲键同时它可能是但并不限于下列的这些伯胺反应活性物质
这些基团也具有与下列通式的一类清除剂化合物反应的活性H2N-〔 〕-SH这类化合物导致一种清除剂-ITC复合物具有能与一个有机汞制剂部份发生反应的反应活性。
有用的ITC试剂的例子包括2，3-二羟马来酰亚胺-4′-异硫氰酸苯酯(DHMPITC)，表示于图2并叙述如下;
2，3-二羟基，异硫氰酸萘酯;
1，8-二羟基，异硫氰酸萘酯，二羟基马来酰亚胺-4′-偶氮苯异硫氰酸苯酯以及类似的化合物。在某些条件下，一个叔胺部份可用来代替在一个ITC试剂上的羟基。
由ITC试剂与固定化苯基硼酸反应所得到的硼酸酯必须是很易于水解的。因此在二醇之间的键或相似的反应活性部份，以及该硼酸可用水解来断开，因此可以从PBA柱上将ATZ-氨基酰洗脱。
清除剂分子本发明的清除剂分子可与过量的ITC试剂反应，并具有通式H2N-〔 〕-SH式中〔 〕是任何相关的非活性烷基、芳基或其衍生物。其氨基是用来与在ITC试剂上的-N＝C＝S或类似的活性基团反应的。其SH基可与PHgOH反应，因此可以除去过量的ITC试剂，在现有的定序技术中除去过量的ITC试剂，已成为一个主要的难题。该〔 〕组份与在氨基酸上发现的任何典型的基团应该没有特别的反应活性。适用的清除剂分子的例子是H2N-苯基-SH(氨基硫酚)，H2N-苯基-CH2SH(甲巯基)苯胺)，H2N-CH2-CH2-SH(胱胺)及前述的任何化合物的全卤化的类似物。特别适用的清除剂分子是(甲巯基)苯胺及胱胺。
其他考虑在定序的准备中，必须将肽或蛋白质用化学方法改性以阻止半胱氨酸及赖氨酸侧链的反应，从而防止在半胱氨酸侧链与固定化的有机汞制制之间的中间反应，并防止可导致与固定化的硼酸起中间反应的赖氨酸侧链的氨基发生改性。
实施例Ⅰ2，3-二羟基马来酰亚胺-4-异硫氰酸苯酯的合成(DHMPITC)(图2)将3.7克水合二羟基富马酸溶于80毫升的无水四氢呋喃中。再将含有5.2克的1，3-二环己基羰二酰亚胺的50毫升四氢呋喃溶液逐滴加到该酸溶液中。产生一种白色的固体沉淀并将沉淀从溶液中滤出。将含有2，3-二羟基马来酸酐的淡黄色溶液立即应用如下
将含有5克叔丁氧羰基-1，4-亚苯基二胺的50毫升四氢呋喃逐滴加到2，3-二羟基马来酸酐中，生成一种深橙色溶液并在约50℃加热4小时。使溶液冷却到室温然后蒸发至干。得到一种棕色带红的蜡状物质，然后将此粗产品溶于在二氧杂环己烷中的150毫升4N盐酸中并在室温下搅拌一小时。然后用纯氮气通入溶液中鼓泡以除去盐酸。将所得到的不均匀的混合物在减压下蒸发至干而产生一种暗棕色的固体。
将4′-(2，3-二羟基马来酰亚胺)苯胺粗产品悬浮于200毫升水中，向其中加入25毫升浓盐酸。搅拌所得到的深红色溶液同时加入二氯硫化碳2.3毫升。然后在室温下使反应进行3小时。将粗产品从溶液中滤出，用0.1N盐酸洗涤，然后溶解于氯仿中并用快速硅胶柱提纯，用氯仿洗脱。在真空下干燥首次洗脱下的产品，得到2，3-二羟基马来酰亚胺-4′-异硫氰酸苯酯。产率为64%。红外线分析表明在2100cm-1处有一异硫氰酸酯特性的强带，在3400cm-1处有一连羟基特性带。
实施例Ⅱ由N-苯基汞-N′-丙基甲硅烷基脲硅胶(PHgOH)合成将氨基丙基硅胶(1.5%N)，(粒度40微米不均匀及60A孔隙度)在80℃干燥三小时，然后在干燥器中冷却至室温。每一克氨基丙基硅胶需要用10毫升二氯甲烷溶解的0.8克N，N′-羰基二咪唑及0.13毫升的三乙胺。将氨基丙基硅胶加至该反应混合物中并在室温搅拌三小时。
将被活化的硅胶从溶液中滤出并用二氯甲烷洗涤再用二甲基甲砜(DMSO)洗涤2次。然后将被活化的硅胶立即加到含于DMSO中的10%乙酸对一氨基苯汞的溶液中。每一克的活化硅胶，需用7毫升的溶液。在40℃将反应混合物搅拌24小时。然后将改性的硅胶放回到用氨饱和了的DMSO溶液中，并在室温将反应混合物搅拌3小时。最后，将产品从溶液中滤出并用50%DMSO∶水，0.02N盐酸，1N氯化钠洗涤及再用水洗涤两次。然后使产品在室温下干燥。
实施例ⅢN-苯基硼酸-N′-丙基甲硅烷基脲硅胶(PBA)将氨基丙基硅胶(1.5%N)，(40微米不均匀的及60A平均孔隙度)，在80℃干燥3小时，然后在干燥器中使之冷却至室温。每一克的氨基丙基硅胶，需要用10毫升的二氯甲烷溶解的0.8克的N，′N′-羰基二咪唑及0.13毫升的三乙胺。将氨基丙基硅胶加到此反应混合物中并在室温下搅拌3小时。将活化硅胶从溶液中滤出并用二氯甲烷洗涤再用二甲基亚砜(DMSO)洗涤两次。然后将此活化硅胶立即加到含于90%的DMSO中的5.3%对-氨基苯基硼酸半硫酸酯的溶液中。每一克活化硅胶需用7毫升的溶液。在40℃将反应混合物搅拌24小时。然后将此改性的硅胶放回用氨饱和的DMSO的溶液中并将此反应混合物在室温下搅拌3小时。最后，将产品从溶液中滤出并用50%DMSO、0.02N盐酸、1N氯化钠洗涤再用水洗涤两次。然后使产物在室温下干燥。
实施例Ⅳ在定序中应用将2，3-二羟基马来酰亚胺-4′-异硫氰酸苯酯(DHMPITC)(实施例Ⅰ)溶于乙腈中其浓度为5%(重量/体积)。将50毫微克分子的血管紧张肽1溶解于200微升的固相定序缓冲液中(3∶2吡啶∶三氟乙酸N-甲基吗啉酯，pH8.2)并将其转移到一个1毫升的反应小玻瓶中。加入20微升的DHMPITC溶液。用氮气吹洗小玻瓶并在50℃加热15分钟。接着将50微升的5%(体积/体积)(甲巯基)苯胺溶液加至反应小玻瓶中并继续再加热15分。然后将小玻瓶从加热器上移开并将瓶中所装物质在真空和50℃下加热10分钟。
一支内径为4毫米的100毫克的N-苯基汞-N′-丙基正硅烷基脲硅胶(PHgOH)柱(实施例Ⅱ)预先用甲醇、水及200毫克分子的乙酸三甲基铵酯缓冲液，pH6.8洗涤备用。用3;2的乙酸三甲基铵酯(pH6.8)二氧杂环己烷缓冲液500微升溶解反应小玻瓶中的干物质并将其加到PHgOH柱中，用吸气法洗脱该柱再用另一份500微升的上述缓冲液洗涤。将流出液合并，并在50℃及真空中干燥30分钟。
向不装有过量的DHMPITC及(甲硫基)苯胺而装有2，3-二羟基-马来酰亚胺-4′-苯基硫代氨基甲酰肽的干残余物的小玻瓶中加入250微升的无水三氟乙酸并将小玻瓶加热到50℃十分钟。然后将小玻瓶中所装的物质在50℃及真空中干燥十分钟。
将一支100毫克的N-苯基硼酸-N′-丙基正硅烷基脲硅胶(PBA)的柱(内径4毫米)(实施例Ⅲ)用甲醇、水及50毫克分子乙酸三乙基铵酯缓冲液(pH8.2)洗涤备用。用500微升的1∶1乙酸三乙基铵酯(pH8.2)∶乙腈缓冲液溶解反应小玻瓶中的干物质并将其加到PBA柱上。用吸气法将残余的肽从柱上洗脱再用另一份500微升的上述缓冲液洗涤该柱。合并流出物，在真空中干燥并用于另一次定序循环。
用500微升的5∶3∶2的乙腈∶水∶三氟乙酸将2，3-二羟基马来酰亚胺-4′-苯胺基噻唑啉酮氨基酸从PBA柱上洗脱并在85℃加热15分钟，使之环化成相应的苯基乙内酰硫脲。
在一尺寸为4.6×150毫米的十八烷基柱上，用逆相高效液相色谱法(HPLC)鉴定所得到的2，3-二羟基-4′-苯基乙内酰硫脲。用加到0.15%(V/V)三氟乙酸的水缓冲液中的乙腈(达到40%(V/V)进行梯度洗脱来测定DHMPTH氨基酸的滞留时间。应用与紫外光检测相关联的荧光来检测。
权利要求
1.测定一种多肽末端氨基酸种类的一种方法，包括b)将所说的末端氨基酸与在所说的试剂上的所说的c部份偶合；c)除去过量的试剂；d)从剩余的上述多肽上裂解出上述试剂-末端氨基酸复合物；e)将剩余的上述多肽与上述试剂-末端氨基酸分离；f)将上述试剂末端氨基酸复合物转化成一种稳定的化合物；并且g)鉴定此转化了的末端氨基酸。
2.权利要求
1的方法还包括重复进行权利要求
1的步骤，对从上述f步骤中获得的上述剩余的多肽，进行多肽或蛋白质的定序，从而鉴定每一个循环的剩余的多肽的末端氨基酸。
3.权利要求
1的方法，其中的步骤c还包括(ⅰ)将步骤b的反应混合物与一种具有下列化学式的清除剂分子进行反应H2N-〔〕-SH，式中〔〕是一个烷基、芳基或全卤化了的烷基或芳基，反应是在有利于上述NH2部份与上述过量的试剂的上述c部分之间发生反应的条件下进行;(ⅱ)将步骤(ⅰ)的产品与固定化的有机汞制剂混合，以便结合过量的清除剂分子与清除剂分子-试剂复合物;及(ⅲ)除去未固定的试剂-多肽复合物。
4.权利要求
3的方法，其中清除剂是选自含有H2N-苯基-SH，H2N-苯基-CH2-SH，H2N-CH2-CH2-SH，及其全卤化衍生物的化合物组。
5.权利要求
4的方法，其中所说的清除剂是(甲巯基)苯胺。
6.权利要求
3的方法，其中所说的固定化的有机汞制剂包括键合到一种固定化的硅胶上的苯基汞氢氧化物。
7.权利要求
1的方法，其中步骤e还包括将步骤d的反应混合物与一种固定化硼酸混合，并除去未固定化的物质。
8.权利要求
7的方法，其中所说的固定化硼酸是将苯基硼酸键合到硅胶上。
9.权利要求
8的方法，其中所说的步骤e(ⅲ)包括用含水酸处理上述的固定化硼酸，以从其中除下所说的试剂-氨基酸复合物。
10.权利要求
3，4，5，及6的方法，其中将上述的有机汞制剂基质放置在一条柱中。
11.权利要求
7，8及9的方法，其中上述固定化的硼酸是被放置在一条柱中。
12.测定一种多肽的N-末端氨基酸种类的一种方法，包括a)获得2，3-二羟基马来酰亚氨-4′-异氰酸苯酯(DHMPITC);b)将上述多肽的末端氨基酸偶合到上述的DHMPITC上;c)将(甲巯基)苯胺加到步骤b所说的反应混合物中;d)在含有N-苯基硼酸-N′-丙基正硅烷基脲(PBA)的柱上洗提上述步骤c的反应混合物;e)在无水酸的条件下裂解步骤d的洗提液;f)将步骤e的反应混合物加到含有N-苯基硼酸-N′-丙基正硅烷基脲(PBA)的柱上;g)在含水酸的条件下，将由步骤f得到的固定化产物从PBA柱上洗脱;h)将从步骤g所得的洗脱液转化成稳定的苯基乙内酰硫脲氨基酸衍生物;以及i)鉴定步骤h的产物。
13.测定一种多肽的N-末端氨基酸的种类的方法，包括a)提供一种含有A-B-C形式的异硫氰酸酯或其衍生物的偶合试剂，式中A部份是一种顺式或共平面的1-2，或1-3二醇或者1-3羟基叔胺，而B部份是能用可见光、紫外光、荧光或电化学的方法来鉴定的任何发色团、荧光团或起电团(electrophore)，而c部份是能与一种多肽的末端氨基酸反应，以形成脲或硫脲键的功能团;b)将一种多肽的样品与一种偶合试剂接触而形成一种反应混合物，从而使偶合试剂的c部份与一种多肽的N-末端氨基酸反应而形成偶合试剂多肽复合物;c)用过量偶合试剂与一种清除剂分子反应以形成一种清除剂分子复合物，以便从反应混合物中除去过量的偶合试剂;d)将反应混合物与第一个固定化试剂接触以结合过量的清除剂分子，同时也可结合清除剂分子复合物，并由于与第一个固定化试剂接触而除下偶合试剂多肽复合物;e)将偶合试剂多肽复合物裂解以形成含有偶合试剂-多肽的N-末端氨基酸复合物和裂解后的多肽的一种混合物;f)将上述混合物与可和偶合试剂的A部分进行反应的第二个固定化试剂相接触，而使偶合试剂N-末端氨基酸复合物与裂解出来的残余多肽分离，以便将偶合的N-末端氨基酸复合物结合到固定化试剂上，并由于与第二个固定化试剂接触而将裂解出来的多肽除去;g)将偶合试剂N-末端氨基酸复合物转化成一个稳定化合物;以及h)鉴定在步骤f中形成的稳定的化合物。
14.权利要求
13的方法还包括重复进行权利要求
1的步骤，对从步骤e获得的裂解的多肽进行定序。
15.权利要求
13的方法，其中清除剂分子具有H2N-〔〕-SH化学式，式中〔〕是一个烷基或芳基或其全卤化的衍生物，第一个固定化试剂包括一种固定的有机汞制剂，而清除剂分子复合物是由清除剂分子的NH2部份与过量的偶合试剂的c部份之间进行反应形成的。
16.权利要求
15的方法，其中清除剂分子是选自包括H2N-苯基-SH，H2N-苯基-CH2SH，H2N-CH2-CH2SH及其全卤化的衍生物的一组化合物。
17.权利要求
16的方法，其中清除剂分子是(甲巯基)苯胺。
18.权利要求
15的方法，其中固定化有机汞制剂包括键合到硅胶上的苯基汞氢氧化物。
19.权利要求
13的方法，其中第二个固定化试剂包括固定化硼酸。
20.权利要求
19的方法，其中固定化的硼酸是键合到硅胶上的苯基硼酸。
21.权利要求
20的方法，其中步骤e还包括以含水酸处理固定化硼酸，以从其中除下键偶合试剂N-末端氨基酸复合物。
22.权利要求
15，16，17或18的方法，其中将固定化的有机汞制剂物质放置在一条柱中。
23.权利要求
19，20或21的方法，其中将固定化的硼酸放置在一条柱中。
24.测定多肽的N-末端氨基酸种类的方法包括a)提供一种偶合试剂包括2，3-二羟基马来酰亚胺-4′-异硫氰酸苯酯(DHMPITC);b)将多肽的一份样品与一种偶合试剂接触，因而使偶合试剂的异硫氰酸酯部份与多肽的N-末端氨基酸反应，以形成一种偶合试剂多肽复合物;c)将(甲巯基)苯胺加到反应混合物中，因而使过量的偶合试剂与(甲巯基)苯胺反应以形成一种清除剂分子复合物;d)通过含有N-苯基汞-N-丙基正硅烷基脲硅胶柱洗提步骤c的反应混合物，而将过量的(甲巯基)苯胺及清除剂分子复合物结合到柱上并形成含有偶合剂多肽复合物的洗提液;e)在无水酸条件下将步骤d洗提液的偶合试剂多肽复合物裂解，以形成裂解的多肽和含有偶合试剂及多肽的N-末端氨基酸的复合物的混合物;f)通过含有N-苯基硼酸-N′-丙基正硅烷基脲硅胶(PBA)柱，洗提步骤e的混合物，以使偶合试剂N-末端氨基酸复合物结合到柱上并形成含有裂解的多肽的洗提液;g)在含水酸条件下，使在步骤f中被结合到PBA柱上的偶合试剂N-末端氨基酸复合物，从柱上洗出而得到含有偶合试剂N-末端氨基酸复合物的洗提液;h)将步骤g的洗提液中的偶合试剂N-末端氨基酸复合物转化成一个稳定的苯基乙内酰脲氨基酸衍生物;以及i)鉴定在步骤h中形成的稳定的苯基乙内酰脲氨基酸衍生物。
专利摘要
一种利用液—固亲合色谱法对多肽定序的方 法。该方法利用一种试剂与末端氨基酸的氨基部分 在一个位置上的反应活性及与硼酸在另一位置上的 反应活性。该试剂与末端氨基酸偶合。具有一个巯 基与一个氨基的清除剂分子与过量的试剂反应，并用 一个固定化的有机汞制剂柱将过量的清除剂及清除 剂-试剂复合物除去。将末端氨基酸从多肽上裂解， 并偶合到一个固定化硼酸柱上。将氨基酸从柱上除 下并将其进行鉴定，而余下的多肽则进行另一次的循 环。
文档编号G01N33/68GK87100897SQ87100897
公开日1987年11月11日 申请日期1987年2月20日
发明者马克·L·斯托洛维兹 申请人:分析化学国际有限公司导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan