基于润滑素蛋白修饰的表面等离子共振仪芯片的制备方法与流程

本发明涉及表面等离子共振谱仪抗污染芯片制备领域，特别是涉及一种基于润滑素蛋白修饰的表面等离子共振仪芯片及其制备方法。

背景技术：

表面等离子共振(Surface Plasmon Resonance，简称SPR)仪是20世纪80年代出现的一种生物传感器技术，当入射光从高折射率介质入射到低折射率介质时，会发生全反射，此时若在介质交界面处镀一层金属薄膜(金或银)，入射光产生的渐逝波会引起金属表面自由电子发生集体振荡，进而形成等离子体，当渐逝波与表面等离子体振荡的频率和波数相等时，即产生共振现象(SPR)，导致能量从渐逝波转移到表面等离子波中，使反射光的强度大大减弱，呈现衰减全反射现象，当反射光的强度为零时的入射角称为共振角。共振角与金属薄膜界面介质折射率有关，而折射率又随结合在金属薄膜表面的分子质量而变化，故可通过分析共振角来获得分子间相互作用的信息，由于其具有检测快速且无需标记等特点，已被广泛应用于蛋白质组学、药物研发、临床诊断、食品安全和环境监测等领域，并且显示出广阔的应用前景。

SPR芯片是表面等离子共振仪最为核心的组件，提供产生SPR信号的必须物理条件，主要包括耦合器件、金属膜和表面基质。然而，应用表面等离子共振仪进行分析测试时，传感芯片的表面污染是一个普遍存在的问题，来自样品中的生物分子或微生物的非特异性吸附将降低定量检测的准确性，产生假阳性结果。因此，开发有效抵抗非特异性吸附的表面是提高表面等离子共振传感器灵敏度和精确度的首要问题。

技术实现要素：

针对现有技术中存在的不足，本发明提供一种基于润滑素蛋白修饰的表面等离子共振仪芯片的制备方法。

本发明是通过以下技术方案加以实现的：

一种基于润滑素蛋白修饰的表面等离子共振仪芯片的制备方法，包括以下步骤：

a)裸金芯片制备

采用电子束蒸发镀膜技术在基底上涂覆一层2-3nm厚的铬层，在该铬层上涂覆一层45-50nm厚的金膜，得到裸金芯片；

b)裸金芯片预处理

将步骤a)获得的裸金芯片浸入水、30wt.％浓氨水与30wt.％双氧水的混合溶液中，上述混合溶液中水、30wt.％浓氨水与30wt.％双氧水的体积比为3:1:1，于70-90℃下浸泡10-60min，取出用去离子水清洗3次后用氮气吹干；

c)润滑素蛋白修饰

将b)步骤得到的芯片清洗后用柏油贴合到表面等离子共振仪系统的棱镜上，以pH为7-8的磷酸缓冲液为流动相，流速为50-100μL/min持续流过芯片表面，待基线稳定时，注入100μL100-300μg/mL的润滑素蛋白，并以20-50μL/min的速度流过流通池，出现表面等离子共振响应信号时，停止流速，孵育10-20min，再以50-100μL/min的流速走缓冲液10-30min，清洗掉未结合牢固的润滑素蛋白。

而且，上述的基底为玻璃片基底或光纤基底，玻璃片基底优选BK7玻璃基底。

而且，上述的金膜还可为银膜或硅烷膜或银/金复合膜。

本发明的优点及有益效果是：

(1)本发明制备的基于润滑素蛋白修饰的表面等离子共振仪芯片具有很好的抗污染性能，且抗污染效果不受溶液pH值的影响；

(2)本发明制备的基于润滑素蛋白修饰的表面等离子共振仪芯片具有良好的润滑性和生物兼容性；

(3)本发明制备的基于润滑素蛋白修饰的表面等离子共振仪芯片具有高稳定性，干燥状态下储存2个月或室温条件下储存3个月后，抗污染性能无变化；

(4)本发明基于润滑素蛋白修饰的表面等离子共振仪芯片的制备方法简便快速，减少了以往多步繁琐的制备过程，极大地提高了芯片表面修饰的效率；

(5)本发明制备的基于润滑素蛋白作为SPR芯片表面的抗污染材料具有生物可降解性。

附图说明

图1为本发明基于润滑素蛋白修饰的表面等离子共振仪芯片的结构示意图；

图2为本发明基于润滑素蛋白修饰的表面等离子共振仪芯片对0.5mg/mL的羊免疫球蛋白(IgG)、2mg/mL牛血清蛋白(BSA)以及2mg/mL溶菌酶(lysozyme)溶液中蛋白的非特异性吸附量；

其中，1、玻璃片基底；2、铬层；3、金膜层；4、润滑素蛋白自组装单分子层。

具体实施方式

本发明通过以下实施例进一步详述。需要说明的是：下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。

实施例1

采用电子束蒸发镀膜技术在BK7玻璃基底上涂覆一层2nm厚的铬层，在该铬层上涂覆一层48nm厚的金膜，得到裸金芯片；将上述裸金芯片浸入水、30％浓氨水与30％双氧水的混合溶液中，水、30％浓氨水与30％双氧水的体积比为3:1:1，于70℃下浸泡40min。然后取出用去离子水清洗3次，用氮气吹干。将清洗吹干后的芯片用柏油贴合到表面等离子共振系统的棱镜上，以pH为7.4的磷酸缓冲液为流动相，选择流速为50μL/min持续流过芯片表面，待基线稳定时，注入100μL 100μg/mL的润滑素蛋白，并以20μL/min的速度流过流通池，出现表面等离子共振响应信号时，停止流速，孵育20min，再以50μL/min的流速走缓冲液10min，清洗掉未结合牢固的润滑素蛋白。

将上述获得的芯片用柏油贴合到表面等离子共振系统的棱镜上，以pH为7.4的磷酸缓冲液为流动相，选择流速为10μL/min。待基线平稳后，往定量环中分别注入100μL的蛋白溶液：0.5mg/mL的羊免疫球蛋白、2mg/mL的牛血清白蛋白、2mg/mL的溶菌酶、10％人血浆和50％人血浆，经流动相推动上述各蛋白溶液到达芯片表面，由表面等离子共振系统测定共振角实时变化曲线，20min后读取表面等离子共振角变化值，并计算非特异性吸附量分别为12.21ng/cm²、16.68ng/cm²、5.82ng/cm²、29ng/cm²和64ng/cm²，其中单一蛋白(羊免疫球蛋白、牛血清白蛋白、溶菌酶)在表面的非特异性吸附量如图2所示，相较于裸金表面蛋白的非特异性吸附量降低了至少85％。

实施例2

采用电子束蒸发镀膜技术在BK7玻璃基底上涂覆一层3nm厚的铬层，在该铬层上涂覆一层47nm厚的金膜，得到裸金芯片；将上述裸金芯片浸入水、30％浓氨水与30％双氧水的混合溶液中，水、30％浓氨水与30％双氧水的体积比为3:1:1，于85℃下浸泡15min。然后取出用去离子水清洗3次，用氮气吹干。将清洗吹干后的芯片用柏油贴合到表面等离子共振系统的棱镜上，以pH为7.4的磷酸缓冲液为流动相，选择流速为100μL/min持续流过芯片表面，待基线稳定时，注入100μL 300μg/mL的润滑素蛋白，并以50μL/min的速度流过流通池，出现表面等离子共振响应信号时，停止流速，孵育10min，再以100μL/min的流速走缓冲液20min，清洗掉未结合牢固的润滑素蛋白。

将上述获得的芯片用柏油贴合到表面等离子共振系统的棱镜上，以pH为7.4的磷酸缓冲液为流动相，选择流速为10μL/min。待基线平稳后，往定量环中分别注入100μL的蛋白溶液：0.5mg/mL的羊免疫球蛋白、2mg/mL的牛血清白蛋白、2mg/mL的溶菌酶、10％人血浆和50％人血浆，经流动相推动上述各蛋白溶液到达芯片表面，由表面等离子共振系统测定共振角实时变化曲线，20min后读取表面等离子共振角变化值，并计算非特异性吸附量分别为11.3ng/cm²、17.50ng/cm²、4.65ng/cm²、26.5ng/cm²和59ng/cm²，相较于裸金表面蛋白的非特异性吸附量降低了至少85％。

本发明制备的基于润滑素蛋白SPR芯片具有很好的抗污染性能，相比裸金对羊免疫球蛋白、牛血清蛋白、溶菌酶及10％和50％人血浆中蛋白的非特异性吸附量降低了85％以上，且抗污染效果不受溶液pH值的影响；具有良好的润滑性和生物兼容性；具有高稳定性，干燥状态下储存2个月或室温条件下储存3个月后，抗污染性能无变化；芯片表面的抗污染材料具有生物可降解性；并且本发明制备方法简便快速，减少了以往多步繁琐的制备过程，极大地提高了芯片表面修饰的效率。

以上对本发明做了示例性的描述，应该说明的是，在不脱离本发明的核心的情况下，任何简单的变形、修改或者其他本领域技术人员能够不花费创造性劳动的等同替换均落入本发明的保护范围。