一种疏血通注射液中多肽(寡肽)类成分质量控制的新方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于中药分析领域，涉及一种中药制剂的质量控制方法，具体来说，就是采 用一种液相色谱（HPLC)分离，质谱（MS)检测，结合多反应监测（MRM)，建立疏血通注射液 的LC-MS-MRM分离、检测、统计鉴定相结合的质量控制模型，并用此模型进行疏血通注射液 中多肽（寡肽）类成分的质量控制。
【背景技术】
[0002] 传统中药及其制剂化学成分多样和复杂，正是其物质基础的多样性和复杂性，共 同解释了中医药的整体治疗理念和多靶点作用的物质基础，近年来，中药物质基础研宄如 火如荼的进行，但在少量、微量和痕量物质研宄方面存在突破的瓶颈，通常情况下，这些物 质在中医药预防和治疗疾病中扮演非常重要的角色，如何确定中药及其制剂中这些少量、 微量和痕量物质，并将这些物质采用简单、易行和科学的方法进行质量控制，是中医药从业 人员需要攻克的一个难题。
[0003] 疏血通注射液是友搏药业自主研发的国家中药二类新药，由水蛭、地龙提取并精 制而成，为国内第一个动物复方水针剂型品种，具有活血化瘀、通经活络之功效，主要用于 瘀血阻络所致的脑梗塞急性期，能有效的改善因脑缺血所引发的口眼歪斜、半身不遂、语言 謇涩等症状。疏血通注射液大类成分主要含有内源性小分子碱基类、游离氨基酸、游离单 糖、小分子多肽（寡肽）、寡糖或糖肽等多个大类成分，通常认为疏血通中的小分子多肽（寡 肽）可能是疏血通起效的活性组分，但由于含量甚微，采用HPLC直接进样及常规检测器 分析，很难获得良好的信号响应，目前现行疏血通注射液国家药品标准对于其中多肽类组 分的分析采用的是常规的柱前氨基酸衍生化HPLC分析法间接测定，主要是通过测定样品 水解后总的氨基酸含量扣除样品中的游离氨基酸含量，折算其中的多肽类组分含量，试验 过程复杂，操作繁琐，若操作不当，可能存在干扰及专属性不强的问题，且对其真实的多肽 (寡肽）类组分表征性不强。
[0004] MS-MRM(multiplereactionmonitoring)技术是基于已知信息或假定信息设定 质谱检测规则，对符合规则的离子进行信号记录，去除大量不符合规则离子信号的干扰，从 而得到质谱信息的一种数据获取方式。具体地说，即是根据多肽母离子质量数和碎片离子 质量数，选择母离子-子离子对，允许符合设定的母离子进入碰撞室，碰撞完成后，只记录 设定子离子信号，通过母离子和子离子的两次选择，去除干扰离子，降低化学背景，提高灵 敏度，MS-MRM分析能够获得具有足够统计学意义的定量数据，针对选定的母离子-离子对， 质谱仪可以调整相应的肽段碎裂能量，有效提高碎片离子的质谱响应信号，提高肽段检测 的灵敏度，并可以实现在一次质谱进样分析中达到对几百乃至上千个目标肽段的分析，提 高检测效率，利用MS-MRM技术特异性，对符合设定的多肽进行检测，并且进一步进行增强 产物扫描分析，得到高分辨的串联质谱（MS/MS)碎片数据，使分析过程中的定性结果假阳 性率大大降低。基于前述技术手段，本发明拟选择合适的样品前处理方法，比如借助于分子 筛柱层析实现疏血通注射液的脱盐，并可实现对感兴趣的多肽（寡肽）类组分的富集，再通 过HPLC对其中的多肽（寡肽）类组分进一步分离，借助MRM技术，通过MS检测器对符合设 定规则的靶标肽段母离子与子离子进行扫描分析，去除了干扰离子，降低化学背景，提高了 分析灵敏度，从而建立了一种疏血通注射液中多肽（寡肽）类组分的鉴定手段，可以快速对 疏血通注射液中的相关多肽（寡肽）类组分进行鉴定分析，从而进一步实现对疏血通注射 液中的多肽（寡肽）类组分的定性及质量控制。
【发明内容】
[0005] 1、发明目的
[0006] 本发明的目的在于提供一种液相色谱（HPLC)分离，质谱（MS)检测，结合多反应监 测（MRM)，建立疏血通注射液的LC-MS-MRM分离、检测、统计鉴定相结合的质量控制模型，并 用此模型进行疏血通注射液中多肽（寡肽）类成分的质量控制。
[0007] 2、本发明的具体技术方案
[0008] 疏血通注射液中多肽（寡肽）类成分的的检测方法，包括如下步骤：
[0009] (1)将疏血通注射液供试品溶液进行脱盐处理
[0010] 脱盐可采用柱层析或透析处理，优选分子筛柱层析或离子交换柱层析脱盐处理， 更进一步优选分子筛柱层析脱盐处理。分子筛柱层析填料可以是葡聚糖凝胶（sephadexG 或者sephacrylS)系列，也可以是聚丙烯酰胺凝胶（BIO-GelP)系列，或者是琼脂糖凝胶 (Sepharose)系列，优选葡聚糖凝胶系列sephadexG10、sephadexG15 或sephadexG25,更 进一步优选sephadexG15或sephadexG25填料，洗脱剂优选水。
[0011] ⑵HPLC分离
[0012] 将收集的脱盐样品溶液高速离心或过0.2ym滤膜后，进行HPLC分离。可以采用普 通液相色谱条件分离，也可以进行纳升液相色谱条件分析，还可采用超高效液相色谱条件 分析。更进一步优化普通液相色谱条件：色谱柱采用C18为固定相，流动相A为0. 1 %甲酸 水溶液，流动相B为乙腈或0. 1 %甲酸乙腈溶液，流速及梯度条件根据所用的色谱柱可适当 调整。当选择纳升液相色谱时，优选流速为0. 4y1/min，优选梯度洗脱条件：0~6min，B 为 5%- 8% ;6 ~40min，B为 8%- 30% ;40 ~45min，B为 30%- 60% ;45 ~48min，B为 60%- 80% ;48 ~56min，B为 80% ;56 ~58min，B为 80%- 5% ;58 ~65min，B为 5%。 当选择UHPLC所用色谱柱时，流速优选0. 1~0. 3ml/min，梯度洗脱条件优选为：0~2min， B为 5%- 8% ;2 ~13min，B为 8%- 30% ;13 ~15min，B为 30%- 60% ;15 ~16min， B为 60%- 80% ;16 ~18min，B为 80% ;18 ~19min，B为 80%- 5% ;19 ~22min，B为
[0013] ⑶MS分析
[0014] 通过HPLC分离的肽类组分，依次进入质谱检测器分析。其优化的质谱条件为：电 喷雾离子源（ESI)，雾化气体和干燥气体为氮气。更进一步确定为采集正离子模式；一级扫 描范围：350-2000Da;-级扫描分辨率：70000 ;二级扫描范围：依赖于一级母离子质荷比自 动选择；二级碰撞能量（NCEs) :28% ;二级扫描分辨率：17500 ;毛细管温度：360°C;离子源 电压：1800V;碎裂模式：HCD。
[0015] ⑷MRM监测
[0016] 根据靶标肽段的质谱信息进行定性分析。通过选择多个特定靶标肽段组分，进一 步优选组成确定分子量在256-2560道尔顿之间的多肽（寡肽）类成分，更进一步优化组成 确定分子量在1000-2000道尔顿之间的多肽（寡肽）类成分，进行选择肽段的母离子与特 定子离子的监测，母离子与特定子离子均应与数据库具有较好的匹配与信号响应则认为鉴 定成功。
[0017] 3、本发明的有益效果
[0018] 采用该方法有利于对疏血通注射液质量控制，更进一步保证产品安全。现行疏血 通注射液质量标准中关于多肽的测定，是基于水解后总氨基酸扣除样品本身游离氨氨基 酸，得多肽类组分的含量，水解阶段需要高温密封，且水解时间很长，通常需要24h，不管是 游离氨基酸还是总氨基酸的测定都需要柱前衍生化，操作繁琐且不稳定，对多肽组分的表 征也不够确定。而用本发明所提供的分析方法，能快速有效地对疏血通注射液中的已知活 性多