一种基于局域表面等离体共振的有机磷检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物化学检测领域，特别涉及一种基于局域表面等离体共振的有机磷 检测方法。
[0002]
【背景技术】
[0003] 有机磷化合物一般指化学分子式中含有碳一磷键的有机气体或含有机官能团的 磷酸酯类化合物，一般包括各种有机磷农药和生化战场上常用的神经毒气。有机磷化合物 对生物体内的乙酰胆碱酯酶（Acetyl-cholinesterase, AChE)具有强烈的抑制作用，能引起 乙酰胆碱(Acetylcholine, ACh)蓄积，导致中枢神经系统功能紊乱，使生物体丧失机能直至 死亡，是一种高效的生物毒剂。随着有机磷化合物在当今社会中的广泛应用，其对环境、生 物圈乃至人类生命的负面影响也同时受到了世界各国科研工作者的密切关注。因此，有机 磷化合物的识别与检测技术已成为各国研究的重点，对环境监测及国防安全具有重要的意 义。
[0004] 目前有机磷化合物的检测与识别主要是通过室内大型分析检测仪器进行的，如色 谱分析仪，红外光谱仪、色一质联用分析仪等。此类检测设备体积大、分析过程复杂、便携性 差，不适于对有机磷化合物的户外便携式在线检测。
[0005] 近年来，随着等离子体光学研究的深入，基于金属纳米结构的局域表面等离子体 共振（LSPR)有机磷传感方法因其易于实现便携式、快速响应、多功能集成等优点得到了应 用。如图1所示，当金属纳米结构101的尺寸远小于入射光的波长时，入射光的电场分量使 得金属纳米结构101上的电荷发生极化，极化产生的正负离子随着入射电场的变化而发生 集体振动,形成电子云102,从而产生极化电场103。当这种振荡频率与入射光频率相一致 时，便发生LSPR，使得激发频率的入射光被吸收，获得LSPR谱。LSPR图谱与它附近所处的 环境折射率有关，因此在生物分子检测、有机气体检测等方面具有重要的应用。
[0006] 目前所采用的LSPR传感技术如图2所示，首先，在洁净的玻璃基底201上制作金 属纳米结构202 ;其次，在金属纳米结构202表面结合一层与待测对象对应的敏感材料203， 如化学敏感材料、生物酶、生物抗体等；接着，敏感材料203将吸附环境中游离的待测分子 204,改变金属纳米结构202周围的折射率；最后利用图3所示的装置对LSPR图谱进行检 测。光源301发出的可见或红外光，经过光纤302和聚焦透镜303照射到传感芯片304上， 透射光经聚焦透镜303和光纤302进入红外-可见光谱仪305,由光谱仪305探测得到的光 谱信息由数据线306进入计算机307,获得LSPR图谱308。分别检测吸附待测分子204前 后的LSPR图谱，可获得待测对象的存在和浓度信息。
[0007] 可见，目前所采用的LSPR传感技术需要在结合敏感材料之前单独制作高效可控 的金属纳米结构。虽然目前常用的金属纳米结构制作方法如化学合成法、自组装法以及电 子束/离子束直写法等已得到广泛研究，但制作金属纳米结构的步骤仍然非常复杂，且价 格昂贵，不符合目前集成化低成本传感器的发展方向。
[0008]
【发明内容】
[0009] 为了解决以上技术问题，本发明提供一种基于局域表面等离子体共振的有机磷检 测方法，无需在基片结合敏感材料之前在其上制作一层金属纳米结构，直接利用检测过程 中的化学反应生成金属纳米颗粒，并利用有机磷的存在和浓度调控所生成的金属纳米颗粒 的量，简化了检测过程，重复性稳定，准确率高，便携带使用，降低成本。
[0010] 解决以上问题的本发明中的一种基于局域表面等离子体共振的有机磷检测方法， 其特征在于：包括以下步骤： (1) 制备酶传感芯片：清洁玻璃基底，将乙酰胆碱酯酶(AChE)固定在玻璃基底上成酶 传感芯片； (2) 将有机磷样品滴涂到酶传感芯片上，形成AChE活性被部分抑制的有机磷抑制酶 膜； (3) 将步骤（2)中处理后的传感芯片室温下浸入到硫代乙酰胆碱（ATCh)和氯金酸 (HAuCl4)混合液中反应，反应时间为0.5 ~2.5h，在传感芯片上获得一定量的金纳米颗粒。
[0011] (4)以可见光或红外光照射步骤（3)中处理后的传感芯片，再用光谱测试仪探测透 射光，得到测量LSPR图谱； (5)将LSPR图谱与基准LSPR图谱进行比较，根据吸收峰是否有偏移，确定所述有机磷 样品中是否含有有机磷，并根据吸收峰的位移量，确定有机磷的浓度，当吸收峰向右有偏移 确定样品中含有有机磷，偏移量越大，有机磷浓度越高。
[0012] 所述步骤（1)中的玻璃基底为K9玻璃。
[0013] 所述步骤（2)硫代乙酰胆碱和氯金酸混合液中含有摩尔浓度的硫代乙酰胆碱 0. 5~20mM，，质量百分比的氯金酸0. 01~0. 5%，其余为磷酸盐缓冲液（PBS)。
[0014] 优化摩尔浓度硫代乙酰胆碱为1~10禮，质量百分比氯金酸为0. 05~0. 2%。
[0015] 所述步骤（1)中的固定方法为吸附法、包埋法、共价键结合法或交联法。
[0016] 所述吸附法包括以下步骤： 将乙酰胆碱酯酶（AChE)的PBS溶液滴到玻璃基底上，4°C下静置Ih ;再用磷酸盐缓冲液 冲洗2~4次，室温晾干或吹干。
[0017] PBS溶液指的是磷酸盐缓冲液，是生物化学实验中最常用的一种缓冲液，一般浓度 为（λ 01~(λ 1M，PH 值为 7~8。
[0018] 滴加速度快慢或滴加用量多少根据玻璃基底面积来定，如玻璃基底面积大些，可 以多滴一些，也可以速度上快些。
[0019] 冲洗可为把传感芯片浸入到PBS溶液中，再拿出来后再浸入PBS溶液中，反复操作 作即可，目的把没固定上的酶冲洗掉。室温晾干或吹干是干燥传感芯片，使其上没有水分了 为止。
[0020] 所述交联法为戊二醛交联法或SUlfo-LC-SPDP交联法。（SUlfo-LC-SPDP是产品名 称，没有中文译文，sulfo-LC-SPDP是由美国pierce公司生产。） 所述戊二醛交联法包括以下步骤： 将乙酰胆碱酯酶、质量百分比的戊二醛0. 1~1〇%和牛血清蛋白0. 1~1〇%的混合溶液滴 到玻璃基底上，4°C下静置8~12h ;再用质量百分比的甘氨酸1%的磷酸盐缓冲液冲洗2~4 次，室温晾干或吹干。
[0021] 优化方案中质量百分比的戊二醛为1~1〇%和牛血清蛋白为1~1〇%。
[0022] 滴加到芯片表面后经过一些时间，一部分的酶被固定到芯片上，再用甘氨酸溶液 将多余的物质，如未固定的酶，没有参加反应的戊二醛和牛血清蛋白等洗掉