专利名称：生物分子相互作用实时相位检测分析方法及其系统的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，特别涉及用来实现监测两个以上生物分子如蛋白质-蛋白质、受体-配体、核酸-蛋白质、药物-蛋白质和核酸-核酸等之间的相互作用状况的方法及专用该方法的设备。
实时、原位对实验系统进行示踪，不需要诸如同位素或荧光之类的标记，是生物学家和医学家梦寐以求的。为了达到这一目的，瑞士发玛西亚生物技术有限公司(Pharmacia Biotech.)利用表面等离子体共振(Surfacd Plasmon Resonance简称SPR)原理，构建了生物分子相互作用实时分析系统，成功地实现了无需标记或一些繁琐操作程序，进行检测生物分子之间的相互作用，分析分子间如何结合和离解，强度和速度是多少，是否有空间异位效应等。1990年，该公司推出商品，其检测原理如
图1所示由半导体激光器1发出的激光以临界角透过棱镜2、垫补层3(其作用是消除棱镜2与玻璃基片4之间的气隙)和玻璃基片4，射到玻璃基片4与透明生物传感层6的界面上，会产生反射，反射光的强度基本上等于入射光的强度。但是，在玻璃基片4上镀一层50nm厚的金膜5后，入射光的一部分能量就会和金膜表面的自由电子作用，激起共振，沿共振波传播方向衰减，从而引起反射光的强度在一特定的角度方向上大大减弱，甚至消失，反射光消失的角度称为共振角。共振角随传感层表面的折射率发生变化，折射率又随从样品槽7流过的样品中生物分子与传感层上固定的生物分子作用情况发生化。反射光由光电探测器8接收，转换成电信号，而后由计算机进行处理。发玛西亚公司采用角度扫描衰减全反射方法，通过测量在共振角反射光的强度变化来探测生物分子之间的相互作用状况，该方法也可称为光强检测法。这种方法的不足之处一是光源光强波动会影响检测精度，光源光强波动又是难以避免的；二是分辨率不够高，提高分辨率会使电路太复杂；三是获得信息有限，会丢失一些很有意义的生物信息。
本发明的目的在于为克服上述光强检测法的缺点和不足，提供一种新的生物分子相互作用实时检测方法及其用于该方法的生物分子相互作用实时检测系统。不仅可以实现实时检测生物分子之间的相互作用，得到生物分子间如何结合和解离、结合和解离的强度及速度大小、是否存在空间及异位效应等信息，而且具有灵敏度和可靠性都高，还可得到空间耦联结构变化、信号传导特征和结构与功能关系等其它有关信息的优点。
本发明提出一种采用相位测量的生物分子相互作用实时检测方法，其特征在于1)由横向塞曼激光器全反射端透过的“尾光”，通过检偏器后被光电探测器接收，转换为电信号，作为参考信号输入双向差动数字鉴相相位卡；2)由横向塞曼激光器输出端发出的激光从梯形棱镜的一个腰面射入，透过底面和镀在底面上的金膜，射到金膜和覆盖其上的生物传感层之间的界面上，入射光从该界面反射又透过底面和另一个腰面，通过检偏器后由光电探测器接收，转换为电信号，作为测量信号输入双向差动数字鉴相相位卡；3)相位卡对输入的两路信号进行差动数字鉴相，得到相位差数据，由计算机读入进行基于相位的处理和分析。
本发明所说的横向塞曼激光器的频差可在50-500Khz之间；所说的梯形棱镜底面镀的金膜厚度可在30-45nm之间；所说的生物传感层可由依次覆盖在该金膜上的共价固定的嗜水性基体层、葡聚糖层、配体生物分子层构成；所说的梯形棱镜与光电探测器之间的检偏器，横向塞曼激光器与光电探测器之间的检偏器都可安装在与光轴成45°夹角的位置上。
本发明按照上述的检测方法的生物分子相互作用实时相位检测分析系统，由生物传感单元、输样单元、信号处理单元三大部分组成，其特征在于，所说的生物传感单元为基于相位检测SPR生物传感单元，由梯形/三角棱镜和镀在其底面的金膜、生物传感层，以及置于其下的样品槽构成的传感器的核心部件；置于该棱镜一侧的横向塞曼激光器，及设置在该激光器的全反射端的检偏器，探测器构成的参考臂，置于该棱镜另一侧的输出光轴上的检偏器，探测器构成的测量臂；所说的信号处理单元由双向差动数字鉴相相位卡和计算机组成。
上述系统的横向塞曼激光器、梯形棱镜、样品槽、检偏器和探测器可放置在恒温箱中；所说的双向差动数字鉴相相位卡，它是在现场可编程阵列器件中，通过编程实现，直接插入计算机通用插槽中的一块电路板；所说的输样单元由通过单向阀相连的选样器、输样器构成。
本发明提供的这种生物分子相互作用实时相位检测方法及其专用于该方法的生物分子相互作用实时相位检测分析系统，它能通过探测发生在金膜表面上生物分子相互作用时引起反发射光相位变化，经鉴相处理后得到相位变化数据，再由计算机用专门软件进行分析，得到有关的生物信息。本发明可以实现实时检测生物分子之间的相互作用，得到生物分子间如何结合和解离、结合和解离的强度及速度大小、是否存在空间及异位效应等信息，而且具有灵敏度和可靠性都高，还可得到空间耦联结构变化、信号传导特征和结构与功能关系等其它有关信息的优点。
附图简要说明图1为已有的一种生物分子相互作用实时检测原理示意图。
图2为本发明的一种实施例系统组成总体结构示意图。
图3为本实施例的基于相位检测的生物传感单元结构示意图。
图4为本实施例传感器的核心元件结构示意图。
图5为本实施例的取样器结构示意图。
图6为本实施例的加样器结构示意图。
图7为本实施例双向差动数字鉴相相位卡示意图。
图8为本实施例数字鉴相相位卡中的数字鉴相部分示意图。
下面结合附图对采用本发明的SPR相位检测方法的生物分子相互作用实时相位检测分析系统的实施例进行说明。
本实施例由基于相位检测的SPR生物传感单元、输样单元、信号处理单元三大部分组成，如图2所示。其中，基于相位检测SPR生物传感单元包括横向塞曼激光器9，检偏器13、18，探测器14、17，由梯形棱镜10和镀在其底面的金膜19和传感层20、21、22，以及置于其下的样品槽12构成的传感器的核心部件；输样单元包括通过单向阀24、26相连的选样器23、输样器25；信号处理单元由双向差动数字鉴相相位卡28和计算机27组成。
本实施例的工作原理为选样器23在计算机控制下选定所需的样品，打开阀门24。接着，输样器25在计算机指令控制下将样品吸入。吸入后，阀门24关闭，阀门26打开，输样器25缓缓地将样品输送到样品槽中。由横向塞曼激光器9输出端发出的激光透过梯形棱镜10的一个腰面和金膜19，射到金膜19与传感层20、21、22的界面上。当样品流过样品槽12，样品中的受体分子与传感层上的配体分子结合，反射光的相位就发生变化，经检偏器13后，由探测器14转换成电信号，作为测量信号输入双向差动数字鉴相相位卡28。由塞曼激光器9的全反射面透过的“尾光”经检偏器18后，由探测器17转换成电信号，作为参考信号，输入双向差动数字鉴相相位卡28。相位卡28在测量信号与参考信号同时到达后，即时进行处理，求出相位差，由计算机27读入内存进入处理分析。
本实施例各部分组成及其功能分别详细说明如下基于相位检测的SPR生物传感单元如图3所示，它由横向塞曼激光器9，梯形棱镜10，密封圈11，给样槽12，检偏器13、18，光电探测器14、17和恒温箱15、16组成。
传感器的核心元件如图4所示，其中，梯形棱镜10的材料是火石玻璃(折射率n=1.749)，其两腰面和底面经光学加工，平面度达到0.00012mm，并且在底面上镀有40nm厚的金膜19，金膜上覆盖由一层共价固定的嗜水性基体20，在该基体上又覆盖一层葡聚糖21，可提供表面相互任用的嗜水环境，再将配体生物分子22固定上去，这三层统称为传感层。样品槽12与梯形棱镜之间有一个密封圈11，防止样品渗漏。横向塞曼激光器9、检偏器18和光电探测器17安装在恒温箱16中，梯形棱镜10、密封圈11、样品槽12、检偏器13和光电探测器14安装在恒温箱15之中。
由横向塞曼激光器9发出的正交P线偏振光和S线偏振光透过梯形棱镜10的一个腰面、底面和金膜层19，射到金膜和传感层的界面上。P偏振光激发表面等离子波，反射后不仅光强发生变化，而且相位也发生变化。S偏振光不能激发表面等离子波，相位不变。当梯形棱镜底面上固定的生物分子与样品中的生物分子结合时，反射光随之变化。检偏器13与光轴成45°夹角，使得透过的P光和S光都最强。反射光透过检偏器13后，由探测器14接收，转换成电信号，称为测量信号。由横向塞曼激光器的全反射面透过的“尾光”经与光路成45°的检偏器18后，由光电探测器17接收，转换成电信号，称为参考信号。
输样单元的选样器如图5所示，它由样品工位选择驱动电机29，丝杆支撑轴承30、46，升降电机31，连轴节32，转盘33，升降电机座34，润滑垫35，底盘36，样品试管37，定位珠座38，弹簧39，工位板40，定位珠41，吸样头座42，吸样针座43，针头44，轴承端盖45，丝杆47，挡转屑48，轴承支架49和支撑杆50组成。工件板40上有12个均布的工位孔，孔径为12mm，可同时放置12个样品或试剂。工位孔的中心圆直径为106mm。工位板40通过4根支撑杆50与底座36连接，固定不动。轴承30安装在转盘33上。轴承架49与转盘33固定在一起，可以一起转动。工位选择驱动电机29安装在底座36上，与转盘33之间是摩擦传动。电机29在计算机控制下，带动转盘33以及安装在其上的轴承架48和轴承30，安装在轴承架48上的轴承46和轴承端盖45，由轴承30、46支撑的丝杆47，由丝杆47传动的吸样头座42和安装在其上的吸样针头43、44及挡转屑48一起转动。定位珠座37安装在转盘33上，弹簧39安装在定位珠座38中，弹簧39顶住定位珠41。当转盘33转到希望的工位后，电机29停止转动，定位珠41自动嵌入工件板40上的凹窝内，保证工位准确。样品试管37放置在工位板40的工位孔中。轴承46安装在轴承架49的轴承孔中。丝杆47由轴承30、46支撑，轴承端盖45可以调整轴的运动，保证丝杆47转动时既轻松，又没有轴向窜动。吸针44固定在吸针座43上，两者构成吸样头，固定在吸样头座42上，随升降电机31的转动而抬起或落下。升降电机31安装在电机座34中，电机座34与底座36固定在一起。转盘40与电机座34之间有一个聚四氟乙稀滑动垫35，保证转盘40转动时摩擦力较小。电机31与丝杆47通过连轴节32连接。电机31在计算机控制下，带动丝杆47转动，吸样针头座42在挡转屑48的作用下，不能转动，只能升降，从而带着吸样头从样品试管37中抬起或者插入。
输样单元的输样器如图6所示，它由底座51，电机座52，电机53，连轴节54，轴承端盖55，轴承56，轴57，螺母58，密封圈59、61，套筒60，套筒端盖62，进样头63，顶珠64，顶珠座65，支架66，调节螺钉67，出样头68，挡转架69和挡转屑70组成。电机座52和支架66安装在底座51上。电机53安装在电机座52上。轴承端盖55，轴承56，顶珠座65，调节螺钉67和挡转架安装在支架66上。轴57由轴承56和顶珠64支撑，由调节螺钉67和轴承端盖55调整轴57的轴向窜动和轴承的预紧力。轴57和电机53通过连轴节54连接。顶珠64安装在轴57与顶珠座65之间。螺母58，端盖62，进样头63，出样头68和挡转屑70都安装在套筒60上。套筒60装在轴57的外面，之间有密封圈59、61，防止样品渗漏。轴57与套筒60通过螺母58传动。轴57的一半为螺纹，用于传动螺母，使套筒60运动；另一半为光杆，与套筒60内孔之间的间隙为1.5mm左右，挡转屑70穿过挡转架69上的长槽安装在套筒60上。电机53在计算机控制下正转，轴57随之正转，经过螺母58传动，使套筒60和其上的端盖62，进样头63，出样头68和挡转屑70一起运动。由于挡转屑70的作用，套筒60不能转动，只能向左平动，密封圈59、61之间的距离变大，将样品由进样头63吸入，进到套筒60与轴57之间的腔室中。当电机53反转时，套筒57向右平动，密封圈59、61之间的距离变小，样品通过出样头68从套筒60与轴57之间的腔室中排出，进到样品槽12中。
信号处理单元的双向差动数字鉴相相位卡如图7所示，它由过零比较，光电隔离，正向差动鉴相，反向差动鉴相，高频脉冲，同步复位，计数同步控制，计数/锁存和I/O控制等部分组成。过零比较电路是在信号的零点，比较器翻转，把正弦信号变成方波。光耦隔离电路将模拟电路部分和数字电路部分隔开，既避免外界干扰计算机又防止计算机的地线上多次谐波噪音对模拟信号的影响。同步复位电路消除鉴相器复位时，测量信号与参考信号不同步而造成测量结果的多值性。计数同步电路保证计数器计数开始和停止的时间隔为信号周期的整数。高频脉冲提供比较测量信号与参考信号的相位差时填数用，频率高意味着分辨率高。计数/锁存部分是计测量信号与参考信号之间相位差的数据，并锁存以备计算机读入。I/O控制是相位卡与计算机之间指令与数据交换接口。除过零比较和光耦隔离部分外，其余部分是在现场可编程阵列器件(Field ProgrammableGate Array，简称FPGA)中，通过编程实现。现场可编程阵列器件不仅工作频率很高，而且可以使线路的延时降到最低和抗干扰能力大大提高。
参考信号和测量信号输入相位卡后，分别通过过零比较电路，变成方波信号，而后进入光耦隔离电路，实现模拟电路与数字电路隔离。光耦隔离电路输出信号输入现场可编程阵列器件(FPGA)。如果是上升沿比较，由正向差动鉴相部分实现反之，由反向差动部分实现。鉴相后得到的相位差数据由各自的锁存器锁存。计算机通过I/O控制部分控制相位卡的工作，包括从锁存器中读出数据进行处理和分析。
差动鉴相部分是相位卡的重要组成部分，如图8所示。正、反向差动鉴相各有一套电路，它由D触发器、异或鉴相、同或鉴相、同相计数、反向计数、高速脉冲、符号判断与逻辑综合等部分组成。D触发器将输入信号二分频，保证占空比为1∶1，同时还把量程由0°到360°扩大到0°到720°。异或鉴相逻辑部分是求出相位差区间，同或鉴相逻辑与之互反。高速脉冲是用于填入相位差区间内，从而得到相位差数据。脉冲频率高，意味着相位差的分辨率高。同相计数是计填入信号上升沿鉴相时得到的相位差区间里的脉冲数，即为相位差数据；反之，计数与之类似。符号判别是判定+180°或+360°，还是-180°或-360°。逻辑综合部分是对相位差的正负和有关数据进行综合，综合结果锁存在锁存器中，以备计算机读入。
由光耦隔离输出的两路方波信号进入差动鉴相部分，先分别通过D触发器进行二分频，而后进行“异或”或“同或”鉴相，并同时进行相位的正负判断。在差动鉴相过程中，求相位差的同时高频脉冲即填入相位差区间，对应的计数器同步计数，所计的数即为相位差数据。最后，经逻辑综合后，数据进入锁存器，等待计算机读出。双向差动数字鉴相相位卡为一块电路板，直接插在计算机中的通用插槽内。
权利要求
1.一种采用相位测量的生物分子相互作用实时检测方法，其特征在于1)由横向塞曼激光器全反射端透过的“尾光”，通过检偏器后被光电探测器接收，转换为电信号，作为参考信号输入双向差动数字鉴相相位卡；2)由横向塞曼激光器输出端发出的激光从梯形棱镜的一个腰面射入，透过底面和镀在底面上的金膜，射到金膜和覆盖其上的生物传感层之间的界面上，入射光从该界面反射又透过底面和另一个腰面，通过检偏器后由光电探测器接收，转换为电信号，作为测量信号输入双向差动数字鉴相相位卡；3)相位卡对输入的两路信号进行差动数字鉴相，得到相位差数据，由计算机读入进行基于相位的处理和分析。
2.按权利要求1所述检测方法，其特征在于，所说的横向塞曼激光器的频差在50-500Khz之间。
3.按权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所说的梯形棱镜底面镀的金膜厚度在30-45nm之间，所说的生物传感层由依次覆盖在该金膜上的共价固定的嗜水性基体层、葡聚糖层、配体生物分子层构成。
4.按照权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所说的梯形棱镜与光电探测器之间的检偏器，横向塞曼激光器与光电探测器之间的检偏器都是安装在与光轴成45°夹角的位置上。
5.一种按照权利要求1所述的检测方法的生物分子相互作用实时相位检测分析系统，由生物传感单元、输样单元、信号处理单元三大部分组成，其特征在于，所说的生物传感单元为基于相位检测SPR生物传感单元，由梯形/三角棱镜和镀在其底面的金膜、生物传感层，以及置于其下的样品槽构成的传感器的核心部件；置于该棱镜一侧的横向塞曼激光器，及设置在该激光器的全反射端的检偏器，探测器构成的参考臂，置于该棱镜另一侧的输出光轴上的检偏器，探测器构成的测量臂；所说的信号处理单元由双向差动数字鉴相相位卡和计算机组成。
6.按照权利要求5所述的检测分析系统，其特征在于，所说横向塞曼激光器、梯形棱镜、样品槽、检偏器和探测器放置在恒温箱中。
7.按照权利要求5所述的检测分析系统，其特征在于，所说的双向差动数字鉴相相位卡，它是在现场可编程阵列器件中，通过编程实现，为直接插入计算机通用插槽中的一块电路板。
8.按照权利要求5所述的检测分析系统，其特征在于，所说的输样单元由通过单向阀相连的选样器、输样器构成。
全文摘要
本发明属于生物技术领域，由生物传感单元、输样单元、信号处理单元三大部分组成，生物传感单元由梯形/三角棱镜和镀在其底面的金膜、生物传感层，以及置于其下的样品槽；横向塞曼激光器，及检偏器，探测器构成；信号处理单元由双向差动数字鉴相相位卡和计算机组成。具有灵敏度和可靠性都高，还可得到空间耦联结构变化、信号传导特征和结构与功能关系等其它有关信息的优点。
文档编号G01N21/41GK1237705SQ99107780
公开日1999年12月8日 申请日期1999年5月28日 优先权日1999年5月28日
发明者余兴龙, 蒋弘, 殷纯永 申请人:清华大学