专利名称：一种疏血通冻干粉针制剂及其制备方法
技术领域：
本发明属于中药制药技术领域，具体涉及一种疏血通冻干粉针制剂及其制备方法。
背景技术：
地龙为钜蚓科动物参环毛蚓、通俗环毛蚓、威廉毛蚓或拮盲环毛蚓的全身，具有清热定惊、通络、平喘、利尿的作用，用于高热神昏、惊痫、关节痹痛、肢体麻木、半身不遂、肺热喘咳、尿少水肿、高血压病，已有数千年的使用历史，1983年Mihara等首次发现蚯蚓水提物有直接溶解纤维蛋白及激活纤溶酶原的作用，并命名为“蚓激酶”，健康人应用本品后，纤维蛋白平板法测得外周血优球蛋白的纤溶活性明显增高，优球蛋白溶解时间明显缩短，认为该提取物是新型溶栓剂，地龙富含蚓激酶，蚓激酶为具有激酶和纤溶酶双重功能的丝氨酸蛋白酶，富含酸性氨基酸，等电点3-5，相对分子质量为2.0×104-4.0×104，纤溶活性强，药理作用广泛，口服有效，不良反应轻；水蛭是我国传统中药，1800年前《神农本草经》中就有记载。中医认为它有破血、逐瘀、通经的疗效，主要用于治疗瘕症、痞块、血瘀、闭经和跌打损伤，西方也常用水蛭吸血以治疗某些疾病。从水蛭及其唾液腺中已提取出多种活性成分，水蛭素是其中活性最显著并且研究得最多的一种成分，它是由65-66个氨基酸组成的小分子蛋白质(多肽)，水蛭素对凝血酶有极强的抑制作用，是迄今为止所发现最强的凝血酶天然特异抑制剂，动物试验与临床研究表明，水蛭素能高效抗凝血、抗血栓形成，以及阻止凝血酶催化的凝血因子活化和血小板反应等进一步血瘀现象，此外，它还能抑制凝血酶诱导的成纤维细胞的增殖和凝血酶对内皮细胞的刺激。与肝素相比，它不仅用量少，不会引起出血，也不依赖于内源性辅助因子，而肝素则有引起出血的危险，在弥漫性血管内凝血的发病过程中抗凝血酶III往往减少，这将限制肝素的疗效，采用水蛭会有较好的效果，水蛭素是一类很有前途的抗凝化瘀药物，它可用于治疗各种血栓疾病尤其是静脉血栓和弥漫性血管凝血的治疗；也可用于外科手术后预防动脉血栓的形成，预防溶解血栓后或血管再造后血栓的形成，改善体外血液循环和血液透析过程，水蛭素比较稳定，胰蛋白酶和糜蛋白酶并不破坏其活性，而且水蛭素的某些水解片段仍有抑制凝血酶的作用；凝血酶是导致血栓的主要因素之一，而血栓的形成是导致心脑血管疾病的主要原因。心脑血管疾病是目前危害人类生命和健康的主要疾病之一，据世界卫生组织(WHO)统计，全世界每年大约有1700万人死于心脑血管病，即全球每3个死亡者中就有1个死于心脑血管疾病。预计到2020年，因心脑血管疾病死亡的的人数将比该数字增加50％，高达2500万人。我国60岁以上人口已超过一亿，这个年龄层次发病率每年在5％以上，即我国每年有500万人以上需用抗凝药物来防治和治疗心脑血管疾病，并且这类疾病已经向年轻化发展。若按1％人数计算，发病率的基数会更大。
专利“治疗心脑血管疾病的注射制剂的制造方法及其产品”(申请号03148281.3)公开了应用水蛭、地龙制备注射制剂的工艺方法，该专利在分离纯化过程中应用105-136℃热压10-45分钟，在此剧烈条件下，水蛭素、蚓激酶将全部失去活性。
发明内容
基于上述原因，本发明采用水为溶剂提取水蛭素、蚓激酶，采用超滤法、阴离子交换和阳离子交换柱层析法进行除杂，再用反渗透膜技术除去提取过程产生的盐类物质，使水蛭素、蚓激酶的纯度大大提高，加入我们在实验过程中发现的酶保护剂酪氨酸，延长了水蛭素、蚓激酶保持活性的时间，制备成冻干粉针剂，具有更好的药理作用。
酪氨酸是一种基本氨基酸，我们在研究疏血通冻干粉针剂的过程中，加入酪氨酸，对该制剂中的水蛭素、蚓激酶的活性有保护作用，大大延长其活性的保持时间。
本发明提供了一种地龙、水蛭制成的冻干粉针剂，其中水蛭素、蚓激酶在活性成分中的含量不小于90％。
本发明还提供了上述药物的一种制备方法。
一.工艺制法(1)本发明原料药重量配比为水蛭6-7.5重量份，地龙2.5-4重量份；(2)取鲜水蛭、地龙，加入注射用水，洗去杂质，用电动绞肉机破碎，再用超声波低温破碎；将匀浆分装于有盖容器中，于-30℃冰柜冻结24小时，再用流水解冻，再次冻结，反复冻、融5次，最后一次解冻后，用冷冻离心机离心沉淀，吸取上清液备用；(3)将上清液用截留分子量为50000-100000的中空纤维柱进行超滤，超滤至原溶液体积的1/3-1/2时，加水至原体积，反复操作3-5次，合并透过液，20℃时浓缩至相对密度为1.05-1.10的溶液；(4)将浓缩的过滤液用缓冲液调PH值为6.0-7.0，离子强度为0.01mol/l通过阳离子交换柱，用缓冲液洗4-6倍的柱体积洗脱，收集洗脱液，再用缓冲液调PH值为6.0-7.0通过阴离子交换柱，分别用PH值为6.0-7.0的缓冲液洗3倍柱体积，洗脱液弃去，最后用PH值为6.0-7.0的缓冲液加入0.2-0.5mol/l的氯化钠进行洗脱，收集洗脱液，洗脱至紫外检测器检测不到吸收为止；(5)洗脱液浓缩脱盐，得到半成品；(6)将半成品加入酶保护剂酪氨酸和药用辅料，用注射用水调整浓度后，分装到西林瓶中，进行冷冻干燥，轧盖，检测，得到冻干粉针剂。
其中，步骤(3)中透过液的浓缩，是采用反渗透膜法浓缩。
步骤(4)中缓冲液为磷酸盐缓冲液和三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液(Tris-HCL)的一种；阳离子交换柱为选自CM-交联葡聚糖、CM-琼脂糖、CM-纤维素、SP-交联葡聚糖、SP-琼脂糖、SP-纤维素中的一种；阴离子交换柱为选自DEAE-交联葡聚糖、DEAE-琼脂糖、DEAE-纤维素、Q-交联葡聚糖、Q-琼脂糖、Q-纤维素中的一种。
二.检测分析采用高效液相色谱法对水蛭素、蚓激酶(以黄嘌呤计)进行检测。
1.实验仪器waters600E型高效液相色谱仪，996PDA检测器，色谱柱日本TOSOHTSK2000SW 7.5*3002.实验药物本发明冻干粉针剂(广东天之骄药物开发有限公司实验室提供)2.色谱条件工作站millennium chromatogvaph流动相0.01mol/L、PH值7.2的磷酸缓冲溶液(配制方法按照中国生物制品主要原辅材料质控标准2000年版，中国生物制品标准委员会编，化学工业出版社，P13-14配置) 。
3.样品制备取本发明动干粉针剂，加入注射用水溶解完全，用多肽纯化离心管，进行离心分离，取离心液体即为样品。
4.上样取上述处理的样品用微量注射器吸取定量液体，注入进样器进行检测。
5.结果经过计算水蛭素、蚓激酶的占活性成分的含量为91.3％。
三.本发明冻干粉针剂比活的检测1.实验原理天然水蛭素、蚓激酶的活性检测国家尚未公布标准的检测方法，根据凝血酶活性的检测方法(中国生物制品规程2000年版附录1)，依据水蛭素、蚓激酶与凝血酶是成比例结合，消耗一个凝血酶单位相等于一个抗凝血单位(ATU)的原则，采用试管法(连续稀释法)检测水蛭素、蚓激酶的抗凝血单位的效价。
2.实验材料5g/L纤维蛋白原的生理盐水溶液，注射用生理盐水(广东天之骄药物开发有限公司实验室实验室提供)冷冻干燥凝血酶(安徽桑原生物技术研究所购买，每瓶含量为500IU，用时用生理盐水稀释至每毫升含凝血酶0.5IU)3.待测样品本专利冻干粉针剂(广东天之骄药物开发有限公司实验室提供)4.检测方法取10×80mm试管8支，在每支试管中加入生理盐水0.2ml(第一管不加)，于第一管中加入待测样品0.2ml；第二管中加入0.2ml，充分混匀后吸取0.2ml加入第三管，以次例推，直至加到第7管，将多余的0.2ml混合液废弃，此时各试管都为0.2ml，但浓度依次为1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64，第8管因不含水蛭素、蚓激酶，作为试验对照，加样结束后，放到37℃水浴使样品与凝血酶作用5-10min，再于各试管中加入5g/l纤维蛋白原溶液0.2ml，再放入37℃水浴，观察记录1-24小时结果，并进行计算。计算方法为发生凝固或沉淀的试管为无抗凝血酶活性(阴性)，不凝固或无沉淀产生的试管为具有抗凝血酶活性。
5.比活性计算采用中国生物制品规程(一部)微量法，用BCATM Protein Assay测定分离组分的蛋白质含量，根据抗凝血酶活性测定结果计算每毫克蛋白质的抗凝血酶比活性。根据实验发现，天然水蛭素、蚓激酶体外测定结果与体内测定结果有正相关性。
6.实验结果本发明冻干粉针剂的比活为203.1IU/mg.
四.不同制剂活性保持时间比较实验药物本发明冻干粉针剂为实验组1、采用本发明提取纯化工艺进行制备的半成品不加入酪氨酸制备的冻干粉针剂为实验组2(广东天之骄药物开发有限公司实验室提供)实验方法将不同制剂放置在相同条件下0个月、3个月、6个月、12个月、18个月、24个月，按照上述实验三的方法进行比活检测，检测结果见表1.
表1 不同制剂的比活比较24个月的0个月的比活 3个月的比活 6个月的比活 12个月的比活 18个月的比活组别 比活(IU/mg) (IU/mg) (IU/mg) (IU/mg)(IU/mg)(IU/mg)实验组1203.1202.0 198.7190.4 185.6 179.9实验组2203.2185.3 161.9130.2 112.7 107.3结论本发明冻干粉针剂在24个月时保持80％的活性，而不加入酪氨酸的冻干粉针剂在24个月时只剩50％左右的活性，充分说明本发明工艺中加入酶保护剂酪氨酸的重要意义。
五.毒理实验研究1.急性毒性实验实验动物健康小鼠18-22g，，雌雄各半。
实验药物本发明冻干粉针剂(广东天之骄药物开发有限公司实验室提供)实验方法按照人体给药的500倍、1000倍、1500倍、2000倍、2500倍、3000倍、4000倍的给药量尾静脉给小鼠，阴性对照组给予对应剂量的生理盐水，动物自由摄水饮食观察动物的生命活动及死亡情况，给药后10d将存活的小鼠宰杀，取其全血测定其外周血的各项指标的变化，采用改良寇氏法(第四军医大学学报，2002年第7期，667-669)求LD50。
实验结果本发明冻干粉针剂的LD50为117.9g/kg，为临床用药量的2947倍，表明本发明冻干粉针剂的毒性较低，临床用药属于安全。
2.长期毒性实验实验动物健康大鼠300-400克，，雌雄各半。
实验药物本发明冻干粉针剂(广东天之骄药物开发有限公司实验室提供)实验方法将本发明冻干粉针剂按照人体给药10倍、63倍、375倍的三个剂量给大鼠尾静脉注射，空白组给予对应剂量的生理盐水，连续30天，检测各项指标。
实验结果各给药组的一般行为表现、摄食量、体重增长率、血液学、血清生化检查、脏器系数、组织病理学检查等指标，与空白对照组比较，均无明显差异，说明本发明冻干粉针剂在临床应用量10-375倍剂量范围内，对大鼠无明显毒副作用。
六.药理实施例实施例1抑制血小板聚集的实验实验动物SD大鼠，体重200～250g，雌雄各半。
实验药物疏血通注射液(牡丹江友搏药业有限责任公司)本发明冻干粉针剂(广东天之骄药物开发有限公司实验室提供)生理盐水实验方法取大鼠，分为本发明冻干粉针剂组、疏血通注射液组、生理盐水组，给药剂量40mg/kg，生理盐水等容不等量2次/日，次日给药1次后用1％戊巴比妥钠(剂量0 5ml/100g)腹腔注射麻醉。按文献(朱益栋主编弥散性血管内凝血北京人民卫生出版社，1982；279 293)的方法复制大鼠高凝血症模型。复制模型后即刻从颈动脉取血3ml，38％枸橼酸钠抗凝(1∶10)，制成富血小板血浆(PRP)和贫血小板血浆(PPP)，计算血小板凝集率，血小板聚集率用SPA-4型血小板聚集仪测定，促聚剂用二磷酸腺苷，(ADP)，浓度10μmol/L。测定指标有一分钟聚集率(A1，)、最大聚集率(Amax)和最大聚集时间(Tmax)。见表2表2不同制剂血小板凝集率的比较动物数 A1AmaxTmax组别(只) (％) (％)(s)生理盐水组 10 28±726±964±29疏血通注射液组 10 13±10*15±10*60±28本发明冻干粉针剂组 10 8±3**7±4**55±21注与生理盐水组比较**P＜0.01，*P＜0.05实施例2利用血栓法测定对大白鼠血栓形成的影响。
实验药物生理盐水(空白组)疏血通注射液(牡丹江友搏药业有限责任公司)本发明冻干粉针剂(广东天之骄药物开发有限公司实验室提供)实验动物体重300-400克的大白鼠30只，雌雄不分。分成三组，每组10只。
实验方法将大鼠给药，给药剂量40mg/kg，生理盐水等容不等量，给药后将大白鼠麻醉(戊巴比妥钠30-40mg/kg，ip)，仰卧位固定，分离气管，插入一塑料套管，并分离右颈总动脉及左颈外静脉，在聚乙烯管的中段放入一根长6厘米的丝线，以肝素生理盐水溶液，充满聚乙烯管，当聚乙烯管的一端插入左颈外静脉后，由聚乙烯管准确的注入肝素抗凝，然后再将聚乙烯管的另一端插入右颈总动脉，打开动脉夹，血液从右颈总动脉流至聚乙烯管，返回左颈外静脉，开放血流15分钟后断血流，迅速取出丝线称重，总重量减去丝线重量即得血栓重量。将空白组和另外两组给药组的动物血栓湿重进行记录，进行计算，如表3所示
表3各给药组的血栓重量动物数血栓湿重组别(只)(mg)生理盐水组10 35.12±0.91疏血通注射液组10 24.38±0.77*本发明冻干粉针剂组10 11.16±0.09**注与生理盐水组比较**P＜0.01，*P＜0.05实施例3对小鼠ADP诱导的血栓性死亡的影响实验药物生理盐水(空白组)疏血通注射液(牡丹江友搏药业有限责任公司)本发明冻干粉针剂(广东天之骄药物开发有限公司实验室提供)实验方法取健康小鼠60只，雌雄各半，随机分成3组生理盐水组、本发明冻干粉针剂组、市售疏血通注射液组每日尾静脉给药，给药量57mg/kg，连续7d，于末次给药后1h尾静脉注射ADP48.0mL/kg，记录动物死亡情况。见表4表4各组制剂对小鼠ADP诱导的血栓性死亡的影响比较组别总数/只 死亡数/只死亡率生理盐水组 2020100％疏血通注射液组 201470.0％本发明冻干粉针剂组 208 40.0％实施例4利用在体心肌梗死法测定本发明冻干粉针剂和对大白鼠心肌梗死情况的影响。
实验药物疏血通注射液(牡丹江友搏药业有限责任公司)本发明冻干粉针剂(广东天之骄药物开发有限公司实验室提供2.实验动物雄性大鼠250-300克20只，分成两组。
3.实验方法取雄性大鼠20只，乌拉坦0.65g/kg腹腔浅麻醉后，背位固定，用大半个橡皮球连接到人工呼吸机，进行人工呼吸，大鼠胸部去毛、消毒，沿左锁骨中线切开皮肤约2厘米，在第四或第五肋间钝性分离基层，打开胸腔，剪开心包，轻压右侧胸廓，挤出心脏，在动脉圆锥与左心耳之间冠状静脉处节扎左冠脉后，把心脏放回胸腔，迅速缝合胸腔，停止人工呼吸，分别用两种制剂对10只大鼠进行实验，得到数据计算如表5所示表5两组制剂的药理学比较组别 显效率有效率无效率总有效率疏血通注射液18.3％ 54.0％27.7％72.3％本发明冻干粉针剂34.1％ 58.2％7.7％ 92.3％结论从实验我们可以得知，本发明冻干粉针剂与疏血通注射液相比较具有更好的药理作用。
四.制备实施例实施例1(1)本发明原料药重量配比为水蛭6000克，地龙4000克；(2)取鲜水蛭、地龙，加入注射用水，洗去杂质，用电动绞肉机破碎，再用超声波低温破碎；将匀浆分装于有盖容器中，于-30℃冰柜冻结24小时，再用流水解冻，再次冻结，反复冻、融5次，最后一次解冻后，用冷冻离心机离心沉淀，吸取上清液备用；(3)将上清液用截留分子量为50000的中空纤维柱进行超滤，超滤至原溶液体积的1/3时，加水至原体积，反复操作3次，合并透过液，20℃时浓缩至相对密度为1.05的溶液；
(4)将浓缩的过滤液用磷酸盐缓冲液调PH值为6.0，离子强度为0.01mol/l通过CM-交联葡聚糖阳离子交换柱，用缓冲液洗4倍的柱体积洗脱，收集洗脱液，再用缓冲液调PH值为6.0通过DEAE-交联葡聚糖阴离子交换柱，分别用PH值为6.0的缓冲液洗3倍柱体积，洗脱液弃去，最后用PH值为6.0的缓冲液加入0.2mol/l的氯化钠进行洗脱，收集洗脱液，洗脱至紫外检测器检测不到吸收为止；(5)洗脱液反渗透膜法浓缩脱盐，得到半成品9.6克；(6)将半成品9.6克加入酶保护剂酪氨酸10克和药用辅料甘露醇30.4克，用注射用水溶解完全后，分装到西林瓶中，进行冷冻干燥，轧盖，检测，得到冻干粉针剂1000瓶。
实施例2(1)本发明原料药重量配比为水蛭7500克，地龙2500克；(2)取鲜水蛭、地龙，加入注射用水，洗去杂质，用电动绞肉机破碎，再用超声波低温破碎；将匀浆分装于有盖容器中，于-30℃冰柜冻结24小时，再用流水解冻，再次冻结，反复冻、融5次，最后一次解冻后，用冷冻离心机离心沉淀，吸取上清液备用；(3)将上清液用截留分子量为100000的中空纤维柱进行超滤，超滤至原溶液体积的1/2时，加水至原体积，反复操作5次，合并透过液，20℃时浓缩至相对密度为1.10的溶液；(4)将浓缩的过滤液用三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液(Tris-HCL)缓冲液调PH值为7.0，离子强度为0.01mol/l通过CM-琼脂糖阳离子交换柱，用缓冲液洗6倍的柱体积洗脱，收集洗脱液，再用缓冲液调PH值为7.0通过DEAE-琼脂糖阴离子交换柱，分别用PH值为7.0的缓冲液洗3倍柱体积，洗脱液弃去，最后用PH值为7.0的缓冲液加入0.5mol/l的氯化钠进行洗脱，收集洗脱液，洗脱至紫外检测器检测不到吸收为止；(5)洗脱液反渗透膜法浓缩脱盐，得到半成品9.2克；(6)将半成品9.2克加入酶保护剂酪氨酸9克和药用辅料蔗糖31.8克，用注射用水调整浓度后，分装到西林瓶中，进行冷冻干燥，轧盖，检测，得到冻干粉针剂1000瓶。
实施例3(1)本发明原料药重量配比为水蛭6500克，地龙3500克；(2)取鲜水蛭、地龙，加入注射用水，洗去杂质，用电动绞肉机破碎，再用超声波低温破碎；将匀浆分装于有盖容器中，于-30℃冰柜冻结24小时，再用流水解冻，再次冻结，反复冻、融5次，最后一次解冻后，用冷冻离心机离心沉淀，吸取上清液备用；(3)将上清液用截留分子量为80000的中空纤维柱进行超滤，超滤至原溶液体积的1/3时，加水至原体积，反复操作4次，合并透过液，20℃时浓缩至相对密度为1.08的溶液；(4)将浓缩的过滤液用磷酸盐缓冲液调PH值为6.5，离子强度为0.01mol/l通过CM-纤维素阳离子交换柱，用缓冲液洗5倍的柱体积洗脱，收集洗脱液，再用缓冲液调PH值为6.5通过DEAE-纤维素阴离子交换柱，分别用PH值为6.5的缓冲液洗3倍柱体积，洗脱液弃去，最后用PH值为6.5的缓冲液加入0.3mol/l的氯化钠进行洗脱，收集洗脱液，洗脱至紫外检测器检测不到吸收为止；(5)洗脱液反渗透膜法浓缩脱盐，得到半成品9.4克；
(6)将半成品9.4克加入酶保护剂酪氨酸9.5克和药用辅料乳糖31.1克，用注射用水调整浓度后，分装到西林瓶中，进行冷冻干燥，轧盖，检测，得到冻干粉针剂1000瓶。
实施例4(1)本发明原料药重量配比为水蛭7000克，地龙3000克；(2)取鲜水蛭、地龙，加入注射用水，洗去杂质，用电动绞肉机破碎，再用超声波低温破碎；将匀浆分装于有盖容器中，于-30℃冰柜冻结24小时，再用流水解冻，再次冻结，反复冻、融5次，最后一次解冻后，用冷冻离心机离心沉淀，吸取上清液备用；(3)将上清液用截留分子量为50000的中空纤维柱进行超滤，超滤至原溶液体积的1/3时，加水至原体积，反复操作5次，合并透过液，20℃时浓缩至相对密度为1.09的溶液；(4)将浓缩的过滤液用三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液(Tris-HCL)缓冲液调PH值为6.3，离子强度为0.01mol/l通过SP-交联葡聚糖阳离子交换柱，用缓冲液洗4倍的柱体积洗脱，收集洗脱液，再用缓冲液调PH值为6.3通过Q-交联葡聚糖阴离子交换柱，分别用PH值为6.3的缓冲液洗3倍柱体积，洗脱液弃去，最后用PH值为6.3的缓冲液加入0.35mol/l的氯化钠进行洗脱，收集洗脱液，洗脱至紫外检测器检测不到吸收为止；(5)洗脱液浓缩脱盐，得到半成品9.2克；(6)将半成品9.2克加入酶保护剂酪氨酸9.2克和药用辅料甘露醇、蔗糖31.6克，用注射用水调整浓度后，分装到西林瓶中，进行冷冻干燥，轧盖，检测，得到冻干粉针剂1000瓶。
实施例5(1)本发明原料药重量配比为水蛭7200克，地龙2800克；(2)取鲜水蛭、地龙，加入注射用水，洗去杂质，用电动绞肉机破碎，再用超声波低温破碎；将匀浆分装于有盖容器中，于-30℃冰柜冻结24小时，再用流水解冻，再次冻结，反复冻、融5次，最后一次解冻后，用冷冻离心机离心沉淀，吸取上清液备用；(3)将上清液用截留分子量为100000的中空纤维柱进行超滤，超滤至原溶液体积的1/3时，加水至原体积，反复操作3次，合并透过液，20℃时浓缩至相对密度为1.07的溶液；(4)将浓缩的过磷酸盐滤液用缓冲液调PH值为6.8，离子强度为0.01mol/l通过SP-琼脂糖阳离子交换柱，用缓冲液洗4倍的柱体积洗脱，收集洗脱液，再用缓冲液调PH值为6.8通过Q-琼脂糖阴离子交换柱，分别用PH值为6.8的缓冲液洗3倍柱体积，洗脱液弃去，最后用PH值为6.8的缓冲液加入0.40mol/l的氯化钠进行洗脱，收集洗脱液，洗脱至紫外检测器检测不到吸收为止；(5)洗脱液反渗透膜法浓缩脱盐，得到半成品9.2克；(6)将半成品9.2克加入酶保护剂酪氨酸10克和药用辅料蔗糖、乳糖30.8克，用注射用水调整浓度后，分装到西林瓶中，进行冷冻干燥，轧盖，检测，得到冻干粉针剂1000瓶。
实施例6(1)本发明原料药重量配比为水蛭6800克，地龙3200克；(2)取鲜水蛭、地龙，加入注射用水，洗去杂质，用电动绞肉机破碎，再用超声波低温破碎；将匀浆分装于有盖容器中，于-30℃冰柜冻结24小时，再用流水解冻，再次冻结，反复冻、融5次，最后一次解冻后，用冷冻离心机离心沉淀，吸取上清液备用；(3)将上清液用截留分子量为80000的中空纤维柱进行超滤，超滤至原溶液体积的1/2时，加水至原体积，反复操作4次，合并透过液，20℃时浓缩至相对密度为1.06的溶液；(4)将浓缩的过滤液用三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液(Tris-HCL)缓冲液调PH值为6.2，离子强度为0.01mol/l通过SP-纤维素阳离子交换柱，用缓冲液洗5倍的柱体积洗脱，收集洗脱液，再用缓冲液调PH值为6.2通过Q-纤维素阴离子交换柱，分别用PH值为6.2的缓冲液洗3倍柱体积，洗脱液弃去，最后用PH值为6.2的缓冲液加入0.45mol/l的氯化钠进行洗脱，收集洗脱液，洗脱至紫外检测器检测不到吸收为止；(5)洗脱液反渗透膜法浓缩脱盐，得到半成品9.3克；(6)将半成品9.3克加入酶保护剂酪氨酸9.5克和药用辅料甘露醇、乳糖31.2克，用注射用水调整浓度后，分装到西林瓶中，进行冷冻干燥，轧盖，检测，得到冻干粉针剂1000瓶。
实施例7(1)本发明原料药重量配比为水蛭6200克，地龙2800克；(2)取鲜水蛭、地龙，加入注射用水，洗去杂质，用电动绞肉机破碎，再用超声波低温破碎；将匀浆分装于有盖容器中，于-30℃冰柜冻结24小时，再用流水解冻，再次冻结，反复冻、融5次，最后一次解冻后，用冷冻离心机离心沉淀，吸取上清液备用；
(3)将上清液用截留分子量为50000的中空纤维柱进行超滤，超滤至原溶液体积的1/2时，加水至原体积，反复操作5次，合并透过液，20℃时浓缩至相对密度为1.09的溶液；(4)将浓缩的过滤液用磷酸盐缓冲液调PH值为6.4，离子强度为0.01mol/l通过CM-交联葡聚糖阳离子交换柱，用缓冲液洗6倍的柱体积洗脱，收集洗脱液，再用缓冲液调PH值为6.4通过Q-纤维素阴离子交换柱，分别用PH值为6.4的缓冲液洗3倍柱体积，洗脱液弃去，最后用PH值为6.4的缓冲液加入0.25mol/l的氯化钠进行洗脱，收集洗脱液，洗脱至紫外检测器检测不到吸收为止；(5)洗脱液浓缩脱盐，得到半成品9.5克；(6)将半成品9.5克加入酶保护剂酪氨酸10克和药用辅料甘露醇、蔗糖、乳糖30.5克，用注射用水调整浓度后，分装到西林瓶中，进行冷冻干燥，轧盖，检测，得到冻干粉针剂1000瓶。
实施例8(1)本发明原料药重量配比为水蛭70公斤，地龙30公斤；(2)取鲜水蛭、地龙，加入注射用水，洗去杂质，用电动绞肉机破碎，再用超声波低温破碎；将匀浆分装于有盖容器中，于-30℃冰柜冻结24小时，再用流水解冻，再次冻结，反复冻、融5次，最后一次解冻后，用冷冻离心机离心沉淀，吸取上清液备用；(3)将上清液用截留分子量为80000的中空纤维柱进行超滤，超滤至原溶液体积的1/3时，加水至原体积，反复操作3次，合并透过液，20℃时浓缩至相对密度为1.09的溶液；
(4)将浓缩的过滤液用三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液(Tris-HCL)缓冲液调PH值为6.9，离子强度为0.01mol/l通过SP-纤维素阳离子交换柱，用缓冲液洗4倍的柱体积洗脱，收集洗脱液，再用缓冲液调PH值为6.9通过DEAE-交联葡聚糖阴离子交换柱，分别用PH值为6.9的缓冲液洗3倍柱体积，洗脱液弃去，最后用PH值为6.9的缓冲液加入0.4mol/l的氯化钠进行洗脱，收集洗脱液，洗脱至紫外检测器检测不到吸收为止；(5)洗脱液反渗透膜法浓缩脱盐，得到半成品92.3克；(6)将半成品92.3克加入酶保护剂酪氨酸95克和药用辅料甘露醇312.7克，用注射用水调整浓度后，分装到西林瓶中，进行冷冻干燥，轧盖，检测，得到冻干粉针剂10000瓶。
注本发明鲜地龙放入清水中饥饿数天，使地龙吐出体内杂质再进行提取分离。
权利要求
1.一种疏血通冻干粉针剂，其特征在于其中水蛭素、蚓激酶占活性成分的含量不小于90％。
2.一种根据权利要求1所述的疏血通冻干粉针剂的制备方法，其特征在于是从鲜水蛭中提取水蛭素，从鲜蚯蚓中提取蚓激酶，纯化后加入酶保护剂酪氨酸和药用辅料制备成冻干粉针剂。
3.根据权利要求2所述的疏血通冻干粉针剂的制备方法，其特征包括以下步骤(1)原料药重量配比为水蛭6-7.5重量份，地龙2.5-4重量份；(2)取鲜水蛭、地龙，加入注射用水，洗去杂质，用电动绞肉机破碎，再用超声波低温破碎；将匀浆分装于有盖容器中，于-30℃冰柜冻结24小时，再用流水解冻，再次冻结，反复冻、融5次，最后一次解冻后，用冷冻离心机离心沉淀，吸取上清液备用；(3)将上清液用截留分子量为50000-100000的中空纤维柱进行超滤，超滤至原溶液体积的1/3-1/2时，加水至原体积，反复操作3-5次，合并透过液，20℃时浓缩至相对密度为1.05-1.10的溶液；(4)将浓缩的过滤液用缓冲液调PH值为6.0-7.0，离子强度为0.01mol/l通过阳离子交换柱，用缓冲液洗4-6倍的柱体积洗脱，收集洗脱液，再用缓冲液调PH值为6.0-7.0通过阴离子交换柱，分别用PH值为6.0-7.0的缓冲液洗3倍柱体积，洗脱液弃去，最后用PH值为6.0-7.0的缓冲液加入0.2-0.5mol/l的氯化钠进行洗脱，收集洗脱液，洗脱至紫外检测器检测不到吸收为止；(5)洗脱液浓缩脱盐，得到半成品；(6)将半成品加入酶保护剂酪氨酸和药用辅料，用注射用水调整浓度后，分装到西林瓶中，进行冷冻干燥，轧盖，检测，得到冻干粉针剂。
4.根据权利要求3所述制备方法，其中步骤(4)缓冲液为磷酸盐缓冲液和三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液(Tris-HCL)的一种。
5.根据权利要求3所述制备方法，其中步骤(4)阳离子交换柱是CM-交联葡聚糖、CM-琼脂糖、CM-纤维素、SP-交联葡聚糖、SP-琼脂糖、SP-纤维素中的一种。
6.根据权利要求3所述制备方法，其中步骤(4)阴离子交换柱是DEAE-交联葡聚糖、DEAE-琼脂糖、DEAE-纤维素、Q-交联葡聚糖、Q-琼脂糖、Q-纤维素中的一种。
7.根据权利要求3所述制备方法，其中步骤(3)透过液的浓缩，是采用反渗透膜法浓缩。
全文摘要
本发明公开了一种疏血通冻干粉针制剂及其制备方法，其特征在于从鲜水蛭提取水蛭素，从鲜蚯蚓中提取蚓激酶，纯化后加药用辅料，制备成冻干粉针制剂；其特征还在于本制备方法采用超滤、离子交换柱层析、反渗透浓缩有机结合的方法纯化，得到纯度较高的水蛭素、蚓激酶，加入酶保护剂酪氨酸和药用辅料制备成冻干粉针剂，药理实验结果表明，本发明冻干粉针剂具有更好的药理作用。
文档编号A61K9/19GK1651079SQ200410101538
公开日2005年8月10日 申请日期2004年12月23日 优先权日2004年12月23日
发明者吴梅春 申请人:吴梅春