一种表面等离子体共振与质谱联用装置及使用方法与流程

本发明涉及分析化学中表面等离子体共振技术与质谱技术的联用方法，具体涉及一种用于实现表面等离子体共振与质谱在线联用的装置，以及该装置的搭建和使用方法。

背景技术：

表面等离子体共振(surface plasmon resonance,SPR)技术是一种用于检测物质相互作用的分析方法，通常用于分子间相互作用(例如蛋白质相互作用、蛋白质-药物小分子相互作用等)的分析。在分析过程中，先将相互作用反应的一个反应物通过共价键、静电作用、分子间作用力等方式修饰在表面等离子体共振分析仪器的检测芯片表面，再将另一个(或几个)反应物溶解后流动通过该检测芯片的表面。当发生相互作用反应时，反应物的结合或解离将导致检测芯片的表面性质发生改变，最终反映为仪器信号的改变。表面等离子体共振分析技术无法提供被检测物质的结构信息，因此只能用于针对已知结构的物质的相互作用的检测分析之中。若想要获得相互作用体系中物质的结构信息，必须与其他分析技术联合使用。

质谱(mass spectrometry,MS)技术是一种应用广泛的物质结构分析鉴定的技术。质谱仪由离子源、质量分析器和其他系统(如真空系统、控制系统等)组成，分析时通过离子源将样品离子化，再通过质量分析器获得样品离子(包括样品的分子离子、准分子离子、碎片离子等)的质荷比，从而给出特定样品在特定分析条件下的质谱图。质谱图能够提供样品的结构、组成、性质等信息，是进一步推断样品分子结构的重要依据。由于质谱技术所能提供的强大定性分析能力，许多涉及结构鉴定的分析方法中都利用了质谱技术，例如气相色谱-质谱联用技术、液相色谱-质谱联用技术、毛细管电泳-质谱联用技术等。基于这些特性，表面等离子体共振技术若能和质谱技术实现联用，则能够在一次分析过程中同时获得关于相互作用反应的有关数据以及反应物的结构信息，这对于涉及未知物质的相互作用体系研究具有重要意义。在表面等离子体共振与质谱技术联用的实现过程中，这两种分析方法之间的接口技术，通常即质谱的离子源技术对联用过程能否实现具有重要作用，也是相关研究的热点。

目前文献中报导了部分表面等离子体共振-质谱联用的方法和装置。例如，文献“BIA/MS:Interfacing Biomolecular Interaction Analysis with Mass Spectrometry(Krone,J.R.；Nelson,R.W.；Dogruel,D.；Williams,P.；Granzow,R.Analytical Biochemistry.1997,244,124-132)”中使用了基质辅助激光解吸电离(matrix-assisted laser desorption ionization,MALDI)技术作为接口技术，使用MALDI作为离子源，电离表面等离子体共振检测芯片表面的物质，进而通过质谱进行检测。再如，文献“Combination of Biomelecular Interaction Analysis and Mass Spectrometric Amino Acid Sequencing(Natsume,T.；Nakayama,H.；Jansson,O.；Isobe,T.；Takio,K.；Mikoshiba,K.Analytical Chemistry 2000,72,4193-4198.)”中使用电喷雾(electrospray ionization,ESI)技术作为接口技术，通过ESI电离源电离表面等离子体共振的被分析溶液中的物质并进行质谱检测。根据对现有资料的检索，目前所报道的表面等离子体共振-质谱联用技术主要使用MALDI或ESI作为接口技术(同时它们也是质谱部分的离子源)，另外仅有一篇文献“Interface for Online Coupling of Surface Plasmon Resonance to Direct Analysis in Real Time Mass Spectrometry(Zhang Y.,Li X.,Nie H.,Yang L.,Li Z.,Bai Y.,Niu L.,Song D.,Liu H.Analytical Chemistry 2015,87,6505-6509)”报导了采用实施直接分析离子源(direct analysis in real time ion source,DART离子源)作为接口技术，将表面等离子体共振分析溶液喷雾后用DART源离子化进而进行质谱分析的工作。以MALDI作为接口技术存在下述问题。1、只能进行离线联用，即无法在进行表面等离子体共振分析的同时利用质谱检测表面等离子体共振的分析溶液。目前无报道指出MALDI技术可以用于实时、直接地分析表面等离子体共振分析过程中的分析溶液，而只能待表面等离子体共振分析过程完成之后，收集分析溶液或者针对分析芯片进行质谱检测。2、操作过程复杂。MALDI分析所需要的基质准备、点样等操作步骤均无法省略。采用ESI作为接口技术存在下述问题。1、虽然有时命名为在线联用，但实际上仍不是实时、直接地实现，通常需要额外的富集、洗脱等步骤或设备。2、对样品及溶液性质有限制。ESI离子源无法耐受含有高浓度难挥发盐的溶液，故对表面等离子体共振的分析体系有限制。采用DART源的接口技术虽然实现了表面等离子体共振与质谱的实时直接在线联用且能够耐受一定程度的非挥发性盐的存在，但由于DART源自身电离原理的限制，它适用的样品种类有限，对许多样品离子化程度低，影响整个联用系统和分析方法的检测灵敏度。基于此，本发明实现了基于另外一种离子化方法的表面等离子体共振与质谱联用的技术。

技术实现要素：

为了弥补现有技术的不足，本发明的目的是提供一种基于新型离子化方法的表面等离子体共振与质谱联用的装置，以及装置的搭建和使用方法，在分析化学中实现能耐受非挥发性盐的表面等离子体共振技术与质谱技术的实时、在线联用。

本发明的技术方案如下：

一种表面等离子体共振与质谱联用装置，包括离子源、质谱仪、表面等离子体共振仪和喷雾针，其特征在于，所述离子源为介质阻挡放电离子源(dielectric barrier discharge ion source,DBDI)，该离子源的出口朝向质谱仪的入口，二者距离≤5cm；DBDI离子源出口方向延长线与质谱仪入口方向延长线位于同一水平面，且这两个方向共线，或其中一者偏离另一者方向正负45°以内；表面等离子体共振仪的溶液出口通过管路与喷雾针入口连接，而喷雾针的出口位于DBDI离子源出口和质谱仪入口之间，喷雾方向朝向DBDI离子源出口-质谱仪入口连线，且喷雾方向、DBDI离子源出口方向和质谱仪入口方向位于同一平面中；喷雾针出口到DBDI离子源出口-质谱仪入口连线的垂直距离为0～5cm，且喷雾针出口与质谱仪入口的连线在质谱仪入口方向延长线上的投影长度≤4cm。

优选的，所述DBDI离子源出口方向与质谱仪入口方向共线，喷雾针的喷雾方向垂直于DBDI离子源出口-质谱仪入口连线或偏离垂直方向正负45°以内。

优选的，所述喷雾针具有同轴双层管路结构，内层管路用于溶液流通，外层用于雾化气流通。喷雾针内层入口连接表面等离子体共振仪的溶液出口，喷雾针外层入口与气体源(例如氮气钢瓶)连接。

在本发明的一个具体实施方式中，DBDI离子源出口方向正对质谱仪入口方向，二者相距1.8cm；喷雾针竖直放置，喷雾方向延长线与DBDI离子源出口-质谱仪入口连线相交，喷雾针出口尖端与DBDI离子源出口-质谱仪入口连线的垂直距离为3mm，喷雾针出口尖端与质谱仪入口的水平距离为5mm。

本发明还提供了一种进行表面等离子共振-质谱联用实验的方法，采用上述表面等离子体共振与质谱联用装置，根据以下参数设定进行实验：

表面等离子体共振分析溶液流速：≤2.0mL/min；

DBDI离子源温度设置：20℃～300℃；

DBDI离子源工作气：氮气、氦气或氩气；

DBDI离子源工作气流速：0.50L/min-1.50L/min；

喷雾针方向：指向DBDI离子源出口-质谱仪入口连线，喷雾方向延长线与DBDI离子源出口-质谱仪入口连线垂直或偏离垂直正负45°以内；

喷雾针雾化气：空气、氮气、氦气、二氧化碳或氩气；

喷雾针雾化气压力：30kPa～600kPa。

需注意，在具体的某一次实验过程中，以上参数实际取值为上述取值范围中的某个具体值，需根据实验体系进行优化确定。其他实验参数和方法，例如表面等离子体共振实验过程的参数方法、质谱仪的参数方法，根据实际实验体系确定，不作为本发明的组成部分。

本发明的装置工作时，表面等离子体共振仪器的分析溶液经过喷雾针雾化，进而被DBDI离子源电离并被引入质谱仪分析，可以在同一次分析中同时获得表面等离子体共振数据和质谱数据，实现表面等离子体共振技术和质谱技术的实时在线联用，并且本发明对于分析溶液的含盐量等条件无要求。相对于基于DART离子源的表面等离子体共振与质谱联用装置，本发明对于非挥发性盐的耐受性更好，可以使用含盐量范围更广的样品和溶液，并且对于部分样品的离子化能力更强，表现为结果中样品信号的显著提升，更加适用于表面等离子体共振和质谱的联用。

附图说明

图1：本发明的表面等离子体共振-质谱联用装置示意图。

图2：本发明的表面等离子体共振-质谱联用装置的局部照片。

图3：本发明实施例中所使用喷雾针的结构及主要仪器位置示意图。

图4：实施例1中检测人血清白蛋白-对乙酰氨基酚相互作用的表面等离子体共振-质谱联用结果图，其中a为表面等离子体共振结果；b为质谱总离子流强度图；c为b第5分钟左右的质谱图。

图5：实施例2中检测人血清白蛋白-马尿酸相互作用的表面等离子体共振-质谱联用结果图，其中a为表面等离子体共振结果；b为质谱总离子流强度图；c为b第5分钟左右的质谱图。

图6：实施例3中对比本发明基于DBDI离子源和现有技术基于DART离子源的表面等离子体共振-质谱联用装置，在分析对乙酰氨基酚和甲硝唑两种样品时的信号强度结果图。

具体实施方式

以下结合附图，通过实施例，进一步阐述本发明的技术方案，但是本申请的保护范围不受这些实施例的具体条件的限制。

实施例1：采用本发明基于DBDI离子源的表面等离子体共振-质谱联用装置，进行表面等离子体共振-质谱联用实验，检测人血清白蛋白-对乙酰氨基酚相互作用并实时进行质谱数据的采集。具体步骤如下。

(1)表面等离子体共振检测芯片的表面修饰。所使用的检测芯片为镀有金膜的透明玻璃片。将洁净的检测芯片安装到表面等离子体共振仪器中后，依次将以下溶液以0.2mL/min的流速流通芯片表面(镀金面)：A、4mmol/L 3-巯基丙酸水溶液，流通60min；B、EDC与NHS混合水溶液，其中EDC(N-(3-(dimethylamino)propyl)-N’-ethylcarbodiimide hydrochloride)为12.5g/L，NHS(N-hydroxysuccinimide)为2.5g/L，流通20min；C、人血清白蛋白溶于乙酸-乙酸钠缓冲溶液形成的溶液，蛋白浓度0.01g/L，乙酸钠5mmol/L，pH为5.0，流通12h；D、乙醇胺水溶液(1mol/L，用盐酸调pH至8.4)，10min。此时人血清白蛋白已被修饰到检测芯片表面。

(2)装置搭建及实验准备。被测物为对乙酰氨基酚，溶于PBS缓冲液(phosphate buffered saline，含10mmol/L磷酸钠盐，138mmol/L氯化钠，2.7mmol/L氯化钾，pH为7.4)，浓度为20mmol/L。将DBDI离子源温度设为180℃，He为工作气，流量为0.90L/min。装置按照图1方式搭建。如图3所示，DBDI离子源出口方向正对质谱仪入口方向，DBDI离子源出口与质谱仪入口相距1.8cm(即图3中d₁＝1.8cm)。喷雾针垂直放置，喷雾针尖端到DBDI离子源出口-质谱仪入口连线的垂直距离为3mm(即图3中d₃＝3mm)，喷雾针出口尖端与质谱仪入口的水平距离为5mm(即图3中d₂＝5mm)。喷雾气为氮气，压力138kPa。质谱仪采用正模式，扫描记录质荷比100-400的离子。表面等离子体共振仪器为衰减全反射式，记录固定入射角(SPR角)时反射光的强度。

(3)表面等离子共振-质谱联用实验。同时开始表面等离子体共振仪器与质谱仪的数据采集。在第0至第2分钟，使纯PBS缓冲液以0.2mL/min速率流通。溶液先流经检测芯片表面并与芯片表面固定的人血清白蛋白发生相互作用，再通过喷雾针雾化，然后经DBDI离子源电离，离子被质谱仪检测。从第3分钟开始，使对乙酰氨基酚的PBS溶液开始流通，持续4分钟。此后再切换回纯PBS溶液流通，再持续8分钟后停止流通并停止仪器数据采集。

(4)结果分析。实验结果如图4所示。图4中的a部分为表面等离子体共振结果，显示出射光强改变量随时间的变化，b为质谱总离子流强度图，时间与a图一致，c图为b图第5分钟左右的质谱图。图4中，a显示随着对乙酰氨基酚溶液开始流通，表面等离子体共振出射光强发生改变(图中第2分钟开始)，表示样品开始与人血清白蛋白相互作用，结合到检测芯片表面。图中第6分钟开始信号逐渐降低，表示随着纯溶剂开始流动，结合的样品开始解离并被洗脱。b图中质谱总离子强度显示了与a图一致的趋势，证明了通过本发明的装置，表面等离子体共振实验中的流通溶液，即相互作用反应的一个反应物，能够被喷雾、离子化、检测，证明了本发明的有效性。c图为质谱图，其中最强峰(质荷比152)为对乙酰氨基酚分子质子化后的准分子离子峰，证明本装置可被用于实时的结构鉴定。

实施例2：采用本发明基于DBDI离子源的表面等离子体共振-质谱联用装置，进行表面等离子体共振-质谱联用实验，检测人血清白蛋白-马尿酸相互作用并实时进行质谱数据的采集。具体步骤如下。

(1)表面等离子体共振检测芯片的表面修饰。所使用的检测芯片为镀有金膜的透明玻璃片。将洁净的检测芯片安装到表面等离子体共振仪器中后，依次将以下溶液以0.2mL/min的流速流通芯片表面(镀金面)：A、4mmol/L 3-巯基丙酸水溶液，流通60min；B、EDC与NHS混合水溶液，其中EDC(N-(3-(dimethylamino)propyl)-N’-ethylcarbodiimide hydrochloride)为12.5g/L，NHS(N-hydroxysuccinimide)为2.5g/L，流通20min；C、人血清白蛋白溶于乙酸-乙酸钠缓冲溶液形成的溶液，蛋白浓度0.01g/L，乙酸钠5mmol/L，pH为5.0，流通12h；D、乙醇胺水溶液(1mol/L，用盐酸调pH至8.4)，10min。此时人血清白蛋白已被修饰到检测芯片表面。

(2)装置搭建及实验准备。被测物为马尿酸，溶于PBS缓冲液(phosphate buffered saline，含10mmol/L磷酸钠盐，138mmol/L氯化钠，2.7mmol/L氯化钾，pH为7.4)，浓度为20mmol/L。将DBDI离子源温度设为180℃，He为工作气，流量为0.90L/min。装置按照图1方式搭建。如图3所示，DBDI离子源出口方向正对质谱仪入口方向，DBDI离子源出口与质谱仪入口相距1.8cm(即图3中d₁＝1.8cm)。喷雾针垂直放置，喷雾针尖端到DBDI离子源出口-质谱仪入口连线的垂直距离为3mm(即图3中d₃＝3mm)，喷雾针出口尖端与质谱仪入口的水平距离为5mm(即图3中d₂＝5mm)。喷雾气为氮气，压力138kPa。质谱仪采用负模式，扫描记录质荷比100-400的离子。表面等离子体共振仪器为衰减全反射式，记录固定入射角(SPR角)时反射光的强度。

(3)表面等离子共振-质谱联用实验。同时开始表面等离子体共振仪器与质谱仪的数据采集。在第0至第2分钟，使纯PBS缓冲液以0.2mL/min速率流通。溶液先流经检测芯片表面并与芯片表面固定的人血清白蛋白发生相互作用，再通过喷针雾化，然后经DBDI离子源电离，离子被质谱仪检测。从第3分钟开始，使马尿酸的PBS溶液开始流通，持续4分钟。此后再切换回纯PBS溶液流通，再持续8分钟后停止流通并停止仪器数据采集。

(4)结果分析。实验结果如图5所示。图5中的a部分为表面等离子体共振结果，显示出射光强改变量随时间的变化，b为质谱总离子流强度图，时间与a图一致，c图为b图第5分钟左右的质谱图。图5中，a显示随着样品溶液开始流通，表面等离子体共振出射光强发生改变(图中第2分钟开始)，表示样品开始与人血清白蛋白相互作用，并结合到检测芯片表面。图中第6分钟开始信号逐渐降低，表示随着纯溶剂开始流动，结合的样品开始解离并被洗脱。b图中质谱总离子强度显示了与a图一致的趋势，证明了通过本发明的装置，表面等离子体共振实验中的流通溶液，即相互作用反应的一个反应物，能够被喷雾、离子化、检测，证明了本发明的有效性。c图为质谱图，其中最强峰(质荷比177.8)为马尿酸分子电离一个质子后的准分子离子峰，证明本装置可被用于实时的结构鉴定。

实施例3：对比本发明基于DBDI离子源的表面等离子体共振-质谱联用装置和文献“Interface for Online Coupling of Surface Plasmon Resonance to Direct Analysis in Real Time Mass Spectrometry(Zhang Y.,Li X.,Nie H.,Yang L.,Li Z.,Bai Y.,Niu L.,Song D.,Liu H.Analytical Chemistry 2015,87,6505-6509)”中报道的基于实施直接分析离子源(DART源)的表面等离子共振-质谱联用装置，在分析对乙酰氨基酚和甲硝唑两种样品时的信号强度结果图。具体步骤如下。

(1)基于DBDI源的装置搭建及实验准备。被测物为对乙酰氨基酚和甲硝唑，分别溶于PBS缓冲液(phosphate buffered saline，含10mmol/L磷酸钠盐，138mmol/L氯化钠，2.7mmol/L氯化钾，pH为7.4)，浓度均为20mmol/L。将DBDI源温度设为180℃，He为工作气，流量为0.90L/min。装置按照图1方式搭建。参见图3，DBDI出口方向正对质谱入口方向，d₁＝1.8cm。喷雾针垂直放置，喷雾针尖端与质谱仪入口垂直距离d₃为3mm，水平距离d₂为5mm。喷雾气为氮气，压力138kPa。质谱仪采用正模式，扫描记录质荷比100-400的离子。

(2)基于DART源的装置搭建及实验准备。被测物为对乙酰氨基酚和甲硝唑，分别溶于PBS缓冲液(phosphate buffered saline，含10mmol/L磷酸钠盐，138mmol/L氯化钠，2.7mmol/L氯化钾，pH为7.4)，浓度均为20mmol/L。将DART源温度设为450℃，He为工作气，流量为0.12m³/h。装置仍按照图1方式搭建，但把其中的DBDI源替换为DART源。参见图3，DART源出口方向正对质谱入口方向，相距2.0cm(即d₁＝2.0cm)。喷雾针垂直放置，喷雾针尖端与质谱仪入口垂直距离d₃为6mm，水平距离d₂为10mm。喷雾气为氮气，压力104kPa。质谱仪采用正模式，扫描记录质荷比100-400的离子。此时基于DART源的接口和基于DBDI源的接口均工作于各自的最优条件下。

(3)对比实验。在(1)和(2)搭建的装置下，分别以0.2mL/min的流速使样品溶液流通。开启离子源和质谱仪数据记录过程，记录两种样品溶液电离后的准分子离子峰强度(对乙酰氨基酚：质荷比152；甲硝唑：质荷比172)。由于此实施例目的在于对比两种离子源的电离效果，本例中不记录表面等离子共振数据，仅记录样品流通并被电离后的准分子离子峰强度。结果如图6所示。

(4)结果分析。如图6所示，针对对乙酰氨基酚样品溶液，使用DBDI离子源时其信号强度可达使用DART离子源时信号强度的十倍以上(两种离子源分别在各自的最优条件下操作，其他所有仪器和操作参数相同)，对甲硝唑溶液，使用DBDI离子源时其信号强度亦可达使用DART离子源时信号强度的五倍。这证明本发明中基于DBDI源的表面等离子体共振-质谱联用装置，不仅能够实现两种技术的实时直接在线联用且能耐受非挥发性盐，更在分析某些样品时表现了显著强于DART源的离子化能力。