基于拉曼光谱技术结合微藻油脂峰的氮营养环境监测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及微藻生长环境监测技术领域，尤其涉及一种基于拉曼光谱技术结合微藻油脂峰的氮营养环境监测方法。
【背景技术】
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[0002]微藻是一类可以将二氧化碳转化为潜在的生物燃料、食品、饲料和高价值的生物活性分子并能进行光合作用的真核微生物。微藻具有生态和生物学价值，是一种重要的生物质资源。
[0003]小球藻是一类单细胞绿藻，属于绿藻门、绿藻纲(Chlorophyceae)、绿球藻目、软囊藻科、小球藻属，广泛分布于自然界，淡水水域中种类最多。目前全球范围已知的小球藻有15种左右，并且有多达百种以上的变种。小球藻细胞形状一般为球形或者椭球形，直径2-12 μπι。已有研宄表明，小球藻含丰富的蛋白质、脂质、多糖、食用纤维、维生素、微量元素和活性代谢产物。近年来，我国已开始重视小球藻的开发利用。综上所述，小球藻具有重要的经济和科研价值，具有广阔的应用前景。
[0004]拉曼光谱是一种散射光谱，是研宄分子振动的一种光谱方法，它的原理和机制与红外光谱不同，红外光谱对极性基团有很强的检出能力，而非极性基团如C = c、c-c等则具有很强的拉曼活性。但它们提供的结构信息是类似的，都是关于分子内部各种分子振动频率及有关振动能级的情况，所以能从分子水平上反映样品化学组成和分子结构上的差异，实现分子中某些化学键和官能团的“指纹鉴别”。另外水的拉曼散射很微弱几乎不产生干扰信号，使得拉曼在研宄水溶液中的活体生物的无损检测上具有其他分子光谱无法比拟的优势。
【发明内容】
[0005]本发明提供了一种基于拉曼光谱技术结合微藻油脂峰的氮营养环境监测方法，解决了现有检测方法需要对样本进行染色或复杂的化学处理，操作相对繁琐、耗时、耗力的问题。通过对采集到的拉曼信号进行预处理克服了拉曼光谱强度值容易受微藻不同生长阶段、不同曝光时间以及色素随时间推移产生分解等的影响。
[0006]一种基于拉曼光谱技术结合微藻油脂峰的氮营养环境监测方法，包括以下步骤:
[0007](I)采用拉曼光谱仪，获取活体藻液样本在不同氮营养状态下的拉曼光谱原始信息;
[0008](2)对步骤(I)中获得的拉曼光谱原始信息进行预处理，得到预处理谱图，提取谱图中多个谱峰对应的拉曼强度值；
[0009](3)以步骤(2)中的拉曼强度值作为输入，不同氮营养状态作为输出，建立基于多元回归算法的判别模型；
[0010](4)取待监测活体藻液，通过步骤⑴和步骤(2)的处理该活体藻液特征峰处的拉曼强度值并输入所述判别模型，获得待监测藻液的氮营养状态。
[0011]在本发明中，拉曼光谱仪具体选用雷尼绍显微共焦拉曼光谱仪，在对样品进行信息采集时，都是在恒温(约25°c )条件下进行的。
[0012]在步骤(I)中，将制好的藻液滴于载玻片上，用盖玻片压平整(避免产生气泡)，然后固定在显微拉曼光谱仪物镜下方载物台上，利用激光强度为Imv的激光束，并通过50X的物镜聚焦到样本的表面，曝光时间ls，得到所述的拉曼光谱原始信息。同时，考虑到分类对象是活体微藻，由于活体微藻样本在采集时容易出现样本漂移或者是采样点容易移动等问题，需对载玻片上的藻液采用琼脂进行固定。
[0013]在步骤(2)中，所述的预处理为依次进行的平滑处理、基线校正和归一化处理。
[0014]由于原始拉曼受荧光干扰较大，荧光的产生会覆盖拉曼的信号，因此首先采用平滑和基线校正的方法去除荧光的干扰，凸显信号，且平滑和基线校正处理均基于拉曼光谱仪附带的软件WIRE3.3。归一化处理，主要是为了消除微藻不同生长阶段、不同曝光时间以及色素随时间推移产生分解等的影响，采用软件unscrambler 9.7实现。
[0015]本发明中，所述的活体藻液样本为蛋白核小球藻。由于该藻种油脂含量较高，容易受环境氮的影响积累一定的油脂成分，同时藻的个体大小适合在显微拉曼下进行观察。
[0016]在所述的步骤(3)中，所述多元回归算法为偏最小二乘回归法算法、主成分回归算法、逐步回归算法、人工神经网络算法、支持向量机算法或LDA模型，优选的多元回归算法为LDA模型。LDA鉴别分析的基本思想是将高维的模式样本投影到最佳鉴别矢量空间，以达到抽取分类信息和压缩特征空间维数的效果，投影后保证模式样本在新的子空间有最大的类间距离和最小的类内距离，即模式在该空间中有最佳的可分离性。因此，它是一种有效的特征抽取方法。
[0017]在步骤⑴和步骤⑷中，氮营养状态包括微藻生长过程中1/4氮、1/2氮、正常氮、2倍氮、4倍氮。藻类的养殖一般采用正常氮进行培养，本研宄出于实验目的，将氮营养进行梯度设置，同时结合实际培养状态，将梯度设置为上述几类。
[0018]与现有技术相比，本发明的有益效果为:
[0019]本发明实现了基于拉曼光谱技术结合微藻油脂峰的氮营养环境监测方法，不需要配制任何溶液以及化学测定，大大简化了操作步骤，缩短了检测时间，也避免了由于操作人员操作不熟练或者主观因素带来的测量结果不准确等后果。通过对拉曼信号进行归一化处理克服了拉曼光谱强度值容易受微藻不同生长阶段、不同曝光时间以及色素随时间推移产生分解等的影响。
【附图说明】
[0020]图1为蛋白核小球藻样本在不同氮营养状态下的原始拉曼谱图。
[0021]图2为蛋白核小球藻样本预处理后在不同氮营养状态下的拉曼谱图。
【具体实施方式】
[0022]下面结合具体实施例进一步阐释本发明。
[0023]取正常氮营养状态下的蛋白核小球藻样本，采用雷尼绍显微共焦拉曼光谱仪(inVia - Reflex 532/XYZ)，获取活体藻液样本的拉曼光谱原始信息。即将制