一种基于功能核酸利用共振散射光谱检测17β-雌二醇的方法
【技术领域】
[0001] 本发明食品领域，涉及一种检测食品的方法，尤其涉及一种17 β-雌二醇，具体来 说是一种基于功能核酸利用共振散射光谱检测17 β -雌二醇的方法。
【背景技术】
[0002] 环境雌激素，又称"内分泌干扰化合物"，是一类广泛地存在于环境中的污染物，可 扰乱人体及动物体的正常内分泌功能，改变机体在发育和成年阶段胞内信号过程，从而造 成它们的生殖、免疫、神经等系统的多种病变。然而，17 β -雌二醇是诸多环境雌激素中作 用最强烈的一种，普遍存在于各类环境，特别是水环境中，食品比如牛奶，蜂蜜等。17 β -雌 二醇在动物和人体内合成，具有内源性激素的活性，对人类和动物的影响是通过模拟、干扰 或对抗机体内生荷尔蒙原有的正常合成、运输、释放和作用，使其无法维持自身的平衡和调 -K- T。
[0003] 然而，就目前来看，传统的方法（色谱法等）虽然检测限很好，但是却具有分析时 间长，操作复杂，需要大型精密仪器等缺点；免疫学方法虽然成本低廉但是容易出现假阳性 的结果；而电化学方法则需要对电极进行修饰，识别能力不够，因此，开发一种快速、灵敏、 便捷、实时检测17 β -雌二醇的方法变的尤为重要。
[0004] 功能核酸是一种新型识别分子，其本质是一段20-100bp长的单链DNA，是通过指 数富集配体的系统进化技术（SELEX)筛选而来的，可以特异性结合目标分子。功能核酸容 易人工合成，易修饰，而且具有较高的选择性和稳定性，因此被广泛应用在检测领域。本发 明所采用的17 β -雌二醇适配体，是由Kim等人在2007年首次筛选出并且应用电化学方法 实现了对17 β-雌二醇的检测。
【发明内容】
[0005] 针对现有技术中的上述技术问题，本发明提供了一种基于功能核酸利用共振散射 光谱检测17 β -雌二醇的方法，所述的这种方法解决了现有技术中检测17 β -雌二醇的方 法容易出现假阳性、成本高、检测时间长的技术问题。
[0006] 本发明提供了一种基于功能核酸利用共振散射光谱检测17 β -雌二醇方法，包括 以下步骤：
[0007] (1) -个制备适配体-纳米金探针序列的步骤，所述的适配体为一段功能核苷酸 序列，所述的功能核苷酸的序列为：5' -GCT-TCC-AGC-TTA-TTG-AAT-TAC-ACG-CA G-AGG-GT A-GCG-GCT-CTG-CGC-ATT-CAA-TTG-CTG-CGC-GCT-GAA-GCG-CGG-AAG-C-3'，将纳米金和所述 的适配体结合，形成稳定的适配体-纳米金探针；
[0008] (2)在探针溶液中加入待检测的怀疑含有17 β -雌二醇的水溶液，孵育，加入氯化 钠溶液，通过测定共振散射信号强度来判断待测溶液中17 β -雌二醇的含量。
[0009] 进一步的，上述步骤（1)中，将功能核苷酸配制成1 μ mol/L的母液，步骤（2)中氯 化钠溶液配制成浓度为2mol/L的母液。
[0010] 进一步的，所述的纳米金纳米金通过以下方法制备：在每100毫升煮沸的质量百 分比浓度为0. 01 %的氯金酸溶液中，加入3. 5毫升质量百分比浓度为1 %的柠檬酸三钠溶 液，搅拌30分钟，移除加热装置后继续搅拌混合物10分钟，最后，使溶液达到室温并且使用 0. 2 μ m超滤膜过滤，然后储存在恒温为4度的黑色玻璃瓶中备用。
[0011] 进一步的，上述步骤（1)中，检测体系中功能核酸的终浓度为20nM，使用量为 1 μ mol/L的母液取10 μ L，纳米金的使用量为100 μ L，步骤⑵中，检测体系中氯化钠的浓 度为120禮，使用量为2111〇1/1母液取3(^1^
[0012] 具体的，上述的基于功能核酸利用共振散射光谱检测17 β-雌二醇方法，包括以 下步骤：
[0013] (1) 一个建立已知17β-雌二醇浓度的检测体系的步骤，取至少六支分别加入 10 μ L，1 μ mol/L 17 β -雌二醇适配体的离心管，加入100 μ L纳米金溶液，充分混匀后将离 心管置于25°C条件下孵育15min，然后分别加入10 μ L不同浓度的17 β -雌二醇溶液，使得 整个检测体系中17 β -雌二醇的含量维持在0. 1-3. 0 μ mol/L，然后充分混匀后再将离心管 置于25°C条件下孵育15min，在上述混合液中加入30 μ L、2mol/L的氯化钠溶液充分混匀并 且采用缓冲液定容至500 μ L，留作以下测定用；
[0014] (2)另取1支离心管将17 β-雌二醇溶液用10 μ L超纯水替代，按照上述步骤（1) 的方法处理后作为空白对照体系溶液；
[0015] (3)分别取500 yL步骤（1)和步骤⑵制备的标准溶液和空白对照液，置于石英 荧光比色皿中，所述的石英荧光比色皿的内径为〇· 5cmX0. 5cm，外径为1.0 cmX I. 0cm，用 荧光光度计进行扫描测定信号，扫描条件为：激发光狭缝为2. 5nm，发射光狭缝为2. 5nm，激 发光波长为550nm条件下扫描，获得其共振散射信号光谱，17 β -雌二醇和空白对照液的共 振散射光谱信号分别为I55tol和（I55tlnm) b,计算相对共振散射强度值ΔΙ = I55toi-(I55toi)b;
[0016] (4)以不同浓度17 β -雌二醇（Ce2)与对应的相对共振散射强度值Λ I作图，绘制 标准曲线；
[0017] (5)制备样品检测体系：取IOyL待测样品，加入到步骤⑴方法制备的检测体系 离心管中，充分混匀后再将离心管置于25°C条件下孵育15min后，在混合液中加入30 μ L、 2mol/L的氯化钠溶液充分混匀并且缓冲液定容至500 μ L，按步骤（3)方法测定共振散射信 号并计算Δ I。
[0018] (6)根据计算所得的ΛΙ值，查标准曲线，可以求得样品中17β-雌二醇含量。
[0019] 进一步的，所述的缓冲液为丙磺酸缓冲液，浓度为10mm〇l/L，PH值为7. 0。
[0020] 本发明的原理是：通过使用纳米金与17 β -雌二醇的适配体与功能核酸相结 合形成适配体-纳米金探针，当检测体系中没有17 β -雌二醇时，适配体-纳米金探针相 对稳定，当加入高浓度盐溶液氯化钠时，溶液不会发生变化，共振散射信号不变；当检测体 系中存在17 β -雌二醇时，适配体-纳米金探针上的17 β -雌二醇适配体会与17 β -雌二 醇发生特异性结合，从而释放出纳米金颗粒，当加入高浓度盐溶液氯化钠时，纳米金颗粒发 生聚集，共振散射信号大大增加，并且随着17 β -雌二醇浓度的增加，共振散射信号不断增 加。通过比较共振散射值的变化，即可实现对17 β -雌二醇的检测。
[0021] 本发明建立了一种基于17 β -雌二醇适配体利用共振散射光谱实现对17 β -雌二 醇的检测方法。纳米金具有较好的稳定性、生物相容性和共振瑞利散射效应，能与功能核 酸组合成探针在共振瑞利散射光谱分析方面具有很好的应用；而共振瑞利散射光谱法是一 种简便、快速、灵敏的光谱分析新技术，在核酸、蛋白质、小分子分析等领域获得了较好的应 用。本发明在基于功能核酸的基础上，利用共振散射光谱对食品（包括牛奶）中17β-雌 二醇进行快速、灵敏、便捷、实时检测。
[0022] 本发明和已有技术相比，其技术进步是显著的。本发明提供的检测方法不需要大 型仪器设备，成本低，检测灵敏度高，选择性好，操作简单且高效，可用于检测食品包括牛奶 中17 β _雌二醇的含量，检测的浓度范围是0· 1-3. 0 μ mol/L，最低检测限为9. OnMo
【附图说明】
[0023] 图1是本发明检测17 β-雌二醇的原理图。
[0024] 图2显示了优化方法中不同氯化钠浓度的相对共振散射值。
[0025] 图3显示了优化方法中不同17 β -雌二醇适配体浓度的相对共振散射值。
[0026] 图4显示了检测体系的共振散射信号变化与不同浓度17 β -雌二醇的关系。
[0027] 图5显示了是不同其他物质加入该检测体系后的共振散射信号变化量。
【具体实施方式】
[0028] 实施例1优化体系中氯化钠浓度
[0029] 在1.5mL离心管中加入IOOyL纳米金溶液，再加入丙磺酸缓冲液（浓度为 10mm 〇l/L、PH为7. 0)，混匀，依次加入浓度范围为0-160mmol/L的氯化钠溶液，五分钟之后 测定共振散射值，得到相对共振散射值，绘制曲线，峰值最高对应的氯化钠浓度为120mmol/ L，如图2所示。
[0030] 实施例2优化体系中17 β -雌二醇适配体浓度
[0031] 17 β-雌二醇适配体购于上海生工，将收到的样品配制成lymol/L的母液，然后 分别加入浓度范围为0-40nmol/L的适配体于100 μ L纳米金溶液中配制成适配体-纳米金 探针，孵育15min后加入一定浓度的雌二醇溶液，孵育15min，加入优化好的氯化钠溶液，丙 磺酸缓冲液定容至500 μ L，五分钟后测定共振散射值，绘制曲线，峰值最高处对应的适配体 浓度为20nmol