一种异型性组织细胞分析试剂的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种检测试剂，具体地说是一种异型性组织细胞分析试剂。
【背景技术】
[0002] 肿瘤组织无论在细胞形态和组织结构上，都与其发源的正常组织有不同程度的 差异，这种差异称为异型性（atypia)。肿瘤组织异型性的大小反映了肿瘤组织的成熟程度 (即分化程度，在此指肿瘤的实质细胞与其来源的正常细胞和组织在形态和功能上的相似 程度)。异型性小者，说明它和正常组织相似，肿瘤组织成熟程度高(分化程度高);异型性大 者，表示瘤组织成熟程度低（分化程度低)。恶性肿瘤常具有明显的异型性。区别这种异型 性的大小是诊断肿瘤，确定其良、恶性的主要组织学依据。
[0003] 在致癌因素的作用下，组织细胞发生代谢学及形态学异型性改变。肿瘤细胞出现 能量代谢重编程，表现为瓦博格氏效应。细胞内呈现低氧和还原态环境，激活氧感受器和缺 氧信号传导通路，促使缺氧特异性转录因子-低氧诱导因子和第二信使-活性氧族活性增 高，改变细胞色素等血红素蛋白的极性量值，使位居蛋白疏水核中的原血红素析出，成为肿 瘤组织细胞原血红素（The protoheme of tumor cells，TCPH)。这种肿瘤细胞能量代谢重 编程，导致局部组织中TCPH含量增加。TCPH具有氧化损伤作用，它干扰细胞的微环境，催生 多种自由基，引起细胞膜脂质、脂蛋白、细胞骨架、DNA等的氧化损伤，使细胞周期中的DNA 损伤检查点等失去阻滞作用，引起染色体端粒附近DNA序列丢失以及染色体的重排和基因 扩增，表现为组织细胞的异型性变化。TCPH析出量与细胞异型性改变程度呈正相关。所以， 分析TCPH的有无及其含量，就可以了解组织细胞异型性改变的有无及其程度。
[0004] 由于肿瘤性炎症的炎性渗出，TCPH与肿瘤性炎性渗液一道被排出，肿瘤性炎性渗 液则成为TCPH检测的直接生物学介质。TCPH是一种酶样物质，具有过氧化物酶样作用，经 过特定的氧化-还原反应而出现显色反应。观察显色情况即可测及TCPH，进而了解组织细 胞异型性改变的情况。经检索，目前尚无异型性组织细胞分析试剂。目前，本发明试剂是唯 一能实现对组织细胞异型性变化进行检测分析的试剂。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种异型性组织细胞分析试剂。本发明制备的试剂准确、 方便、快速，以读取吸光度的方法在全自动分析仪器上定量检测组织渗液中肿瘤组织细胞 原血红素（The protoheme of tumor cells，TCPH)的含量，由于TCPH析出量与细胞异型性 改变程度呈正相关，进而根据其含量大小分析组织细胞有否异型性变化及其程度。
[0006] 本发明采用以下技术方案： 一种异型性组织细胞分析试剂，其特征在于，它由试剂A和试剂B组成；所述试剂A为 pH为3. 2~6. 8的磷酸盐缓冲液；所述试剂B由供氢体、供氧体、稳定剂、增敏剂、调色剂、有 机助溶剂组成； 所述供氢体为1.0-3. 0g /L的3, 3'，5, 5'-四甲基联苯胺； 所述供氧体为3-10ml/L过氧化羟基异丙苯； 所述稳定剂为12_24g/L聚乙烯吡咯烷酮K30 ; 所述增敏剂为3-9ml /L的6-甲氧基喹啉； 所述调色剂为0. 02-0. 2g/L金橙G ; 所述有机助溶剂为无水乙醇。
[0007] 所述磷酸盐缓冲液浓度为0? 1~1. 0 mol/L〇
[0008] 所述试剂A与试剂B的体积比为2:1。
[0009] 优选的，所述的异型性组织细胞分析试剂，所述试剂A是pH为5. 5的lmol/L磷酸 盐缓冲液；所述试剂B由2g /L的3, 3'，5, 5' -四甲基联苯胺、5ml/L过氧化羟基异丙苯、 20g/L聚乙烯吡咯烷酮K30、4. 5 ml /L的6-甲氧基喹啉、0. 02g/L金橙G、无水乙醇组成。
[0010] 本发明的异型性细胞分析试剂是采用下述方法制备的： (1)试剂A :配制磷酸盐缓冲溶液。
[0011] (2)试剂 B: 1) 将供氢体、稳定剂、调色剂加入到无水乙醇中，搅拌至完全溶解； 2) 将供氧体加入上述溶液中，搅拌至完全溶解； 3) 将增敏剂加入到步骤2)制得的溶液中，搅拌至完全溶解即得。
[0012] 本发明试剂的测试原理如下：肿瘤组织细胞原血红素是一种酶样物质，具有过氧 化物酶样作用，具备水解过氧化物的能力。肿瘤细胞原血红素与过氧化物反应，摘取过氧化 物的氧原子，并与氧原子结合形成氧化型肿瘤细胞原血红素；氧化型肿瘤细胞原血红素极 不稳定，迅即又脱掉氧原子传递给供氢体四甲基联苯胺，使原本不含发色集团的供氢体3， 3'，5, 5'-四甲基联苯胺脱氢，生成含发色集团醌基的蓝色物质联苯胺蓝。样本内若不含有 肿瘤组织细胞原血红素，则无联苯胺蓝生成，因之不显色；样本内若含有肿瘤组织细胞原血 红素，则有联苯胺蓝生成，反应液逐渐呈现蓝色。显色的深浅与样本内含有的肿瘤组织细胞 原血红素成正比。TCPH析出量与细胞异型性改变程度呈正相关。因此，分析TCPH的有无及 其含量，就可以了解组织细胞异型性改变的有无及其程度。
[0013] 本发明试剂的使用方法如下：将试剂A、试剂B和待测样本按照2:1:2的比例在全 自动肿瘤组织细胞原血红素检测分析仪上进行测试。首先分析仪以试剂加样针1自动在试 剂仓内吸取200 y L本发明制备的试剂A加入比色管中，以样本加样针自动在样本瓶内吸取 200 y L样本加入比色管中，再以试剂加样针2自动在试剂仓内吸取100 y L本发明制备的试 剂B加入比色管中，37°C温育使试剂与样本充分反应。在反应72秒的时间点上，以光电比 色法自动读取该样本与本发明制备的试剂反应后显色液的吸光度，以此吸光度值通过仪器 设定的标准曲线读取相对应的肿瘤组织细胞原血红素的含量值。TCPH含量值与细胞异型性 改变程度呈正相关。所以，分析TCPH的有无及其含量，就可以了解组织细胞异型性改变的 有无及其程度。
[0014] 本发明的有益效果是：本发明制备的试剂准确、方便、快速，以直接读数的定量方 法、在全自动分析仪器上批量检测组织渗液中肿瘤组织细胞原血红素（TCPH)的含量，进而 根据其含量准确的判断组织细胞异型性变化的大小；其稳定性好，该试剂在低温干燥环境 下可以稳定保存2年；此外，它的特异性强，检测TCPH的灵敏度可达到10 y g/L，可以准确 的反映出细胞异型性变化的有无及其程度。
【具体实施方式】
[0015] 下面结合具体实施例对本发明的内容做进一步的详细说明。
[0016] 实施例1 异型性组织细胞分析试剂 试剂A :lmol/L的pH 5. 5磷酸盐缓冲液； 试剂B :2g/L的3, 3'，5, 5'-四甲基联苯胺、20 g/L聚乙烯吡咯烷酮K30、5ml/L过氧化 羟基异丙苯、4.5 1111/1的6-甲氧基喹啉、2〇11^/1金橙6。制备方法如下：将3,3'，5,5'-四 甲基联苯胺2g、聚乙烯吡咯烷酮K30 20g、金橙G 200mg加入到无水乙醇1000ml中，搅拌至 完全溶解；将过氧化羟基异丙苯5ml加入上述溶液中，搅拌至完全溶解；将6-甲氧基喹啉 4. 5 ml加入到第二步制得的溶液中，搅拌至完全溶解得成品试剂。
[0017] 实施例2 异型性组织细胞分析试剂 试剂A :0? 5mol/L的pH 3. 2磷酸盐缓冲液； 试剂B:1.0g /L的3,3'，5,5'_四甲基联苯胺、3ml/L过氧化羟基异丙苯、12g/L聚乙烯 吡咯烷酮1(30、31111/1的6-甲氧基喹啉、0.028/1金橙6。制备方法如下：将3,3'，5,5'-四 甲基联苯胺lg、聚乙烯吡咯烷酮K30 12g、金橙G 20mg加入到无水乙醇1000ml中，搅拌至 完全溶解；将过氧化羟基异丙苯3ml加入上述溶液中，搅拌至完全溶解；将6-甲氧基喹啉 3ml加入到第二步制得的溶液中，搅拌至完全溶解的成品试剂。
[0018] 实施例3 异型性组织细胞分析试剂 试剂A :0? lmol/L的pH 6. 8磷酸盐缓冲液； 试剂B:3.0g /L的3,3'，5,5'-四甲基联苯胺、1〇!111/1过氧化羟基异丙苯、248/1聚乙 烯吡咯烷酮K30、9ml /L的6-甲氧基喹啉、0. lg/L金橙G。制备方法如下：将3,3'，5,5'_四 甲基联苯胺3g、聚乙烯吡咯烷酮K30 24g、金橙G 100mg加入到无水乙醇1000ml中，搅拌至 完全溶解；将过氧化羟基异丙苯l〇ml加入上述溶液中，搅拌至完全溶解；将6-甲氧基喹啉 9ml加入到第二步制得的溶液中，搅拌至完全溶解的成品试剂。
[0019] 实施例4 准确度实验 实验设备：全自动检测分析仪。
[0020] TCPH 标准品： 1号标准品：含肿瘤组织细胞原血红素l〇mg/L ; 2号标准品：含肿瘤组织细胞原血红素lmg/L ; 3号标准品：含肿瘤组织细胞原血红素100 y g /L ; 4号标准品：含肿瘤组织细胞原血红素10 y g /L ; 5号标准品：含肿瘤组织细胞原血红素1 y g /L ; 6号标准品：空白对照品。
[0021] 实验方法：取每个标准品30份使用实施例1制得的分析试剂进行肿瘤组织细胞原 血红素分析检测，取其均数及标准差与标准含量进行对照并进行统计学处理。
[0022] 实验结果：如表1所示。
[0023] 表1准确度实验结果
【主权项】
1. 一种异型性组织细胞分析试剂，其特征在于，它由试剂A和试剂B组成；所述试剂A 为pH为3. 2~6. 8的磷酸盐缓冲液；所述试剂B由供氢体、供氧体、稳定剂、增敏剂、调色剂、 有机助溶剂组成； 所述供氢体为1.0-3.Og/L的3, 3'，5, 5'-四甲基联苯胺； 所述供氧体为3-10ml/L过氧化羟基异丙苯； 所述稳定剂为12_24g/L聚乙烯吡咯烷酮K30 ; 所述增敏剂为3-9ml /L的6-甲氧基喹啉； 所述调色剂为0.02-0. 2g/L金橙G; 所述有机助溶剂为无水乙醇。
2. 根据权利要求1所述的异型性组织细胞分析试剂，其特征在于，所述磷酸盐缓冲液 浓度为 〇? 1~1. 〇 mol/L。
3.根据权利要求1所述的异型性组织细胞分析试剂，其特征在于，所述试剂A是pH为 5. 5的1.0 mol/L磷酸盐缓冲液；所述试剂B由2g /L的3, 3'，5, 5' -四甲基联苯胺、5ml/L 过氧化羟基异丙苯、20g/L聚乙烯吡咯烷酮K30、4. 5 ml /L的6-甲氧基喹啉、0. 02g/L金橙 G、无水乙醇组成。
【专利摘要】本发明公开了一种异型性组织分析试剂。该试剂是由试剂A和试剂B组成；所述试剂A为pH为3.2~6.8的磷酸盐缓冲液；所述试剂B由供氢体、供氧体、稳定剂、增敏剂、调色剂、有机助溶剂组成。本发明制备的试剂准确、方便、快速，以直接读数的定量方法、在全自动分析仪器上批量检测组织渗液中肿瘤组织细胞原血红素（TCPH）的含量，进而根据其含量准确的判断组织细胞异型性变化的大小；其稳定性好，该试剂在低温干燥环境下可以稳定保存2年；此外，它的特异性强，检测TCPH的灵敏度可达到10μg/L，可以准确的反映出细胞异型性变化的有无及其程度。
【IPC分类】G01N21-78, G01N33-72
【公开号】CN104849272
【申请号】CN201510295105
【发明人】蒋春亮
【申请人】蒋春亮
【公开日】2015年8月19日
【申请日】2015年6月2日