/L，如图3所示。
[0032] 实施例3采用本发明的方法检测牛奶样品中是否含有17 β-雌二醇的过程具体 包括以下步骤：
[0033] (1)制备已知17 β-雌二醇浓度的检测体系：取11支分别加入10 μ L，lymol/ L17 β -雌二醇适配体的离心管，加入100 μ L纳米金溶液，充分混匀后将离心管置于25°C条 件下孵育15min，然后分别加入10 μ L不同浓度的17 β -雌二醇溶液，使得整个检测体系中 17 β-雌二醇的含量维持在0. 1-3.0 μ mol/L，然后充分混匀后再将离心管置于25°C条件 下孵育15min，在上述混合液中加入30 μ L、2mol/L的氯化钠溶液充分混匀并且缓冲液定容 至500 μ L，留作以下测定用；
[0034] (2)另取1支离心管将17 β -雌二醇溶液用10 μ L超纯水替代，按照上述步骤（1) 的方法处理后作为空白对照体系溶液；
[0035] (3)分别取500 μ L步骤（1)和步骤⑵制备的标准溶液和空白对照液，置于石英 荧光用比色皿（内径为〇.5cmX0.5cm，外径为1.0 cmX 1.0 cm)中，用荧光光度计进行扫描 测定信号。具体的扫描条件为：激发光狭缝为2. 5nm，发射光狭缝为2. 5nm，激发光波长为 550nm条件下扫描，获得其共振散射信号光谱。17 β -雌二醇和空白对照液的共振散射光谱 信号分别为I55tlnm和（I55_) b，计算相对共振散射强度值Δ I 工55〇11111 ^550nm^ b °
[0036] (4)以不同浓度17 β -雌二醇（Ce2)与对应的相对共振散射强度值Λ I作图，绘制 标准曲线，其回归方程为：Δ I = 1893CE2+0. 61。（如图4所示）
[0037] (5)制备样品检测体系：将某品牌纯牛奶加入三氯乙酸，去除牛奶中的蛋白质，离 心后取上清液10 μ L，加入到【具体实施方式】步骤（1)方法孵育好的纳米金-适配体探针检测 体系的离心管中，充分混匀后再将离心管置于25°C条件下孵育15min后，在混合液中加入 30 μ L、2mol/L的氯化钠溶液充分混匀并且缓冲液定容至500 μ L，加入按步骤（3)方法测定 共振散射信号并计算ΔΙ。
[0038] (6)根据计算所得的ΛΙ值，查标准曲线ΛΙ = 1779CE2_5.54,可以求得牛奶样品 中17 β -雌二醇含量。
[0039] (7)验证：用本发明方法测定3份含17β -雌二醇浓度分别为100ηΜ、300ηΜ、和 500ηΜ的处理后牛奶各一份，得到的平均回收率分别为108. 3%，93. 9%，107. 6%，RSD值分 别为5. 8%，6. 1%，4. 6%，从而证明了本方法的可靠性。
[0040] 采用本发明的方法测定牛奶中17 β -雌二醇的浓度范围为0. 1-3. 0 μ Μ，最低检测 限为9. ΟηΜ。
[0041] 实施例4 17 β-雌二醇的特异性实验
[0042] (1)取8支分别加入10 μ L，1 μ mol/L 17 β -雌二醇适配体的离心管，加入100 μ L 纳米金溶液，充分混匀后将离心管置于25 °C条件下孵育15min，然后分别加入10 yL， 10 μ mol/L的17 β -雌二醇、滴滴涕、乙烯雌酚、双酚A、铜离子、镉离子、四环素、氨基头孢 烷酸溶液，然后充分混匀后再将离心管置于25°C条件下孵育15min，在上述混合液中加入 30 μ L、2mol/L的氯化钠溶液充分混匀并且缓冲液定容至500 μ L，留作以下测定用；
[0043] (2)另取1支离心管加入10 μ L超纯水，按照上述步骤（1)的方法处理后作为空白 对照体系溶液；
[0044] (3)按照实施例3中（3)的步骤进行测定共振散射值，绘制柱状图，通过柱状图可 以看出17 β-雌二醇具有较高的特异性（如图5所示）。
[0045]
【主权项】
1. 一种基于功能核酸利用共振散射光谱检测17 0 -雌二醇方法，其特征在于包括以下 步骤： (1) 一个制备适配体-纳米金探针序列的步骤，所述的适配体为一段功能核苷酸序列， 所述的功能核苷酸的序列为：5' -GCT-TCC-AGC-TTA-TTG-AAT-TAC-ACG-CAG-AGG-GTA-GCG-GCT-CTG-CGC-AIT-CAA-ITG-CTG-CGC-GCT-GAA-GCG-CGG-AAG-C-3'，将纳米金和所述的适配 体结合，形成稳定的适配体-纳米金探针； (2) 在探针溶液中加入待检测的怀疑含有170-雌二醇的水溶液，孵育，加入氯化钠溶 液，通过测定共振散射信号强度来判断待测溶液中17 0 -雌二醇的含量。
2. 根据权利要求1所述的基于功能核酸利用共振散射光谱检测17 0 -雌二醇方法，其 特征在于：上述步骤⑴中，将功能核苷酸配制成1 y mol/L的母液，步骤⑵中氯化钠溶液 配制成浓度为2mol/L的母液。
3. 根据权利要求1所述的基于功能核酸利用共振散射光谱检测17 0 -雌二醇方法，其 特征在于所述的纳米金通过以下方法制备：在100毫升煮沸的质量百分比浓度为0. 01 %的 氯金酸溶液中，加入3. 5毫升质量百分比浓度为1 %的柠檬酸三钠溶液，搅拌30分钟，移除 加热装置后继续搅拌混合物10分钟，最后，使溶液达到室温并且使用〇. 2 ym超滤膜过滤， 然后储存在恒温为4°C的黑色玻璃瓶中备用。
4. 根据权利要求1所述的基于功能核酸利用共振散射光谱检测17 0 -雌二醇方法， 其特征在于，上述步骤（1)中，检测体系中功能核苷酸的终浓度为20nmol/L，使用量为 1 ymol/L的母液取10 yL，纳米金的使用量为100 yL，步骤⑵中，检测体系中氯化钠的浓 度为120mM，使用量为2mol/L母液取30yL〇
5. 根据权利要求1所述的基于功能核酸利用共振散射光谱检测17 0 -雌二醇方法，其 特征在于包括以下步骤： (1) 一个建立已知17 0 -雌二醇浓度的检测体系的步骤，取至少六支分别加入10 y L， 1 y mol/L 17 0 -雌二醇适配体的离心管，加入100 y L纳米金溶液，充分混匀后将离心管置 于25°C条件下孵育15min，然后分别加入10yL不同浓度的17 0-雌二醇溶液，使得整个 检测体系中17 0 -雌二醇的含量维持在0. 1-3. 0 ymol/L，然后充分混匀后再将离心管置于 25°C条件下孵育15min，在上述混合液中加入30 y L、2mol/L的氯化钠溶液充分混匀并且采 用缓冲液定容至500 yL，留作以下测定用； (2) 另取1支离心管将17 0 -雌二醇溶液用10 y L超纯水替代，按照上述步骤（1)的方 法处理后作为空白对照体系溶液； (3) 分别取500 yL步骤⑴和步骤⑵制备的标准溶液和空白对照液，置于石英荧光 比色皿中，所述的石英荧光比色皿的内径为0? 5cmX0. 5cm，外径为1. OcmX 1. 〇cm，用荧光 光度计进行扫描测定信号，扫描条件为：激发光狭缝为2. 5nm，发射光狭缝为2. 5nm，激发光 波长为550nm条件下扫描，获得其共振散射信号光谱，17 0 -雌二醇和空白对照液的共振散 射光谱信号分别为I55tol和（I55(lnm) b，计算相对共振散射强度值AI = I55(lnm-(I55CJb; (4) 以不同浓度17 0-雌二醇（CE2)与对应的相对共振散射强度值AI作图，绘制标准 曲线； (5) 制备样品检测体系：取10yL待测样品，加入到步骤⑴方法制备的检测体系离心 管中，充分混匀后再将离心管置于25°C条件下孵育15min后，在混合液中加入30 y L、2mol/ L的氯化钠溶液充分混匀并且缓冲液定容至500 yL，按步骤（3)方法测定共振散射信号并 计算A I。 (6)根据计算所得的AI值，查标准曲线，可以求得样品中170-雌二醇含量。
6.根据权利要求5所述的基于功能核酸利用共振散射光谱检测17 0 -雌二醇方法，其 特征在于：所述的缓冲液为丙磺酸缓冲液，浓度为10mm〇l/L，PH值为7. 0。
【专利摘要】一种基于功能核酸利用共振散射光谱检测17β-雌二醇方法，包括一个制备适配体-纳米金探针序列的步骤，适配体为一段功能核苷酸序列，核酸序列为：5'-GCT-TCC-AGC-TTA-TTG-AAT-TAC-ACG-CAG-AGG-GTA-GCG-GCT-CTG-CGC-ATT-CAA-TTG-CTG-CGC-GCT-GAA-GCG-CGG-AAG-C-3'，将纳米金和适配体结合，形成稳定的适配体-纳米金探针；在探针溶液中加入待检测的怀疑含有17β-雌二醇的水溶液，孵育，加入氯化钠溶液，通过测定共振散射信号强度来判断待测溶液中17β-雌二醇的含量。通过比较共振散射值的变化，实现对17β-雌二醇的检测。
【IPC分类】G01N21-64
【公开号】CN104677869
【申请号】CN201510060857
【发明人】夏兵, 王鲁梅, 叶璟, 张东伟, 杜玉萍, 邱志浩
【申请人】上海应用技术学院
【公开日】2015年6月3日
【申请日】2015年2月5日