一种高效液相色谱法测定玉米油中齐墩果酸、熊果酸含量的方法
【技术领域】
[0001 ] 本发明涉及一种高效液相色谱法测定玉米油中齐墩果酸、熊果酸含量的方法，所属技术领域:二、生物与新医药技术(七)现代农业技术4、农产品精深加工与现代储运:农产品质量安全评价、快速检测、全程质量控制等技术。
【背景技术】
[0002]HPLC是一项高压、高效、高灵敏度的分离技术，可用于分离分析高沸点、相对分子量大、热稳定性差的有机化合物，广泛应用于化学、化工、高分子、生物、食品、医药等领域。
[0003]齐墩果酸、熊果酸主要存在于玉米油及其油脚中，为五环三萜类化合物；性质相近，难以分离；是一种活性成分；有保肝、消炎、抗肿瘤、降血脂、增强免疫和抑制免疫(免疫双向调解作用)等作用。
[0004]目前这2种物质还只能从植物中提取，无法化学合成；检测方法有分光光度法、薄层扫描法和高效液相色谱法，前者通常采用显色剂显色后测定，由于他们性质相近，分光光度法通常测得其三萜类总量，方法缺乏专属性；而普通的薄层色谱很难使OA和UA分离；相比较而言，HPLC较容易实施两者的分离，且紫外检测相对于蒸发光散射检测有较好的重现性。在现有可查范围内，利用HPLC同时测定玉米油中齐墩果酸、熊果酸未见报道，采用反相高效液相色谱法二极管阵列检测器测定了玉米油中的齐墩果酸和熊果酸含量，旨在为评价玉米油的质量提供科学依据。
【发明内容】
[0005]本发明所要解决的技术问题在于提供一种高效液相色谱法测定玉米油中齐墩果酸、熊果酸含量的方法，从而准确测定其含量，方法操作简单、灵敏度高、重现性好。
[0006]为了实现上述目的本发明采用如下技术方案:
[0007]一种高效液相色谱法测定玉米油中齐墩果酸、熊果酸含量的方法，其特征在于包括以下步骤:
[0008](I)对照品溶液的制备精密称取齐墩果酸对照品10.20mg、熊果酸对照品8.54mg，分别置1ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得齐墩果酸、熊果酸对照品贮备液。
[0009](2)样品溶液的处理:取玉米油样品约1.0-2.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加甲醇25ml，密塞，称定重量，60-90°C水浴提取l_4h，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
[0010](3)将滤液过0.40-0.50 μπι微孔滤膜后，在实验色谱条件下进行高效液相色谱法测定，得测定数值；所述的实验色谱条件为:色谱柱:C18柱，250X4.6mm，5ym;流动相:265 %甲醇-35 %水-0.1 %冰乙酸-0.05 %三乙胺，其中，流动相由甲醇265mL、水35mL、冰乙酸0.05mL和三乙胺0.05mL配置；紫外检测器的检测波长:210nm ;流动相流速为0.6mL/min,柱温20°C，进样体积为20 μ L ;
[0011](4)按照外标法计算玉米油中齐墩果酸、熊果酸的含量。
[0012]所述的高效液相色谱法测定玉米油中齐墩果酸、熊果酸含量的方法，其特征在于:所述的实验色谱条件为:色谱柱:Cj±，250X4.6mm，5 μπι;流动相:265%甲醇-35%水-0.1%冰乙酸-0.05%三乙胺，其中，流动相由甲醇265mL、水35mL、冰乙酸0.05mL和三乙胺0.05mL配置；紫外检测器的检测波长:210nm ;流动相流速为0.6mL/min，柱温20°C，进样体积为20 μ L。
[0013]本发明的有益效果:本发明可准确测定玉米油中齐墩果酸、熊果酸的含量，方法操作简单、灵敏度高、重现性好。
【附图说明】
[0014]图1本发明实施例2对照品中齐墩果酸、熊果酸的色谱图，a齐墩果酸、b熊果酸。
[0015]图2本发明实施例2玉米油中齐墩果酸、熊果酸的色谱图，a齐墩果酸、b熊果酸。
【具体实施方式】
[0016]实施例1:高效液相色谱法测定玉米油中齐墩果酸、熊果酸含量的方法，包括以下步骤:
[0017](I)对照品溶液的制备精密称取齐墩果酸对照品10.20mg、熊果酸对照品8.54mg，分别置1ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得齐墩果酸、熊果酸对照品贮备液。
[0018](2)样品溶液的处理:取玉米油样品约0.5-1.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加甲醇25ml，密塞，称定重量，60-90°C水浴提取l_4h，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
[0019](3)将滤液过0.40-0.50 μπι微孔滤膜后，在实验色谱条件下进行高效液相色谱法测定，得测定数值；所述的实验色谱条件为:色谱柱:C18柱，250X4.6mm，5ym;流动相:265 %甲醇-35 %水-0.1 %冰乙酸-0.05 %三乙胺，其中，流动相由甲醇265mL、水35mL、冰乙酸0.05mL和三乙胺0.05mL配置；紫外检测器的检测波长:210nm ;流动相流速为0.6mL/min,柱温20°C，进样体积为20 μ L ;
[0020](4)按照外标法计算玉米油中齐墩果酸、熊果酸的含量。
[0021]所述的实验色谱条件为:色谱柱:C18柱，250X4.6mm，5ym;流动相:265 %甲醇-35 %水-0.1 %冰乙酸-0.05 %三乙胺，其中，流动相由甲醇265mL、水35mL、冰乙酸0.05mL和三乙胺0.05mL配置；紫外检测器的检测波长:210nm ;流动相流速为0.6mL/min，柱温20°C，进样体积为20 μ L。
[0022]实施例2:本发明的具体实验数据:
[0023]I仪器与试剂
[0024]仪器:1100高效液相色谱仪(包括G1311A泵、G1322脱气机、G1313AZ自动进样器、G1313A柱温箱、G1315 DAD ;Agilent 1100 ChemStat1n) ;BP221D 电子天平(Sartorius公司)；KQ-250DB数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；石英亚沸高纯水提取器(江苏金城教学仪器厂)。
[0025]试剂:齐墩果酸、熊果酸对照品(110709-200505、110742-200516，供含量测定用)由中国药品生物制品检定所提供；甲醇为色谱纯，玉米油(岳西县光圣茶油有限公司菊盛牌野生玉米油)其他试剂均为分析纯。
[0026]流动相配制:分别按照265mL甲醇、35mL水、0.05mL冰乙酸和0.05mL三乙胺比例配置流动相。
[0027]齐墩果酸、熊果酸标准溶液:精密称取齐墩果酸对照品10.20mg、熊果酸对照品8.54mg，分别置1ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得齐墩果酸、熊果酸对照品IC备液。
[0028]样品溶液的处理:取玉米油样品约0.5-1.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加甲醇25ml，密塞，称定重量，60-90°C水浴提取l_4h，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得，过0.45 μ m微孔滤膜后，在实验设定条件下进行HPLC测定。
[0029]2含量测定方法的建立
[0030]2.1波长选择
[0031]齐墩果酸与熊果酸在206nm处有最大吸收，本实验采用DAD检测器，对同一玉米油供试液在205、210、215和220nm处进行多波长同时检测，结果显示除205nm有溶剂干扰和末端吸收外，其它波长处分离均较为理想，但215nm和220nm均较210nm波长处响应强度低，检测灵敏度低，故本实验采用210nm为检测波长。
[0032]2.2流动相的选择
[0033]对甲醇-水、甲醇-水-磷酸、甲醇-水-冰乙酸、甲醇-乙腈-水、甲醇-水-冰乙酸-三乙胺等多个流动相系统进行考察，通过配比调整，发现甲醇-水-冰乙酸-三乙胺(265: 35: 0.1: 0.05)在确定的色谱系统中容易获得满意且稳定的分离结果；流速减慢利于分离，本实验流速为0.6ml/min。2.3定性试验
[0034]利用相对保留时间法及添加标准物质法定性。对照标准溶液、加标样品溶液和样品溶液在相同的色谱条件下的色谱图和相对保留时间。实验结果表明，三种溶液中齐墩果酸、熊果酸的出峰时间是一致的。
[0035]2.4标准曲线和相关系数
[0036]精密量取齐墩果酸对照品贮备液0.04ml、0.22ml、0.42ml、0.62ml、0.82ml，熊果酸对照品贮备液0.05ml,0.28ml,0.52ml,0.80ml,1.00ml，分别置5个1ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得齐墩果酸和熊果酸混合对照品溶液系列。分别精密吸取各混合对照品溶液20 μ 1，注入液相色谱仪，依照上述的色谱条件测定。以色谱峰面积(y)为纵坐标，对照品浓度(x，mg/ml)为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程为齐墩果酸:y = 16782.3x+2.17 (r=0.9998);熊果酸:y = 15682.0x+11.58 (r = 0.9994)。由表可见，齐墩果酸进样量在
0.162?3.31 μ g，熊果酸进样量在0.195?3.91 μ g之间呈现良好的线性关系。
[0037]2.5对照品、样品的测定及重复性试验
[0038]取上述经处理的对照品溶液及样品溶液，依照上述的色谱条件，将样品打入高效液相色谱仪中，其色谱图见附图1、2。
[0039]进样6次后，根据色谱图，记录实验数据，其进样结果:玉米油中齐墩果酸、熊果酸的平均含量分别为:0.139%,0.198% ;RSD分别为1.05%，1.23%。
[0040]2.6稳定性试验
[0041]取同一玉米油样品依照上述处理方法，制取样品溶液，分别在0，4，8，12，24h进样测定，峰面积的RSD为1.05%，结果表明样品溶液中齐墩果酸、熊果酸在24H内含量稳定。
[0042]实验结果表明:本发明对测定齐墩果酸、熊果酸准确可靠，重现性好，可用于玉米油中齐墩果酸、熊果酸含量的测定。
【主权项】
1.一种高效液相色谱法测定玉米油中齐墩果酸、熊果酸含量的方法，其特征在于包括以下步骤: (1)对照品溶液的制备精密称取齐墩果酸对照品10.20mg、熊果酸对照品8.54mg，分别置1ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得齐墩果酸、熊果酸对照品贮备液。 (2)样品溶液的处理:取玉米油样品约1.0-2.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加甲醇25ml，密塞，称定重量，60-90°C水浴提取l_4h，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得； (3)将滤液过0.40-0.50 μ m微孔滤膜后，在实验色谱条件下进行高效液相色谱法测定，得测定数值；所述的实验色谱条件为:色谱柱:(:18柱，250父4.6mm，5 ym ;流动相:265%甲醇-35 %水-0.1 %冰乙酸-0.05 %三乙胺，其中，流动相由甲醇265mL、水35mL、冰乙酸0.05mL和三乙胺0.05mL配置；紫外检测器的检测波长:210nm ;流动相流速为0.6mL/min，柱温20 °C，进样体积为20 μ L ; (4)按照外标法计算玉米油中齐墩果酸、熊果酸的含量。
【专利摘要】本发明公开了一种玉米油中齐墩果酸和熊果酸的含量测定方法，其主要是通过采用反相高效液相色谱法，其色谱条件为：a.色谱柱：C18柱，250×4.6mm，5μm；b.流动相组成：265％甲醇-35％水-0.1％冰乙酸-0.05％三乙胺，其中，流动相由甲醇265mL、水35mL、冰乙酸0.05mL和三乙胺0.05mL配置；c.所用紫外检测器的检测波长：210nm；d.流速：0.6mL/min，进样体积：20μL，柱温：20℃；样品溶液的处理：取玉米油样品约1.0-2.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加甲醇25ml，密塞，称定重量，60-90℃水浴提取1-4h，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。为有效控制其质量，本发明方法灵敏、高效、准确、稳定，可有效控制玉米油中齐墩果酸和熊果酸的含量。
【IPC分类】G01N30/06, G01N30/88
【公开号】CN104897830
【申请号】CN201510189068
【发明人】查孝柱
【申请人】查孝柱
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年4月6日