/L,如图3所示。
[0032] 实施例3采用本发明的方法检测牛奶样品中是否含有17 β-雌二醇的过程具体 包括以下步骤:
[0033] (1)制备已知17 β-雌二醇浓度的检测体系:取11支分别加入10 μ L,lymol/ L17 β -雌二醇适配体的离心管,加入100 μ L纳米金溶液,充分混匀后将离心管置于25°C条 件下孵育15min,然后分别加入10 μ L不同浓度的17 β -雌二醇溶液,使得整个检测体系中 17 β-雌二醇的含量维持在0. 1-3.0 μ mol/L,然后充分混匀后再将离心管置于25°C条件 下孵育15min,在上述混合液中加入30 μ L、2mol/L的氯化钠溶液充分混匀并且缓冲液定容 至500 μ L,留作以下测定用;
[0034] (2)另取1支离心管将17 β -雌二醇溶液用10 μ L超纯水替代,按照上述步骤(1) 的方法处理后作为空白对照体系溶液;
[0035] (3)分别取500 μ L步骤(1)和步骤⑵制备的标准溶液和空白对照液,置于石英 荧光用比色皿(内径为〇.5cmX0.5cm,外径为1.0 cmX 1.0 cm)中,用荧光光度计进行扫描 测定信号。具体的扫描条件为:激发光狭缝为2. 5nm,发射光狭缝为2. 5nm,激发光波长为 550nm条件下扫描,获得其共振散射信号光谱。17 β -雌二醇和空白对照液的共振散射光谱 信号分别为I55tlnm和(I55_) b,计算相对共振散射强度值Δ I 工55〇11111 ^550nm^ b °
[0036] (4)以不同浓度17 β -雌二醇(Ce2)与对应的相对共振散射强度值Λ I作图,绘制 标准曲线,其回归方程为:Δ I = 1893CE2+0. 61。(如图4所示)
[0037] (5)制备样品检测体系:将某品牌纯牛奶加入三氯乙酸,去除牛奶中的蛋白质,离 心后取上清液10 μ L,加入到【具体实施方式】步骤(1)方法孵育好的纳米金-适配体探针检测 体系的离心管中,充分混匀后再将离心管置于25°C条件下孵育15min后,在混合液中加入 30 μ L、2mol/L的氯化钠溶液充分混匀并且缓冲液定容至500 μ L,加入按步骤(3)方法测定 共振散射信号并计算ΔΙ。
[0038] (6)根据计算所得的ΛΙ值,查标准曲线ΛΙ = 1779CE2_5.54,可以求得牛奶样品 中17 β -雌二醇含量。
[0039] (7)验证:用本发明方法测定3份含17β -雌二醇浓度分别为100ηΜ、300ηΜ、和 500ηΜ的处理后牛奶各一份,得到的平均回收率分别为108. 3%,93. 9%,107. 6%,RSD值分 别为5. 8%,6. 1%,4. 6%,从而证明了本方法的可靠性。
[0040] 采用本发明的方法测定牛奶中17 β -雌二醇的浓度范围为0. 1-3. 0 μ Μ,最低检测 限为9. ΟηΜ。
[0041] 实施例4 17 β-雌二醇的特异性实验
[0042] (1)取8支分别加入10 μ L,1 μ mol/L 17 β -雌二醇适配体的离心管,加入100 μ L 纳米金溶液,充分混匀后将离心管置于25 °C条件下孵育15min,然后分别加入10 yL, 10 μ mol/L的17 β -雌二醇、滴滴涕、乙烯雌酚、双酚A、铜离子、镉离子、四环素、氨基头孢 烷酸溶液,然后充分混匀后再将离心管置于25°C条件下孵育15min,在上述混合液中加入 30 μ L、2mol/L的氯化钠溶液充分混匀并且缓冲液定容至500 μ L,留作以下测定用;
[0043] (2)另取1支离心管加入10 μ L超纯水,按照上述步骤(1)的方法处理后作为空白 对照体系溶液;
[0044] (3)按照实施例3中(3)的步骤进行测定共振散射值,绘制柱状图,通过柱状图可 以看出17 β-雌二醇具有较高的特异性(如图5所示)。
[0045]
【主权项】
1. 一种基于功能核酸利用共振散射光谱检测17 0 -雌二醇方法,其特征在于包括以下 步骤: (1) 一个制备适配体-纳米金探针序列的步骤,所述的适配体为一段功能核苷酸序列, 所述的功能核苷酸的序列为:5' -GCT-TCC-AGC-TTA-TTG-AAT-TAC-ACG-CAG-AGG-GTA-GCG-GCT-CTG-CGC-AIT-CAA-ITG-CTG-CGC-GCT-GAA-GCG-CGG-AAG-C-3',将纳米金和所述的适配 体结合,形成稳定的适配体-纳米金探针; (2) 在探针溶液中加入待检测的怀疑含有170-雌二醇的水溶液,孵育,加入氯化钠溶 液,通过测定共振散射信号强度来判断待测溶液中17 0 -雌二醇的含量。
2. 根据权利要求1所述的基于功能核酸利用共振散射光谱检测17 0 -雌二醇方法,其 特征在于:上述步骤⑴中,将功能核苷酸配制成1 y mol/L的母液,步骤⑵中氯化钠溶液 配制成浓度为2mol/L的母液。
3. 根据权利要求1所述的基于功能核酸利用共振散射光谱检测17 0 -雌二醇方法,其 特征在于所述的纳米金通过以下方法制备:在100毫升煮沸的质量百分比浓度为0. 01 %的 氯金酸溶液中,加入3. 5毫升质量百分比浓度为1 %的柠檬酸三钠溶液,搅拌30分钟,移除 加热装置后继续搅拌混合物10分钟,最后,使溶液达到室温并且使用〇. 2 ym超滤膜过滤, 然后储存在恒温为4°C的黑色玻璃瓶中备用。
4. 根据权利要求1所述的基于功能核酸利用共振散射光谱检测17 0 -雌二醇方法, 其特征在于,上述步骤(1)中,检测体系中功能核苷酸的终浓度为20nmol/L,使用量为 1 ymol/L的母液取10 yL,纳米金的使用量为100 yL,步骤⑵中,检测体系中氯化钠的浓 度为120mM,使用量为2mol/L母液取30yL〇
5. 根据权利要求1所述的基于功能核酸利用共振散射光谱检测17 0 -雌二醇方法,其 特征在于包括以下步骤: (1) 一个建立已知17 0 -雌二醇浓度的检测体系的步骤,取至少六支分别加入10 y L, 1 y mol/L 17 0 -雌二醇适配体的离心管,加入100 y L纳米金溶液,充分混匀后将离心管置 于25°C条件下孵育15min,然后分别加入10yL不同浓度的17 0-雌二醇溶液,使得整个 检测体系中17 0 -雌二醇的含量维持在0. 1-3. 0 ymol/L,然后充分混匀后再将离心管置于 25°C条件下孵育15min,在上述混合液中加入30 y L、2mol/L的氯化钠溶液充分混匀并且采 用缓冲液定容至500 yL,留作以下测定用; (2) 另取1支离心管将17 0 -雌二醇溶液用10 y L超纯水替代,按照上述步骤(1)的方 法处理后作为空白对照体系溶液; (3) 分别取500 yL步骤⑴和步骤⑵制备的标准溶液和空白对照液,置于石英荧光 比色皿中,所述的石英荧光比色皿的内径为0? 5cmX0. 5cm,外径为1. OcmX 1. 〇cm,用荧光 光度计进行扫描测定信号,扫描条件为:激发光狭缝为2. 5nm,发射光狭缝为2. 5nm,激发光 波长为550nm条件下扫描,获得其共振散射信号光谱,17 0 -雌二醇和空白对照液的共振散 射光谱信号分别为I55tol和(I55(lnm) b,计算相对共振散射强度值AI = I55(lnm-(I55CJb; (4) 以不同浓度17 0-雌二醇(CE2)与对应的相对共振散射强度值AI作图,绘制标准 曲线; (5) 制备样品检测体系:取10yL待测样品,加入到步骤⑴方法制备的检测体系离心 管中,充分混匀后再将离心管置于25°C条件下孵育15min后,在混合液中加入30 y L、2mol/ L的氯化钠溶液充分混匀并且缓冲液定容至500 yL,按步骤(3)方法测定共振散射信号并 计算A I。 (6)根据计算所得的AI值,查标准曲线,可以求得样品中170-雌二醇含量。
6.根据权利要求5所述的基于功能核酸利用共振散射光谱检测17 0 -雌二醇方法,其 特征在于:所述的缓冲液为丙磺酸缓冲液,浓度为10mm〇l/L,PH值为7. 0。
【专利摘要】一种基于功能核酸利用共振散射光谱检测17β-雌二醇方法,包括一个制备适配体-纳米金探针序列的步骤,适配体为一段功能核苷酸序列,核酸序列为:5'-GCT-TCC-AGC-TTA-TTG-AAT-TAC-ACG-CAG-AGG-GTA-GCG-GCT-CTG-CGC-ATT-CAA-TTG-CTG-CGC-GCT-GAA-GCG-CGG-AAG-C-3',将纳米金和适配体结合,形成稳定的适配体-纳米金探针;在探针溶液中加入待检测的怀疑含有17β-雌二醇的水溶液,孵育,加入氯化钠溶液,通过测定共振散射信号强度来判断待测溶液中17β-雌二醇的含量。通过比较共振散射值的变化,实现对17β-雌二醇的检测。
【IPC分类】G01N21-64
【公开号】CN104677869
【申请号】CN201510060857
【发明人】夏兵, 王鲁梅, 叶璟, 张东伟, 杜玉萍, 邱志浩
【申请人】上海应用技术学院
【公开日】2015年6月3日
【申请日】2015年2月5日