每种包被抗原按 40.0 μ g/mL、20.0 μ g/mL、10.0 μ g/mL、5.0 μ g/mL、2.5 μ g/mL、
1.25 μ g/mL,0.625μ g/mL、0.3125 μ g/mL 的系列稀释度包被酶标板，100 μ L/ 孔，0-4°C放置过夜，用洗涤液洗板三次，每次拍干；250 μ L/孔封闭溶液封闭，室温放置2小时，洗板三次，每次拍干；加入100 μ L/孔一系列稀释的抗体(1: 100至1:1024000)，室温放置2.5小时，洗板三次，每次拍干；加入100 μ L/孔的1:1000的辣根过氧化酶-羊抗兔IgG抗体，室温放置I小时，洗板三次，每次拍干；加入100 μ L/孔的发光液，测定发光值。以发光值随包被抗原的浓度有明显梯度变化的包被抗原浓度和抗体稀释度为最佳浓度进行特异性测定。
[0031](2)抗体灵敏度的测定
根据上述对抗体及包被抗原浓度的优选实验，申请人选择并确定抗体浓度为1:1000，包被抗原浓度为10 μ g/mL进行抗体的灵敏度的测定:
a、包被:用0.05M pH9.6的碳酸盐包被溶液将托布津的包被抗原配成10 μ g/mL的溶液，每个聚苯乙烯板的反应孔中加100yL，4°C过夜；
次日，弃去孔内溶液,用洗涤缓冲液洗3次，300 μ L/孔，每次5分钟，拍干；(此步简称洗涤，下同)；
b、封闭:用封闭溶液封闭上述已包被的酶标板,250μ L/孔,室温孵2-4小时,然后洗涤；
C、加样:加稀释托布津抗体(1:1000) 50 μ L/孔与不同浓度的托布津溶液50 μ L/孔于上述已封闭的反应孔中，室温2-4小时，然后洗涤；
d、加酶标抗体:于各反应孔中，加入新鲜稀释辣根过氧化酶-羊抗兔IgG的抗体(I: 1000) 100 μ L/ 孔，1.5 小时，洗涤；
e、发光:于各反应孔中加入临时配制的发光溶液100μ L/孔，立即用化学发光免疫分析仪检测；
f、检测结果以抑制率计算:
抑制率(％) = B/Bo%，B是不同浓度的药物作为竞争者的发光值，Bo是不加药的发光值
计算50 %抑制率时药物的浓度即为该抗体的灵敏度。
[0032]实施例3、检测托布津的化学发光酶联免疫试剂盒
(I)检测托布津的化学发光酶联免疫试剂盒的组成
a、包被有包被抗原(托布津与载体蛋白的偶联物)的固相载体(酶标板)；
b、托布津标准溶液:0mg/kg,0.lmg/kg, 0.3mg/kg,0.9mg/kg, 2.7mg/kg 和 8.lmg/kg ；
c、酶标羊抗兔抗体溶液:酶标羊抗兔抗体为辣根过氧化酶-羊抗兔IgG原液，装入，使用时用洗涤溶液配制成1:1000的工作浓度；
d、托布津抗体溶液:用人工免疫抗原免疫动物制备所得的多克隆抗体，将所得托布津抗体用洗涤溶液稀释成1:1000工作浓度；
e、发光溶液:使用pH8.8的0.0001M对甲苯酚的三(羟甲基)氨基甲烷溶液配制成
0.0lM的鲁米诺溶液，再与H2O2按照3:10000的体积比混合；
f、洗涤溶液:含有体积分数0.05%吐温-20的pH7.5,0.lmol/L磷酸盐缓冲液；
g、包被溶液:1.59g碳酸钠和2.53g碳酸氢钠溶于IL水中，调节pH9.5 ；
h、封闭溶液配制:10g卵清蛋白(OVA)溶于IL洗涤溶液中，再加入重量比为0.05%的NaN3O
[0033](2)酶标板的制备
用包被液将包被抗原稀释成10 μ g/mL,每孔加入100μ L,4°C过夜,倾去包被液,每孔加入250 μ L洗涤液洗涤3次，拍干，然后每孔加入封闭液250 μ L，37°C孵育lh，倾去孔内液体，洗涤液洗涤3次，拍干，用锡箔纸真空密封保存。
实施例
[0034]4、检测托布津的化学发光酶联免疫试剂盒的应用
(I)试剂的配制
a.样品稀释液:将试剂盒中提供的浓缩磷酸盐缓冲溶液用蒸馏水稀释10倍后使用；
b.洗涤溶液:将试剂盒中提供的浓缩洗涤液用蒸馏水稀释10倍后使用；
c.发光溶液:0.0lM鲁米诺+0.0OlM对甲苯酚的三(羟甲基)氨基甲烷溶液(pH8.8)+3/10000(体积比)H2O20
[0035](2)样品前处理
(1)配制氯仿-甲醇溶液(体积比为1:1);
(2)研磨代表性样品(使50%的样品可以通过一个20目的滤网)；
(3)称量20g研磨过滤后的样品加入40 mL氯仿-甲醇溶液，样品稀释比为1:2(w/
V);
(4)在密封的容器里混合，震荡涡旋Imin ；
(5)室温离心4000r/min以上，1min;取离心后的上清液或过滤后的滤液I mL，50?60
°C水浴氮气吹干；
(6)加入标准品稀释液ImL并充分混勻,4000 r/min离心5 min或用定量分析滤纸过滤，取离心后的上清或过滤后的滤液进行分析。
[0036](3)检测步骤
a.加样:向酶标板微孔中加入托布津系列标准浓度溶液或样品溶50μ L，然后加入托布津抗体溶液50 μ L，室温(25 °C )恒温孵育2.5h ；
b.洗涤:倾出孔中液体,每孔加入洗涤溶液250μ L,洗涤3次，拍干；
c.加酶标羊抗兔抗体溶液:每孔加入酶标羊抗兔抗体溶液100μ L，室温恒温孵育Ih ；
d.洗涤:倾出孔中液体,每孔加入洗涤溶液250μ L,洗涤3次，拍干；
e.加发光溶液:每孔加入发光溶液100μ L ;
f.检测:用化学发光免疫分析仪测定每孔的发光强度。
[0037](4)结果判断
所获得的标准品和样品发光值的平均值除以第一个标准(O标准)的发光值再乘以100，以抑制率为纵坐标，托布津浓度的对数为横坐标作标准曲线，每一个样品的浓度可以从标准曲线上读出。
[0038]抑制率(*%)=标准品发光值(或样品)X 100% /0标准品发光值。
[0039]实施例5试剂盒精密度和准确度试验
取 0.lmg/kg, 0.3mg/kg,0.9mg/kg,2.7mg/kg 和 8.lmg/kg 的托布津标样,添加到牛奶样品中，来检测托布津回收率。每个浓度的批间变异系数都以不同的5天的5个重复数据进行计算，批内变异系数以同一天的5次重复数据计算。
[0040]根据制定的标准曲线的线性方程进行回收率的定量计算。
[0041]从上述测定结果看，变异系数低于24.7%，回收率在78-120%之间。表明本试剂盒有很好的重复性和准确度。
【主权项】
1.一种托布津的化学发光酶联免疫检测试剂盒，包括盒体，设在盒体内的酶标板和设在盒体内的试剂；其特征在于，所述酶标板的各孔包被有以托布津母核与卵清蛋白偶联制成的包被抗原；所述试剂包括:托布津类单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体、托布津类系列标准溶液、浓缩磷酸盐缓冲液、浓缩洗涤液、化学发光液。
2.根据权利要求1所述托布津类的化学发光酶联免疫检测试剂盒，其特征在于:所述酶标板为乳白色不透明聚苯乙烯96孔化学发光酶标板。
3.根据权利要求1所述托布津类的化学发光酶联免疫检测试剂盒，其特征在于:所述包被抗原浓度为10 μ g/mL。
4.根据权利要求1所述托布津类的化学发光酶联免疫检测试剂盒，其特征在于:所述托布津单克隆抗体的工作浓度为1: 64000。
5.根据权利要求1所述托布津类的化学发光酶联免疫检测试剂盒，其特征在于:所述托布津的单克隆抗体是由托布津母核与牛血清蛋白偶合制成的偶联物作为免疫原免疫Balb/c小鼠制备获得。
6.根据权利要求1所述托布津的化学发光酶联免疫检测试剂盒，其特征在于:所述托布津系列标准溶液浓度分别为:0mg/kg,0.lmg/kg,0.3mg/kg,0.9mg/kg, 2、7mg/kg和8.lmg/kg0
7.根据权利要求1所述托布津的化学发光酶联免疫检测试剂盒，其特征在于:所述浓缩磷酸盐缓冲液是每升含NaH2PO4.2H20 5.74g、Na2HPO4.12 H2O 32.6g的水溶液。
8.根据权利要求1所述托布津的化学发光酶联免疫检测试剂盒，其特征在于:所述浓缩洗涤溶液是含有体积分数0.05%吐温-20的pH = 7.4,0.lmol/L磷酸盐缓液。
9.根据权利要求1所述托布津类的化学发光酶联免疫检测试剂盒，其特征在于:所述化学发光液A液为鲁米诺含量为0.01M、对甲苯酚含量为0.0OlM pH8.8的三(羟甲基)氨基甲烷溶液液为10mL溶液含柠檬酸2.lg，无水Na2HPO4 2.82g，0.75%的过氧化氢脲0.64mL的溶液，所述百分比为质量百分比。
【专利摘要】本发明公开了一种托布津的化学发光酶联免疫检测试剂盒，包括盒体，设在盒体内的酶标板和设在盒体内的试剂；其特征在于，所述酶标板的各孔包被有包被抗原即托布津类母核与载体蛋白的偶联物；所述试剂包括：托布津类单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体、托布津类系列标准溶液、浓缩磷酸盐缓冲液、浓缩洗涤液、化学发光液；本发明的化学发光酶联免疫检测试剂盒具有高灵敏度、简便快速、准确度高、检测药物种类多的特点，与传统的比色ELISA法比较，操作时间大幅度减少。
【IPC分类】G01N33-577
【公开号】CN104655844
【申请号】CN201310581873
【发明人】洪霞, 其他发明人请求不公开姓名
【申请人】南京亿特生物科技有限公司
【公开日】2015年5月27日
【申请日】2013年11月20日