一种视黄醇结合蛋白的定量测定方法、试剂及试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本申请涉及一种人体视黄醇结合蛋白的定量测定方法、试剂及试剂盒。
【背景技术】
[0002] 视黄醇结合蛋白是血液中维生素的转运蛋白，由肝脏合成、广泛分布于血液、脑 脊液、尿液及其他体液中。血液中视黄醇结合蛋白以视黄醇、前白蛋白结合的复合物形式 存在，当复合物中视黄醇与靶细胞结合后，视黄醇结合蛋白便与前白蛋白分离，自肾小球滤 出，由近端肾小管上皮细胞吸收、降解。测定视黄醇结合蛋白能早期发现肾小管的功能损 害，并能灵敏反映肾近曲小管的损害程度，还可作为肝功能早期损害和监护治疗的指标。
[0003] 目前已知的测定视黄醇结合蛋白的方法有放射免疫测定法、酶联免疫测定法、乳 胶凝集试验和免疫比浊法、荧光免疫测定法、滴金免疫法。这些方法具有操作繁琐、耗时长、 价格昂贵、过度浪费资源的缺点，不适于常规检验，尤其是大规模流行病学检查或临床大批 量标本诸多项目的同时检测。
【发明内容】
[0004] 本申请的目的是提供一种能够应用于大规模临床试验的人体血清中视黄醇结合 蛋白的定量测定方法、试剂及试剂盒。
[0005] 本申请采用了以下技术方案：
[0006] 本申请的一方面公开了一种定量测定人体血清中视黄醇结合蛋白含量的试剂，该 试剂由分别放置的试剂I和试剂Π 组成，其中，所述试剂I含有磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、 聚乙二醇6000 ;所述试剂II含有磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、羊抗人视黄醇结合蛋白抗体、乳 胶、吐温-20、蛋白保护剂2、小牛白蛋白。
[0007] 进一步的，所述试剂I中蛋白保护剂2为甘油。
[0008] 进一步的，所述试剂I中磷酸二氢钠含量为100-200mmol/L，磷酸氢二钠含量为 100-200mmol/L，聚乙二醇 6000 的浓度为 1-2. 5% (W/W)。
[0009] 进一步的，所述试剂I中磷酸二氢钠含量为100mmol/L，磷酸氢二钠含量为 100mmol/L，聚乙二醇 6000 的浓度为 I. 2% (W/W)。
[0010] 进一步的，所述试剂II中磷酸二氢钠含量为100-200mmol/L，磷酸氢二钠含量 为100-200mm 〇l/L，羊抗人视黄醇结合蛋白抗体含量为0. 1-0. 5g/L，乳胶含量为0. 5-5g/ L，吐温-20含量为0. 1-0. 5 % (V/V)，蛋白保护剂2含量为0. 5-1. 5 %，小牛白蛋白含量为 20-100g/L〇
[0011] 进一步的，所述试剂II中磷酸二氢钠含量为100mm〇l/L，磷酸氢二钠含量为 100mmol/L，羊抗人视黄醇结合蛋白抗体含量为0. 15g/L，乳胶含量为0. 6g/L，吐温-20含量 为0. 3% (V/V)，蛋白保护剂2含量为1%，小牛白蛋白含量为50g/L。
[0012] 本申请的另一方面提供一种定量测定人体血清中视黄醇结合蛋白含量的试剂盒， 其中装有上述定量测定人体血清中视黄醇结合蛋白含量的试剂，该试剂由分别放置的试剂 I及试剂π组成。
[0013] 本申请的另一方面提供一种定量测定人体血清中视黄醇结合蛋白含量的方法，该 方法包括向血清样品中加入所述试剂I，37°C孵育2-5分钟，然后加入试剂II，继续孵育10 秒后，在一定的波长下测定样品吸光度Al ;3分钟后测定吸光度A2,由下式（1)计算Λ A样 本；用同样的方法测定校准液的吸光度值Λ A标准；再通过下式（2)计算得到血清样品的 视黄醇结合蛋白含量：
[0014] AA = Α2-Α1 (1)
[0015] 血清中视黄醇结合蛋白含量（mg/L) =Λ A样本/ Λ A标准X标准液浓度（2)
[0016] 本方法的原理为：将视黄醇结合蛋白与试剂中相应抗体结合成抗原-抗体复合 物，形成一定的浊度。测定该浊度，并与标准曲线比较，即能得出样本中视黄醇结合蛋白的 含量。
[0017] 本发明直接定量测定人血清样品中视黄醇结合蛋白含量的试剂盒，是将分别放置 的上述试剂I和试剂II以不同的规格装入试剂盒包装中。该试剂盒具有多种不同的规格， 可以分别适用于目前在临床实验室普遍使用的各种国内外品牌的自动生化分析仪器。
[0018] 本发明采用的试剂盒及检测方法只需几微升血清，无需离心或电泳等分离处理， 操作简便，可满足全自动化分析的要求，适用于大规模样品的及时准确检测。
【具体实施方式】
[0019] 实施例一
[0020] 按照下述成分和比例配置下述本发明试剂I及试剂II :
[0021] 试剂 I:
[0022] 磷酸二氢钠 lOOmmol/L
[0023] 磷酸氢二钠 100mmol/L
[0024] 聚乙二醇 6000 2.5%
[0025] 试剂 II :
[0026] 磷酸二氢钠 100mmol/L 磷酸氢二钠 100mmol/L 羊抗人视黄醇结合蛋白抗体 0. 15g/L 120nm 乳胶 0. 6g/L 吐温-20 0. 3% 蛋白保护剂2 1% 小牛白蛋白 50g/L
[0027] 在样品管中将240 μ 1试剂I和3 μ 1血清样品混合，在37 °C孵育2-5分钟，然后向 样品中加入60 μ 1试剂II，混匀，继续孵育10秒后，使用雅培C16000全自动生化分析仪，空 白调零，在波长340nm处，测定吸光度Al，3分钟后测定吸光度Α2。根据如下公式（1)计算 Λ A样本。用同样的方法和条件测定标准液的吸光度值，并计算Λ A标准。然后根据公式 (2)计算样品的血清样品中视黄醇结合蛋白含量：
[0028] AA = A2-A1 (1)
[0029] 血清中视黄醇结合蛋白含量（mg/L) =Λ A样本/ Λ A标准X标准液浓度（2)
[0030] 本申请所用标准品为伯乐标准品。
[0031] 实施例二
[0032] 按照下述成分和比例配置下述本发明试剂I及试剂II :
[0033] 试剂 I:
[0034] 磷酸二氢钠 lOOmmol/L
[0035] 磷酸氢二钠 100mmol/L
[0036] 聚乙二醇 6000 1%
[0037] 试剂 II :
[0038] 磷酸二氢钠 100ramol/L 磷酸氢二钠 IOOramol/L 羊抗人视黄醇结合蛋白抗体 0.1 g/L 120nm 乳胶 0. 5g/L 吐温-20 0. 1% 蛋白保护剂2 0.5% 小牛白蛋白 20g/L
[0039] 在样品管中将240 μ 1试剂I和3 μ 1血清样品混合，在37 °C孵育2-5分钟，然后向 样品中加入60 μ 1试剂II，混匀，继续孵育10秒后，使用日立7180型全自动生化分析仪，空 白调零，在波长340nm处，测定吸光度Al，3分钟后测定吸光度